Summary
Para avaliar a função e regulação de genes durante o desenvolvimento de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo, nós descrevemos um método que envolve
Abstract
Neurônios dopaminérgicos localizados no mesencéfalo ventral controle movimento, o comportamento emocional, e mecanismos de recompensa 1-3. A disfunção de ventral mesencéfalo dopaminérgica neurónios está implicado na doença de Parkinson, esquizofrenia, depressão, demência e 1-5. Assim, estudando a regulação da diferenciação de neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo poderia não apenas fornecer informação importante sobre mecanismos de regulação do desenvolvimento de mesencéfalo e especificação destino neural progenitor, mas também ajudar a desenvolver novas estratégias terapêuticas para o tratamento de uma variedade de distúrbios neurológicos humanos.
Neurônios dopaminérgicos diferenciar dos progenitores neurais que revestem a zona ventricular de mesencéfalo ventral do embrião. O desenvolvimento de células progenitoras neurais é controlada por programas de expressão génica 6,7. Aqui relatamos técnicas utilizando eletroporação para expressar genes especificamente no mesencéfalo de estágio Hamburger Hamilton (HH) 11 (thsomitos irteen, 42 horas) embriões de galinha 8,9. O desenvolvimento externo de embriões de galinha permite convenientes manipulações experimentais específicas em estágios embrionários, com os efeitos determinados em momentos posteriores de desenvolvimento 10-13. Tubos pintainho embrionárias neurais mais cedo do que HH fase 13 (dezanove sómitos, 48 horas) consistem em multipotentes progenitores neurais que são capazes de se diferenciar em tipos de células distintas do sistema nervoso. O vector pCAG, que contém tanto um promotor de CMV e um pintainho β-actina potenciador, permite a expressão robusta de Flag ou outras construções de epítopo-etiquetados em tubos de bico embrionárias neurais 14. Neste relatório, destacamos medidas especiais para alcançar a expressão do gene regionalmente restrito em embrionárias mesencéfalo progenitores de neurônios dopaminérgicos, incluindo a forma de injectar DNA constrói especificamente para a região do mesencéfalo embrionário e como identificar eletroporação com pequenos feitos por eletrodos. Analisando cmesencéfalo caipira em fases posteriores proporciona um excelente sistema in vivo para plasmídeo vetor mediada por ganho de função e perda de função de estudos de desenvolvimento mesencéfalo. Modificação do sistema experimental pode prolongar o ensaio para outras partes do sistema nervoso para executar a análise de mapeamento de destino e para investigar a regulação da expressão do gene.
Protocol
1. Fornecimento Preparação (e não em vídeo)
- Prepare uma diluição fresco 1X de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep) em 1X PBS. Não mais do que 50 mL é necessário. Filtrar com um filtro de seringa de 0,22 uM.
- Preparar construções de injecção através da combinação de construções de plasmídeos desejados. Nós colocar todas as construções no vector pCAG-Flag com estequiometria adequada para um volume final de 10 ~ uL. Além disso, pCAG-GFP 14 ou pCAG-mCherry deve ser adicionado para a eficiência eletroporação rastreamento e células eletroporados. Usamos pCAG-mCherry para este experimento. Por fim, adicionar 0,22 m de filtrado corante Fast Green na mistura ADN plasmídico a uma concentração final de 0,05% para visualizar a eficiência injecção mesencefálicas bico embrionárias.
2. Preparação Egg (em vídeo)
- A fim de adquirir fase HH 11 embriões, óvulos precisam de ser incubada a 100 ° F (37,8 ° C) durante cerca de 41 horas após a fertilização com a humidade de 25-40%. Lugarovos do seu lado e marcar a parte superior de cada um com um traço de lápis. Coloque as bandejas em uma pré-aquecido, incubadora umidificada. Lentamente balançar ovos, definindo a função de giro de incubadora de plataformas para "Automático". Verifique o nível de umidade e água a cada 24 horas.
- Logo antes do início da experiência, remover os ovos da incubadora e deixar à temperatura ambiente. Isso vai ajudar a retardar o desenvolvimento e evitar o excesso de desenvolvimento.
