I ovo Elektroporation i Chick midthjernen for at studere genfunktion i dopaminerg Neuron Development

Summary

At vurdere funktionen og reguleringen af ​​gener under udviklingen af ​​midthjerne-dopaminerge neuroner, beskriver vi en fremgangsmåde, der involverer

Abstract

Dopaminerge neuroner beliggende i den ventrale midthjernen styrer bevægelser, følelsesmæssig adfærd og belønning mekanismer ^1-3. Dysfunktion af ventrale midthjerne-dopaminerge neuroner er involveret i Parkinsons sygdom, skizofreni, depression og demens ^1-5. Således kunne studere reguleringen af ​​midthjernen dopaminerg neuron differentiering ikke kun give vigtig indsigt i mekanismer, der regulerer midthjernen udvikling og neurale stamceller skæbne specifikation, men også hjælpe med at udvikle nye terapeutiske strategier for behandling af forskellige mennesker neurologiske lidelser.

Dopaminerge neuroner skelne fra neurale stamceller, der beklæder ventrikulære zone af embryonisk ventral midthjernen. Udviklingen af neurale stamceller er styret af genekspression programmer ^6,7. Her rapporterer vi teknikker anvender elektroporation til at udtrykke gener specifikt i midthjernen af ​​Hamburger Hamilton (HH) scene 11 (thirteen somitter, 42 timer) kyllingeembryoer ^8,9. Den eksterne Udviklingen af kyllingeembryoer giver mulighed for bekvem eksperimentelle manipulationer på specifikke fosterstadiet, med de følgevirkninger afgøres på et senere udviklingsmæssige tidspunkter ^10-13. Chick embryoniske neurale rør tidligere end HH trin 13 (nitten somitter, 48 timer) består af multipotente neurale stamceller som er i stand til at differentiere til forskellige celletyper i nervesystemet. Den pCAG vektor, som indeholder både en CMV-promotor og en kylling β-actin-enhancer, tillader robust ekspression af Flag-eller andre epitop-mærkede konstruktioner i embryoniske kyllinge neurale rør ^14. I denne rapport, lægger vi vægt på særlige foranstaltninger for at opnå regionalt begrænset genekspression i embryonale midterhjernedopaminerge dopaminerge neuron stamceller, herunder hvordan at injicere DNA-konstruktionerne specifikt til den embryonale midthjernen regionen og hvordan man kan lokalisere elektroporation med små skræddersyede elektroder. Analyse cHick midthjernen på senere stadier tilvejebringer et fremragende in vivo for plasmidvektoren-medieret gain-af-funktion og tab af funktion undersøgelser af midterhjernen udvikling. Modifikation af det eksperimentelle system kan strække assayet til andre dele af nervesystemet til udførelse skæbne kortlægningsanalyse og til undersøgelse af reguleringen af ​​genekspression.

Protocol

1. Forsyning Forberedelse (ikke video)

1. Fremstille en frisk 1X fortynding af Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) i 1X PBS. Ikke mere end 50 ml, er nødvendig. Filter med en 0,22 um sprøjtefilter.
2. Forberede injektion konstruktioner ved at kombinere ønskede plasmidkonstruktioner. Vi sætter alle konstruktioner i pCAG-Flag-vektoren med passende støkiometri til et slutvolumen på ~ 10 uL. Desuden bør pCAG-GFP ¹⁴ eller pCAG-mCherry lægges til sporing af elektroporation effektivitet og elektroporerede celler. Vi anvender pCAG-mCherry til dette eksperiment. Endelig tilsættes 0,22 um-filtreret Fast Green farvestof i plasmid-DNA'et blandingen ved en slutkoncentration på 0,05% for at visualisere injektion effektivitet i embryoniske kyllinge midbrains.

2. Æg Forberedelse (i video)

