Summary
Ett optiskt system har utvecklats för att visualisera hepatisk mikrocirkulationen med FITC-märkta erytrocyter och att mäta det partiella trycket av syre i mikrokärl med laser-assisterad phosphorimetry. Denna metod kan användas för att undersöka fysiologiska och patologiska mekanismer genom analys mikrovaskulär struktur, diameter, blodflödeshastigheten och syrespänningen.
Abstract
Det finns en stor diskrepans mellan syretillförsel och efterfrågan i levern eftersom levern syreförbrukning är relativt hög, men ca 70% av leverns blodförsörjning är dåligt syresatt portvenen blod som härrör från mag-tarmkanalen och mjälten. Syre levereras till hepatocyter av blod flödar från en terminal gren av portvenen till en central venolen via sinusoider, och detta gör en syre gradient i levern lobules. Syret lutning är en viktig fysikalisk parameter som innebär uttrycket av enzymer uppströms och nedströms vid nedsatt mikrocirkulation, men bristen på tekniker för att mäta syreförbrukning i levern mikrocirkulationen har försenat klarlägga mekanismer för syre metabolism i levern. Vi använde därför FITC-märkta erytrocyter för att visualisera den hepatiska mikrocirkulationen och användes laser-assisterad phosphorimetry att mäta det partiella trycket av syre i mikrokärl där. NoncontaCT och kontinuerlig optisk mätning kan kvantifiera hastigheter blodflödet, diametrar fartyg och övertoningar syre i samband med syreförbrukning i levern. I en akut hepatit modell som vi gjort genom att administrera paracetamol på möss vi observerat ökad syre tryck i både portal och centrala venoler, men en minskad syre gradient i sinusoiderna, vilket indikerar att hepatocytnekros i pericentrala zonen skulle kunna överföra syre trycket upp och påverka enzymuttryck i den periportala zonen. Sammanfattningsvis kan våra optiska metoder för att mäta lever hemodynamiken och syreförbrukning avslöjar mekanismer relaterade till leversjukdom.
Protocol
1. Märkning Erytrocyter med fluoresceinisotiocyanat isomer I (FITC)
Alla försöksprotokoll vi använde godkändes av Animal Care kommittén Keio University School of Medicine.
- Bedöva ett donatormöss och efter att ha gjort en celiotomi snitt dra helblod från den nedre hålvenen med en 1-ml spruta innehållande liten mängd heparin. Musen avlivades omedelbart genom natriumpentobarbital injektion (100 mg / kg ip).
- Tvätta hela blod två gånger med PBS (pH 7,4) genom centrifugering under 5 min vid 400 g i en svängande-hink-rotor.
- Lös upp 10 mg av FITC i 5 ml 100 mM Na-HPO 2 4 och filtrera den med ett membran med 0,22 | im porer.
- I ett provrör blanda 1 ml av den FITC-lösning med 0,15 ml av 3 mM glukos, 0,25 ml 180 mM NaH 2 PO 4, och 1,5 ml av 100 mM Na-HPO 2 4. Tillsätt 0,2 ml av RBC pellets och knacka röret för blandning.
- Hålla röret i 2 timmar vid 4 ° C och därefter tvätta de färgade röda blodkropparna i PBS två gånger.
- Sätt en liten del av RBC suspensionen på en bild gräs och se om de röda blodkropparna ser friska (dvs. att deras form och storlek är normalt) och att fluorescensintensiteten är tillräcklig.
- Suspendera 0,1 ml RBC i 0,9 ml PBS vid pH 7,4, och hålla suspensionen vid 4 ° C tills injektion.
2. Framställning av syre-känsliga Färgämne
- Lös 500 mg BSA i 10 ml PBS vid pH 7,4.
- Tillsätt 30 mg Pd (II)-meso-tetra (4-karboxifenyl) porfin (Pd-TCPP) till BSA-lösningen och omrördes över natten.
- (Valfritt) Utdrag BSA-bundet Pd-TCPP genom strömning kromatografi eller en spinnkolonn för att separera den från fritt Pd-TCPP.
- Centrifugera lösningen för avlägsnande av oupplöst Pd-TCPP och filtrera supernatanten med ett membranfilter med 0,22 | im porer. </ Li>
- Lagra 1-ml alikvoter i rör vid -20 ° C. Undvika upprepade frysnings-upptiningscykler.
3. Djur Framställning
- För mikroskopisk observation av mikrocirkulationen framställa en plastplatta med ett hål 20 mm i diameter, och tejpen en 30-mm-kvadrat kvadratisk täckglas över hålet.