- Limpar a superfície de cada ovo com etanol a 70% e limpe para baixo com um Kimwipe.
- Pegue dois pedaços de 4 cm de fita adesiva e colocá-los lado a lado sobre o ovo para fazer um retângulo grande sobre o traço do lápis. Alisar a fita contra o ovo. Este é o lugar onde a janela será feita. A fita irá impedir pequenos pedaços de casca de ovo de cair, quando a janela é cortado e aberto.
- Usar uma seringa de 10 mL e 18 ½ agulha de calibre para desenhar 5 mL de albumina para fora do ovo. Após a perfuração da casca, o ângulo da agulha para longe da gema a não perturbarou danificar o embrião durante a remoção da albumina. Limpe a agulha com etanol 70% entre os ovos, mas certifique-se a agulha está seco antes de perfurar o próximo ovo.
3. Vidro Preparação agulha de injeção (em vídeo)
- As agulhas são feitas usando as seguintes configurações em um flamejante / Brown Micropipeta Puller (Sutter Instrument modelo P-97):. Calor 670, Pull 120, Vel 40, Hora 165 Mundial Precision Instruments (API) 4 polegadas 1,0 milímetros de vidro de parede fina capilar (API TW100F-4) é usado para fazer as agulhas.
- Coloque uma agulha de vidro puxado com uma pipeta P10 ea ponta longa capilar carregamento pipeta (Eppendorf 5.242.956,003). Carregar uL 5-10, dependendo de quantas ovos são para ser injectada. Encher a agulha de vidro lentamente, criando uma coluna contínua de solução de plasmídeo ausente de bolhas de ar.
- Coloque a agulha carregada no suporte da agulha ligado ao micromanipulador (Narishige MM3) ea Picospritzer III microinjector. Ver a agulha sob um dissectiem microscópio e aparar a agulha no ponto onde o fluido verde pára. Ela ajuda a usar um fundo escuro para visualizar melhor a agulha. Agulha apropriada corte vem com a prática.
4. Mesencéfalo / Injeção Tubo Neural (em vídeo)
- Use a tesoura para cortar uma mola janela 2-2,5 cm de diâmetro no ovo. Iniciar a janela do buraco da agulha anterior feito aquando da elaboração de albumina, e girar o ovo em sua mão enquanto você corta. Certifique-se de limpar a tesoura com um Kimwipe saturado em etanol 70% entre os ovos.
- Ver embriões de galinha sob um microscópio de dissecção. Pode ser necessário para a formação dos olhos. Pode ajudar a visualizar o embrião injetando 0,22 m de filtrado 20% nanquim em PBS sob o embrião de galinha. No entanto, verificou-se que este passo deve ser evitada, se possível, uma vez que tende a diminuir a sobrevivência.
- Injecção funciona melhor se o embrião está posicionado em paralelo para o caminho da agulha, com a cabeça para longe da agulha.Lentamente Pierce do tubo neural em um ângulo de 45 graus para a junção mesencéfalo rombencéfalo. É muito crítico para encher apenas a vesícula neural que representa o mesencéfalo com o DNA de plasmídeo e corante verde rápido, sem difusão significativa para as regiões do prosencéfalo e rombencéfalo. Iniciar injetar com o conjunto microinjector Picospritzer de duração de 25 ms, o que pode ter de ser alterado, dependendo da agulha de corte. Em geral, a utilização entre 10-50 ms.
5. Eletroporação (em vídeo)
- Recuperar a agulha de injeção. O local de 3 gotas de Pen 1X / Strep em solução de PBS no ovo no embrião.