1. For at opnå HH trin 11 embryoner æg skal inkuberes ved 100 ° F (37,8 ° C) i omkring 41 timer efter befrugtning med 25-40% fugtighed. Placeæg på deres side og markere toppen af ​​hver med en blyant streg. Anbring bakker i en forvarmet, befugtet inkubator. Langsomt rocke æg ved at sætte dreje funktion inkubator platforme til "Automatisk". Kontroller luftfugtighed og vandstanden hver 24 timer.
2. Lige før eksperimentet, skal du fjerne æg fra rugemaskinen, og henstår ved stuetemperatur. Dette vil bidrage til at bremse udviklingen og forhindre over udviklingen.
3. Rengør overfladen af ​​hvert æg med 70% ethanol og tørres af med en Kimwipe.
4. Tag to 4 cm stykker tape og holde dem side-by-side på ægget for at gøre en stor rektangel over blyant Dash. Udjævne båndet mod ægget. Det er her i vinduet vil blive foretaget. Båndet vil forhindre små stykker æggeskallen i at falde, når vinduet er skåret op.
5. Anvende en 10 ml sprøjte og 18 ½ gauge nål til at trække 5 ml albumin ud af ægget. Efter gennembrydning af skallen, vinkel nålen bort fra blommen til ikke forstyrrereller beskadige embryo, medens fjernelse af albumin. Rens nålen med 70% ethanol mellem æg, men vær sikker på at nålen er tør, før piercing næste æg.

3. Glas kanyle Forberedelse (i video)

1. Kanyler er lavet ved hjælp af følgende indstillinger på en Flaming / Brown Mikropipette Puller (Sutter model af instrumentet P-97): Heat 670, Pull 120, Vel 40, Time 165. World Precision Instruments (API) 4 inch 1,0 mm tyndvæggede kapillær glas (API TW100F-4) anvendes til at nåle.
2. Læg et trukket glas nål med en P10 pipette og lang spids kapillær loading pipettespidsen (Eppendorf 5242956,003). Indlæse 5-10 pi, afhængigt af hvor mange æg skal injiceres. Fylde glasset kanylen langsomt, hvilket skaber en kontinuerlig søjle af plasmid opløsning fraværende af luftbobler.
3. Placer belastede nålen i nåleholderen knyttet til mikromanipulator (Narishige MM3) og Picospritzer III microinjector. Se nålen under en dissectiom mikroskop og trim nålen på det punkt, hvor den grønne væske stopper. Det hjælper med at anvende en mørk baggrund for bedre at visualisere nålen. Korrekt nål trimning kommer med praksis.

4. Midthjernen / Neural Tube Injection (i video)

1. Brug forår saks til at klippe en 2-2,5 cm i diameter vindue i ægget. Start vinduet fra den tidligere nålen hul ved udarbejdelsen albumin, og drej ægget i hånden, som du skærer. Sørg for at rense ud i saksen med en Kimwipe mættet i 70% ethanol mellem æg.
2. Se kyllingeembryoer under dissektion mikroskop. Kan det være nødvendigt at træne øjnene. Det kan hjælpe til at visualisere embryo ved at injicere 0,22 um-filtreret 20% tusch i PBS under chick embryo. Vi har imidlertid fundet, at dette trin, bør undgås, hvis muligt, da det har tendens til at falde overlevelse.
3. Injektion virker bedst, hvis embryoet er placeret parallelt med banen for nålen, med hovedet væk fra nålen.Langsomt gennembore neuralrøret i en 45 graders vinkel i forhold til midterhjernen-baghjerne junction. Det er meget vigtigt kun at fylde neurale vesikel repræsenterer midthjernen med plasmid-DNA og Fast Green farvestof, uden signifikant diffusion ind i forhjerne og baghjerne regioner. Start indsprøjtning med Picospritzer microinjector varighed på 25 ms, hvilket kan være nødvendigt at ændre alt på p trimning. Generelt skal du bruge mellem 10-50 ms.

5. Elektroporation (på video)

1. Hent kanylen. Sted 3 dråber 1X Pen / Strep i PBS-opløsning i ægget på fosteret.
2. Kontroller indstillingerne for BTX EMC830 elektroporator:

   SPÆNDING:	20 V
   Impulslængde:	25 ms
   # Impulser:	3
   INTERVAL:	500 ms
   Polaritet:

3. Placerer 2 mm lange L-formet platinelektroder i samme vandrette niveau som bunden af ​​neuralrøret, med det embryoniske midthjernen sidder i midten mellem to 3 mm fra hinanden elektroder. Justering af elektroderne med bunden af ​​neuralrøret er kritisk for effektiv elektroporering af den ventrale midthjernen. For at opnå midthjernen-specifik elektroporation, vi erstattet det oprindelige BTX elektroder med to skræddersyede platin L-formede elektroder med korte 2 mm lange spidser. Disse platinelektroder er fremstillet af 0,5 mm diameter platin tråde (Alfa Aesar). Disse platinelektroder er lige lange nok til at dække midterhjernen af ​​en fase 11 chick embryo, som er cirka 0,9 mm lange, uden målretning meget af forhjernen og baghjerne regioner. Tryk BTX fodkontakt gang. Luftbobler bør genereres omkring elektroderne med hver vellykket elektroporering. Fjern forsigtigt elektroderne fra ægget og tør elektroder af med en 70% ethanol-dækket Kimwipe. Placere yderligere 3 dråber 1X Pen / Strep opløsning i ægget på fosteret.
4. Dæk vindue med en 5 cm x 5 cm stykke klar pakketape. Sørg for at forsegle ægget godt, og at ægindholdet ikke kommer i kontakt med båndet.