- Bedöva en mus, ta bort päls och prep huden. Placera en kateter i bakre förgäves efter läkemedelsinjektion genom användning av en 30 G nål ansluten till en 10-cm polyeten (PE 10) kateter fylld med hepariniserad PBS.
- Efter median snitt, förlänga en huvudsaklig lob i levern på plastplattan och placera musen i sternala VILA.
- Förbered små glider med kök wrap (3 mm x 8 mm) och kakel dem runt kanten på levern loben att hämma förflyttning av levern med andningen och hålla den från att torka.
- Observera nedsatt mikrocirkulation under mikroskop (med ljus), och bekräfta att BLood flöde har ingen stås i synfältet för åtminstone 15 minuter.
- Injicera långsamt 0,2 ml av fluorescensmärkta RBC för blodflöde observation eller 0,2 ml av Pd-TCPP lösning pOa 2 mätningen. Denna mängd FITC-märkta röda blodkroppar kommer att stå för 1/50 av alla RBC i omlopp i den visualiserade regionen.
4. Blood Flow Visualisering
- Excitera FITC genom att bestråla den med kvicksilverlampa ljus som har passerat genom ett bandpassfilter (450-490 nm) 1.
- Notera den fluorescerande bild med en CCD-kamera.
5. pOj 2 Mätning
Pd-TCPP fosforescens är relativt svag och bör detekteras med hög känslighet detektor. Alla experiment måste utföras i ett mörkt rum.
- Absorptionstoppar av Pd-TCPP är vid 410 nm och 532 nm, så den första övertonen våglängd 532 nm rekommenderas för excitering. Denna våglängd kan genereras av en Nd: YAG-laser puls 2.
- Mata strålen från Nd: YAG-laser i den lämpliga porten på omvänt mikroskop, och justera strålpunkten till en central position i fokalplanet. Den spatiala upplösningen beror på laserfläcken storlek, vilket ändras genom att passera strålen genom ett litet hål.
- Att detektera fosforescens, fästa en lång-passfilter (> 620 nm) och ett fotomultiplikatorrör (PMT) till den andra porten hos mikroskopet. PMT skall vara känsliga för röda våglängder, speciellt runt 700 nm.
- Prova att fosforescens signalen (500 poäng samplad vid 200 kHz) och beräkna tidskonstanten för sönderfallet genom att montera en exponentialfunktion till förfall.
- För kalibrering framställa två uppsättning prover med Pd-TCPP lösning med PO 2 150 mm Hg och 0 mm Hg. Tillsätt ditionit natrium 1% i volym till provet för att producera frånvaro av syre. Hålla pH hos proverna vid 7,4 och temperaturenning vid 37 ° C under kalibrering.
- Fixera Stern-Volmer-k q och syrefri luminescens avklingningstid τ 0 i ekvationen (1) 3. I vårt fall, med Pd-TCPP lösningar vid 37 ° C och ett pH på 7,4 är k q 374 mmHg -1 s -1 och τ 0 är 0,74 ms. Dessa mätparametrar beror på den utrustning (dvs laserns, detektor, andra optiska anordningar) och den signalbehandlande metod, så kalibrering behövs i varje mätsystemet 4.
τ 0 / τ = 1 + k q • τ 0 • PO 2 (1) - Ställ musen på plattan på mikroskopet scenen, observera lever mikrocirkulationen och justera läget för målet mikrokärlsbildning till den grad att lasern plats.
6. Hepatit Modell
- Snabba möss med fri tillgång till vatten över natten.
- Förbered en20 mg per ml lösning av acetaminofen (APAP) i DMSO.
- Injicera det intraperitonealt vid 1 ml/100 g kroppsvikt (dvs. 200 mg / kg kroppsvikt). Efter injektionen, mus kan ges fri tillgång till mat och vatten 5.
- 24 timmar efter injektion, bedöva mus och exponera levern genom att göra en median-snitt. Om hepatit uppnås kommer nekros i pericentrala regionen vara väl synlig för blotta ögat.
7. Representativa resultat
T.ex. bilder av levern mikrocirkulationen visas i figur 1, där (a) är en sänd-ljus bild och (b) är en fluorescensbild. Individuella FITC-märkta erytrocyter observeras i videon filmen, och portalen venoler och sinusoiderna och centrala venoler känns igen av anvisningar blodflödet.