- Verifique as configurações do electroporator EMC830 BTX:
TENSÃO: 20 V Comprimento do pulso: 25 ms PULSOS #: 3 INTERVALO: 500 ms POLARIDADE: - Colocar os dois eléctrodos de platina mm de comprimento em forma de L ao mesmo nível horizontal como na parte inferior do tubo neural, com o mesencéfalo embrionário sentado no meio entre dois eléctrodos de 3 mm para além. O alinhamento dos eléctrodos com a parte inferior do tubo neural é crítica para a electroporação eficiente do mesencéfalo ventral. Para alcançar mesencéfalo específico eletroporação, que substituíram os eletrodos originais BTX com duas custom-made de platina em forma de L eletrodos com curtas 2 mm pontas longas. Estes eléctrodos de platina são feitos de fios de 0,5 mm de diâmetro de platina (Alfa Aesar). Estes eletrodos de platina são apenas o suficiente para cobrir o mesencéfalo de um embrião de galinha fase 11, que é de cerca de 0,9 mm de comprimento, sem visar a maior parte do cérebro anterior ou as regiões rombencéfalo. Pressione o pedal BTX uma vez. Bolhas de ar devem ser gerados em torno dos eletrodos com cada eletroporação sucesso. Retire cuidadosamente os eletrodos do ovo e limpe o electrodes fora com um Kimwipe 70% de etanol-coberto. Coloque mais 3 gotas de Pen 1X / solução Strep no ovo, no embrião.
- Cobrir a janela com um 5 cm x 5 cm pedaço de fita de embalagem clara. Ter a certeza de selar o ovo bem e que os conteúdos do ovo não entram em contacto com a fita.
6. Incubar e Colheita
- Colocar os ovos de volta para a incubadora. Certifique-se que o giro da incubadora plataformas é desligada. Incubar ovos até que o desejado fase HH 23 é alcançada.
- Embriões vivos colheita e colocá-los em pratos comuns PBS-cheias de Petri para cada condição. Tela de embriões colhidos sob um microscópio de dissecção fluorescente, mantendo apenas os embriões com expressão mCherry.
- Transferência de embriões em poços individuais de uma placa de 24 poços. Encher cada poço com 1 mL de feita recentemente paraformaldeído a 2% (PFA) e permitir a fixação de 2-3 horas a 4 ° C.
- Lavar embriões fixos três vezes durante 10 minutos cada em PBS. Coloque embriões seqüencialmente in 15% e 30% de sacarose até equilibrada. Os embriões serão inicialmente flutuar em sacarose, mas vai afundar em equilíbrio.
- Verifique embriões sob um microscópio de dissecção fluorescente, tomando notas sobre o padrão de expressão mCherry eo nível de cada embrião. Encaixe cada embrião em outubro É muito crítico para embriões orientar correctamente para gerar secções do mesencéfalo óptimas cruzadas para análises subsequentes (Figura 1).
- Preparar 18 uM secções do mesencéfalo de espessura usando uma Leica criostato CM3050S. Analisar o desenvolvimento do mesencéfalo e diferenciação de neurônios dopaminérgicos por imunocoloração com marcadores tipo adequado de células.
7. Os resultados representativos
Uma representação esquemática de electroporating e analisando mesencéfalo pinto embrionário é mostrado na Figura 1. Em embriões de galinha com sucesso injetados e electroporados, expressão mCherry deve estar visível na região do mesencéfalo, após desenvolvimento (
Expressão mCherry insuficiente sugere que os genes ectópicos não são susceptíveis eficientemente expressa. Embriões sob esta condição não deve ser usado para estudos posteriores. Da mesma forma, os embriões quenão sobreviveu até ao fim do procedimento experimental não pode ser utilizado para a recolha de dados e análise.
Figura 1. Ilustração do mesencéfalo embrionário pinto no ensaio eletroporação in ovo. HH estágio 11 embriões de pinto embrionário são injectados com pCAG-mCherry juntamente com genes de interesse misturados com verde rápido para visualizar o processo de injecção (A). Depois de cheio com construções de ADN, mesencefálicas são electroporados com um electroporator de onda quadrada. Os embriões são ainda incubada até desejada fase HH 23 é alcançado. Em seguida, mCherry-positivas embriões são colhidas, fixadas e incorporado (B). Criossecções mesencéfalo são preparados com planos de corte indicados pela linha branca na Figura 1B, e analisados por imunocoloração com marcadores do mesencéfalo, tais como tirosina hidroxilase (TH) (C). Clique aquipara ver maior figura.