6. Inkuber og Harvest

1. Anbring æggene tilbage i inkubatoren. Sørg for, at drejning af inkubatoren platforme er OFF. Inkuber æg indtil den ønskede HH trin 23 opnås.
2. Harvest levende embryoner og placere dem i almindelige PBS-fyldt petriskåle for hver tilstand. Skærmen høstet embryoner under et fluorescerende mikroskop dissektion, idet kun embryoner med mCherry ekspression.
3. Overfør embryoer i individuelle brønde i en 24-brønds skål. Fylde hver brønd med 1 ml frisk fremstillet 2% paraformaldehyd (PFA) og tillade at fastsætte 2-3 timer ved 4 ° C.
4. Vaskes faste embryoer tre gange i 10 minutter i PBS. Placer embryoner sekventielt in 15% og 30% saccharose, indtil ækvilibreret. Embryoner vil begynde flyde i saccharose, men vil synke efter ækvilibrering.
5. Check embryoner under et fluorescerende dissektion mikroskop, tage noter på mCherry udtryk mønster og niveau for hvert foster. Integrer hvert embryon i oktober Det er meget vigtigt at orientere embryoer korrekt at generere optimale midterhjernedopaminerge tværsnit for efterfølgende analyse (figur 1).
6. Forberede 18 um tykke midterhjernedopaminerge sektioner ved hjælp af et Leica CM3050S kryostat. Analyser midthjernen udvikling og dopaminerg neuron differentiering af immunfarvning med passende celle typen markører.

7. Repræsentative resultater

En skematisk repræsentation af elektroporering og analysere embryoniske kylling midthjernen er vist i fig 1. I succes injicerede og elektroporeret kyllingeembryoer, skal mCherry udtryk være synlig i midthjernen regionen efter yderligere udvikling ( (figur 2D). Generelt kan omkring 50% af ventrale midthjerne neurale stamceller være effektivt transficeres med den ovennævnte protokol. Specifikationen af dopaminergt i elektroporerede neurale stamceller kan undersøges ved co-lokalisering af mCherry, Flag-mærket gen, med dopaminerge neuron markører såsom tyrosinhydroxylase (TH) (Figur 3). Mønsterdannelse af progenitor domæner i ventrale midthjerne kan undersøges ved co-immnostaining kryosektioner med forskellige stamfaderceller domæne markører.

Utilstrækkelig mCherry ekspression antyder, at ektopisk gener kan ikke effektivt udtrykkes. Embryoner i henhold til denne betingelse bør ikke anvendes til yderligere undersøgelser. Tilsvarende embryoner,overlevede ikke til enden af ​​den eksperimentelle procedure kan ikke anvendes til dataopsamling og-analyse.

Figur 1. Illustration af den embryoniske kylling midthjernen in ovo elektroporering assay. HH trin 11 embryonale kyllingeembryoer injiceres med pCAG-mCherry sammen med gener af interesse blandet med fast green at visualisere injektionen fremgangsmåde (A). Efter fyldt med DNA-konstruktioner, der midbrains elektroporeret med en firkantet bølge elektroporator. Embryoer inkuberes yderligere, indtil den ønskede HH trin 23 er nået. Så mCherry-positive fostre høstes, fast, og Embedded (B). Midterhjernedopaminerge kryosektioner fremstilles med skærende planer er angivet med hvide streg i figur 1B, og analyseret ved immunfarvning med midterhjernedopaminerge markører, såsom tyrosinhydroxylase (TH) (C). Klik herat se et større tal.

Figur 2. Fremstilling af kryosektioner fra embryonisk kylling midthjernen. Efter 41 timer inkubation HH trin 23 kyllingeembryoer udtrykker mCherry og gener af interesse høstet (A, B og C), fikseret med PFA, behandledes med saccharose, og indlejret i OCT for cryosectioning. Kyllingeembryoer omhyggeligt orienteret for at sikre fremstillingen af ​​midthjerne sektioner. En typisk foster morfologi og skæreplanet for at opnå midterhjernedopaminerge sektioner er vist (D). Klik her for at se større figur .