Såsom visas i figur 2, var den laserfläcken bestråla en central venol genom en x100 objektivlins approximbart 10 pm i diameter. Intravaskulär pOj 2 i leverns mikrocirkulationen mättes i C57BL / 6 möss, och figur 3 (a) visar förhållandet mellan PO 2 och kärldiametern i portal och centrala venoler. PO 2 gradient från portalen till centrala venoler tyder på att de röda blodkropparna frigör syre effektivt samtidigt som passerar genom sinusoider. Som framgår av Figur 3 (b), var den genomsnittliga PO2 59,8 mmHg i portal fartyg, 48,2 mmHg i sinuskurvor, och 38,9 mmHg i centrala venoler.
När vi producerat akut hepatit genom att injicera APAP intraperitonealt var intravaskulär pOa 2 signifikant förhöjd i varje del av leverns mikrocirkulationen: p <0,05 i portal ådror och p <0,01 i sinuskurvor och centrala vener (Figur 3 (c)).
Figur 1. Låg förstoring iMages visar hepatisk mikrocirkulationen med (en) transmitterat ljus och (b) fluorescens.
Figur 2. Bild av laserpunkt bestråla en riktad centralt venolen för PO 2 mätning.
Figur 3. POa 2 gradient vid nedsatt mikrocirkulation av friska kontroll möss och hos möss med paracetamol-inducerad leverskada. (A) visar pOa 2 kontra fartyget diameter för portalen venoler (PV) och centrala venoler (CV), och (b) visar syret gradient från PV till CV via sinusvågor (S). PO 2 Skillnaden mellan PV och CV återspeglar syreförbrukningen av hepatocyter eller andra parenkymala celler. (C) visar att hepatit förhållanden orsakas av APAP administration, var pOa 2 signifikant förhöjd i PV, S, och CV och PO 2lutning minskat, vilket indikerar att nedsatt syreförbrukning var äventyras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leverera syre till vävnader är en väsentlig roll i mikrocirkulationen och en massa papper beskriver sjukdomar relaterade till mikrokärlsbildning anatomi och reologi 6. Leverblodflödet är en kombination av arteriellt och venöst blod. Ca 30% av blodflödet till levern är väl syresatt blod från den hepatiska artären och den andra 70%, som tillhandahålls av den portala venen, är dåligt syresatt blod venöst utflöde från mjälten och mag-tarmkanalen 7. Leversjukdomar, såsom fettlever, chock eller tumör förändring av blodflödet i den hepatiska mikrocirkulationen. För att bestämma vävnadssyrsättningen behöver man mäta både blodflödet och syrekoncentrationen i mikrocirkulationen. Bristen på kommersiellt tillgängliga instrument för att göra dessa mätningar i levern mikrocirkulationen har gjort det svårt att få fysiologiska data i detta område.
En viktig punkt i steg djur förberedelse är upptagning avlevern på en plastplatta. Lösa fixering resulterar i levern rörelse synkroniserad med andningen, som stör mikroskopisk observation och gör analys svår. Tät fixering orsakar emellertid stås av blodflödet. Blodflöde villkor bör observeras om en låg effekt mikroskop under den operativa proceduren. Hög effekt lasrar lätt skada mikrokärl, så frekvensen av bestrålning bör minimeras. 1 Hz är oftast tillräckligt för temporal mätning 8. Äger emellertid en enkel mätning av pOj 2 mindre än 1 ms, vilket betyder att repetitionsfrekvens kan ökas till 1 kHz för snabb pOa 2 förändring, om nödvändigt. Vidare genererar den fotokemiska reaktionen av Pd-TCPP singlettsyre som skadar mikrokärl och inducerar aggregation av blodplättar 9. Kombinationen av fluorescens avbildning och PO 2-mätning kan mäta dynamiken blodflödet och syre koncentration tillsammans. Den kvicksilverlampa bestrålningspännande FITC hetsar också Pd-TCPP dock, och därmed generera mycket singlet syre och leder till blodflödet stasis. När både blodflödet och syrespänningen mäts i samma djur, bör den FITC avbildning ske innan Pd-TCPP administreras. Dessutom är systemisk syrenivån är indikativ för syreförbrukning i vävnaden. Det är att föredra att utföra respiratoriska förvaltningen under försöken eller analysera blodet gas efter experiment.