Figura 2. Preparação de criosecções de pinto mesencéfalo embrionário. Após 41 horas de incubação, a fase HH 23 embriões de galinha que expressam mCherry e os genes de interesse são colhidas (A, B e C), fixadas com PFA, tratadas com sacarose, e embebidos em OCT para cryosectioning. Embriões de galinha são cuidadosamente orientada para garantir que a preparação de secções do mesencéfalo. A morfologia do embrião, típica e do plano de corte para a obtenção de seções do mesencéfalo são mostradas (D). Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Análise de secções do mesencéfalo eletroporados. Criossecções a partir de embriões com níveis elevados de expressão mCherry (A) são preparadas e coradas com anticorposs que reconhecem a bandeira-etiquetados com gene de interesse (B) e mesencéfalo dopaminérgica neurónio marcador TH (C). Mesencefálicas embrionárias eletroporados com pCAG-mCherry e pCAG-Flag vetor vazio servir como controle. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
A eletroporação em ovo de pinto mesencéfalo embrionário oferece um baixo custo e rápida alternativa para a geração de animais transgênicos ou knockout para realizar estudo in vivo de funções de genes no mesencéfalo de desenvolvimento neurônio dopaminérgico. Usando 2 mm curto eléctrodos de platina longos em forma de L, juntamente com a injecção de DNA embrionário mesencéfalo-específica é a chave para alcançar expressão eficiente do gene de interesse em progenitores do mesencéfalo dopaminérgicos neuronais. Além disso, utilizando correctos fase HH 11 embriões de galinha é crítica. Isto é porque primeiro, a fase HH 11, o desenvolvimento de mesencéfalo pintainho é avançado o suficiente de modo que o cérebro anterior, mesencéfalo, eo cérebro posterior são morfologicamente distinguíveis. Isto permite a um posicionamento preciso da agulha de injecção e os eléctrodos na região do mesencéfalo, e injecção de DNA, assim, eficiente e de transfecção. Em segundo lugar, a HH estágio 11, o neuroporo anterior do embrião de galinha não está ainda completamente fechard, permitindo que o DNA de plasmídeo injectado para entrar facilmente especificamente para a região do mesencéfalo. As junções estreitas entre prosencéfalo embrionário, mesencéfalo e rombencéfalo também ajudam a evitar a difusão rápida de DNA injetado construções especificamente no mesencéfalo. Por último, os embriões nas fases posteriores tendem a curvar as cabeças para o lado do eixo neural, o que torna muito difícil direccionar o eléctrodo especificamente no mesencéfalo. O tempo de incubação necessário para obter HH estágio 11 embriões podem variar ligeiramente, em resposta aos desvios de temperatura de incubação, assim como as diferenças naturais entre ovos. De acordo com nossas condições experimentais, que leva cerca de 41 horas de incubação a 100 ° F.
Para obtenção de cortes de bico embrionárias mesencéfalo para análise, incorporação e corte mesencefálicas na orientação correta é muito importante. Quarenta e um horas após a electroporação, os embriões de pinto muitas vezes exibem uma morfologia semelhante à Figura 2D. Preparação criossecções com umacorte plano paralelo aos mostrados na Figura 2D maximiza a chance de seções do mesencéfalo corretos para imunomarcação mais e quantificação.
O facto de mesencéfalo-expressão do gene específico ectópica pode ser conseguida por electroporação abre a possibilidade de que esta abordagem pode ser aplicada a outras regiões do sistema nervoso central. A localização da injecção, bem como o posicionamento dos eléctrodos, pode afectar significativamente as regiões do cérebro, que são eficientemente transfectadas com construções de ADN 7,15. Esta técnica pode também ser útil na redução da expressão do gene específico em mesencéfalo por RNAi mediada knockdown 16. Da mesma forma, técnicas ligeiramente modificados podem ser aplicadas para estudar a regulação dos genes, expressando potenciadores ligados a genes repórter para identificar, mapear e caracterizar novas regiões reguladoras de genes no pinto. Quando aplicado a embriões de ratos, esta técnica seria muito mais rápidoe mais fácil de utilizar do que clássicos abordagens transgénicas.
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Disclosures
Os autores não têm interesses conflitantes potenciais para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Takahiko Matsuda para fornecer o pCAG-mCherry construir. YCM é suportado por um prêmio de Desenvolvimento de Carreira da Fundação Schweppe e uma bolsa da Fundação Whitehall.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
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