Figur 3. Analyse af elektroporerede midthjerne sektioner. Kryosnit fra fostre med høje niveauer af mCherry udtryk (A) fremstilles og farves med antistofferneerne, som genkender den FLAG-mærkede gen af ​​interesse (B) og midthjernen dopaminerg neuron markør TH (C). Embryonale midbrains elektroporeret med pCAG-mCherry og pCAG-Flag tom vektor tjener som kontrol. Klik her for at se større figur .

Discussion

In ovo elektroporering af embryoniske kylling midthjernen giver en billig og hurtig alternativ til generering af transgene eller knockout-dyr at udføre in vivo undersøgelse af genfunktioner i midthjerne-dopaminerge neuron udvikling. Ved hjælp af korte 2 mm lange L-formet platinelektroder med embryoniske midthjernen-specifikt DNA-injektion er nøglen til at opnå effektiv ekspression af genet af interesse i midthjerne-dopaminerge neuron progenitorer. Hertil kommer, er ved hjælp af korrekte HH Etape 11 kyllingeembryoer kritisk. Dette skyldes dels, at HH trin 11, er udviklingen af ​​kyllingen midthjernen langt nok, således at forhjerne, midterhjernen, og baghjerne er morfologisk skelnes. Dette muliggør præcis positionering af injektionsnålen og elektroderne på midterhjernen region, og således effektivt DNA-injektion og transfektion. Sekund, på HH trin 11, er den forreste neuropore af kyllingeembryo endnu ikke helt tætd, tillader det indsprøjtede plasmid-DNA nemt ind specifikt i midterhjernen region. De smalle samlinger mellem embryonisk forhjerne, midterhjerne-og baghjerne også bidrage til at forhindre hurtig diffusion af DNA-konstruktioner injiceret specifikt i midthjernen. Endelig embryoer på senere stadier tendens til at krølle hovedet til den side af det neurale aksen, hvilket gør det meget vanskeligt at målrette elektroden specifikt midterhjernen. Inkubationstiden er nødvendigt for at opnå HH trin 11 embryoner kan variere som reaktion på afvigelser i inkubationstemperatur, såvel som naturlige forskelle mellem æg. Under vore eksperimentelle betingelser, tager det cirka 41 timers inkubation ved 100 ° F.

Til opnåelse af embryoniske kyllinge midterhjernedopaminerge sektioner for analyse, indlejring og skæring midbrains ved den korrekte orientering er meget kritisk. Enogfyrre timer efter elektroporering, kyllingeembryoer ofte en morfologi svarende til fig 2D. Fremstilling kryosektioner med enskæreplanet parallelt med dem der er vist i figur 2D maksimerer muligheden for at få korrekte midthjerne sektioner for yderligere immunfarvning og kvantificering.

Det faktum, at midthjernen-specifik ektopisk genekspression kan opnås ved elektroporering åbner mulighed for, at denne fremgangsmåde kan anvendes til andre regioner i centralnervesystemet. Placeringen af injektion, såvel som placeringen af elektroderne, kan væsentligt påvirker de hjerneregioner, der effektivt transficeret med DNA-konstruktioner ^7,15. Denne teknik kan også være nyttigt at reducere specifik genekspression i midthjernen af RNAi-medieret Knockdown ^16. Ligeledes kan let modificerede teknikker skal gennemføres for at studere genregulering ved at udtrykke forstærkere knyttet til reportergener, at identificere, kort, og karakterisere nye regulatoriske regioner fra gener i kylling. Når de påføres museembryoer, vil denne teknik være meget hurtigereog lettere at bruge end klassiske transgene metoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized chicken eggs	Charles River Laboratories
Egg incubator	GQF Manufacturing	1502 Sportsman
BTX Electroporator	BTX Harvard Apparatus	ECM830
Electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0162 L-shaped genetrodes	For use with ECM830 electroporator
Platinum iridium wire	Alfa Aesar	#10056	0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes
Glass capillary tube	World Precision Instrument	TW100F-4
Microloader pipette tip	Eppendorf	5242 956.003
India ink	Staples		Filter 20% before use
Microinjector	Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation	Picospritzer III
Fluorescent dissection microscope	Leica	MZ16F
Micropipette puller	Sutter Instrument	D-97