Vi använde APAP för att inducera akut hepatit, delvis eftersom en hög dos av APAP är känd för att leda till cellnekros i pericentrala regionen 10. Partiell syrgas tryckmätning visade 20,9-mmHg pOa 2 skillnaden mellan portal venoler och centrala venoler i kontrollmössen minskade till 16,9 mmHg i AP AP-behandlade möss och att pOa 2 var högre under hela nedsatt mikrocirkulation. Syret gradient i levern mikrocirkulationen är huvudsakligen en följd av syre supplIED från portal venoler att konsumeras i hepatocyter. Den högre dosen av APAP inducerar nekros i pericentrala regionen 11, 12, och som skulle kunna minska syreförbrukningen nedströms, såsom visas i fig 3c. För att bestämma detaljerade mekanismerna bakom levern hepatit, särskilt förhållandet mellan vävnadsnekros och syre nivån, kvantifiering av omfattningen av nekros, och serum nivåer av bilirubin, ALT, AST, och inflammatoriska cytokiner måste mätas. Många leversjukdomar är relaterad till hepatisk mikrocirkulationen, med andra ord, att blodflödet fördelning, syreavgivning och syreförbrukning i levervävnad. I fall av kronisk alkoholintag är cirka 10-15% alkohol metaboliseras av mikrosomala etanol-oxiderande systemet, och alkohol-inducerad molekylen P450IIE1 genererar NAPQI 13, en toxisk metabolit som leder till pericentrala hepatocytnekros 14.
Sammanfattningsvis vår optiska MEAsurement metod kan användas för att undersöka fysiologiska och patologiska mekanismer genom analys mikrovaskulär struktur, diameter, blodflödeshastigheten och syrespänningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Ms Risa Otsuka för tekniskt bistånd och hjälpa experiment. Denna forskning har delvis stöd av ministeriet för utbildning, vetenskap, sport och kultur, Grant-i-Stöd till unga forskare (B), 2010, 22700476 och Suzuken Memorial Foundation 2010 för KT och denna studie stöddes av forskning och utveckling nästa generations integrerade Simulering av levande materia, en del av utvecklingen och användningen av nästa generations Supercomputer projekt av MEXT, dels av JST ERATO Suematsu Gas Biology Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pd(II) meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphine | Frontier Scientific, Inc. | PdT790 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich Co. | F7250 | |
| Acetaminophen | Sigma-Aldrich Co. | A7085 | |
| Equipment | |||
| photomultiplier tube | hamamatsu photonics k.k | H10722-20 | |
References
- Ishikawa, M., Sekizuka, E., Shimizu, K., Yamaguchi, N., Kawase, T. Measurement of RBC velocities in the rat pial arteries with an image-intensified high-speed video camera system. Microvasc. Res. 56, 166-172 (1998).
- Tsukada, K., Sekizuka, E., Oshio, C., Tsujioka, K., Minamitani, H. Red blood cell velocity and oxygen tension measurement in cerebral microvessels by double-wavelength photoexcitation. J. Appl. Physiol. 96, 1561-1568 (2004).
- Stern, O., Volmer, M. Über die Abklingzeit der Fluoreszenz. Physik. Zeitschr. 20, 183-188 (1919).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: a novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Soga, T. Differential metabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione consumption. J. Biol. Chem. 281, 16768-16776 (2006).
- Goda, N. Distribution of heme oxygenase isoforms in rat liver. Topographic basis for carbon monoxide-mediated microvascular relaxation. J. Clin. Invest. 101, 604-612 (1998).
- Grote, J. Physiologie der Menschen. , 20th edn, Springer-Verlag. New York. 560 (1980).
- Suganuma, K. Erythrocytes with T-state-stabilized hemoglobin as a therapeutic tool for postischemic liver dysfunction. Antioxid Redox Signal. 8, 1847-1855 (2006).
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based upon quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Bernal, W., Auzinger, G., Dhawan, A., Wendon, J. Acute liver failure. Lancet. 376, 190-201 (2010).
- Hinson, J. A., Roberts, D. W., James, L. P. Mechanisms of acetaminophen-induced liver necrosis. Handb. Exp. Pharmacol. 169, 369-405 (2010).
- Hinson, J. A., Reid, A. B., McCullough, S. S., James, L. P. Acetaminophen-induced hepatotoxicity: role of metabolic activation, reactive oxygen/nitrogen species, and mitochondrial permeability transition. Drug Metab. Rev. 36, 805-822 (2004).
- Lieber, C. S. Medical disorders of alcoholism. N. Engl. J. Med. 333, 1058-1065 (1995).
- Zimmerman, H. J., Maddrey, W. C. Acetaminophen (paracetamol) hepatotoxicity with regular intake of alcohol: analysis of instances of therapeutic misadventure. Hepatology. 22, 767-773 (1995).
