Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

A Human äggledaren Modell för utredning av Published: August 11, 2012 doi: 10.3791/4036
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,4
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

Summary

Vi beskriver ett

Abstract

Genitala infektioner med Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) är den vanligaste överförs sexuellt sjukdomar hos kvinnor världen över. Ineffektiv clearance eller kvarstående patogener kan leda till stigande infektioner i de övre könsorgan och är tänkta att orsaka kronisk inflammatorisk skada på infekterade vävnader 1,2. Som en konsekvens kan allvarlig kliniska följdsymtom som inflammatoriska sjukdomar (PID), Tubal ocklusion och infertilitet förekommer 3,4.

Merparten av forskningen med C. trachomatis har utförts i epitelcellinjer (t.ex. HEp-2 celler och HeLa-229) eller i möss. Men som med cell-kultur baserade modeller, inte återspeglar de varken fysiologi naturliga vävnaden eller patofysiologin av C. trachomatis genitala infektioner in vivo 5. Ytterligare begränsningar ges av det faktum att de centrala signalkaskader (t.ex. IFN-γ mediatED JAK / STAT signalväg) som styr intracellulära klamydia tillväxten skiljer sig fundamentalt mellan möss och människor 6,7. Vi och andra etablerade därmed ett helt organ äggledaren modellen för att undersöka direkta interaktioner mellan C. trachomatis och mänskliga fallopian celler tube ex vivo 8,9.

För detta ändamål odlades humana äggledarna från kvinnor som genomgår hysterektomi uppsamlades och infekterade med C. trachomatis serumvariant D. Inom 24 h efter infektion, prov där analyserades med användning av svepelektronmikroskopi (SEM) och transmissionselektronmikroskopi (TEM) för att detektera Chlamydia trachomatis medieras epitelskada och C. trachomatis ingå bildning i fallopian vävnaden.

Protocol

1. Beredning av Chlamydia trachomatis Serovar D Stock

  1. Infekterar sammanflytande 175 cm 2 kolv cellkultur som innehåller HeLa-229 celler med 4 ml C. trachomatis D i SPG buffert.
  2. Inkubera under en timme vid 37 ° C under konstant skakning.
  3. Tillsätt 20 ml DMEM med 10% FCS och 240 | il cykloheximid.
  4. Inkubera i en fuktad inkubator under 48 h vid 37 ° C och 5% CO2.
  5. Tillsätt 5 ml sterila glaspärlor, starka skaka loss och förstöra C. trachomatis härbärgerar HeLa-229-celler.
  6. Samla supernatanten och tillsätt ytterligare 5 ml sterila glaspärlor.
  7. Rock tre gånger för 1 minut att förstöra alla HeLa-229 celler och utsläpp C. trachomatis.
  8. Centrifug under 5 min vid 1000 RPMI och 4 ° C för att bli av cellulärt skräp.
  9. Samla upp supernatanten för infektion av 8 till 10 175 cm 2 cellkultur kolvar sammanflytande grown med HeLa 229-celler.
  10. Inkubera alla kolv med 4 ml SPG buffert och 4 ml supernatant från tidigare infektion under en timme vid 37 ° C med konstant skakning.
  11. Efter en timme tillsätt 15 ml DMEM med 10% FCS och 230 | il cykloheximid följt av 48 h inkubation vid 37 ° C och 5% CO2.
  12. Tillsätt 5 ml sterila glaspärlor, skaka för att lossa och förstöra C. trachomatis härbärgerar HeLa-229-celler.
  13. Samla upp supernatanten och tillsätt ytterligare 5 ml sterila glaspärlor.
  14. Rock tre gånger för 1 minut att förstöra alla HeLa-229 celler och utsläpp C. trachomatis.
  15. Centrifug under 5 min vid 1000 RPMI vid 4 ° C för att bli av cellulärt skräp.
  16. Samla upp supernatanten.
  17. Fyll 40 ml av supernatanten i 50 ml Falcon rör, centrifugera i 99 min med 11.000 RPMI.
  18. Efter centrifugering kassera supernatanten och tvätta pelleten med 1 ml SPG buffert.
  19. Homogeniserapelleten i 1 ml SPG och alikvot 20 | il i en 1, 5 ml Eppendorf-rör, förvara vid -70 ° C fram till användning. Biologiska aktiviteten hos den framställda lagret bekräftades i en etablerad HeLa-229 cell-infektionsmodell.

2. Beredning av Human äggledaren

  1. Lagra mänskliga äggledarna (HFT) från kvinnor som genomgår hysterektomi omedelbart efter kirurgi i RPMI innehållande 5% FCS utan antibiotika i 4 ° C tills beredningen. Protokollet godkändes av den etiska kommittén vid universitetet i Lübeck (09-153). Kvinnor som ingår i studien (ålder 34 till 53) hade ingen historia av tidigare C. trachomatis infektion. Vävnad i äggledarna samlades vid förlossningen sterilisering på moderns begäran under kejsarsnitt eller under hysterektomier på grund av symtomatiska myom i lutealfas. Alla HFT testades negativt för C. trachomatis genom PCR.
  2. Dissekera HFT i en Petri-skål innehållande RPMI med5% FCS utan antibiotika. Under hela bearbetningen vävnaden bör nedsänkas i mediet för att förhindra torkning.
  3. Skär av och kasta bindväv och vävnader förstörs under operation.
  4. Efter dissektion öppna HFT försiktigt med en liten skalpell.
  5. För ytterligare experiment framställa bitar av vävnad i storlek av 0,5 cm x 0,5 cm upp till 1 cm x 1 cm.
  6. För infektion butiken HFT förlagan i 1 ml RPMI innehållande 5% FCS utan antibiotika. HFT prover var infekterade med 5.5x10 5 IFU (Tillägg forming units) av C. trachomatis.
  7. Inkubera HFT provet i 37 ° C, 5% CO2 och 21% O2 och i 37 ° C, 5% CO2 och 2% O2 under 24 timmar.
  8. Efter inkubationstid samlar prov och förvara i Montis fixativ i minst tre dagar vid 4 ° C tills SEM / TEM beredning.

3. Framställning av HFT Prov för TEM

  1. FörTEM bort prov från Montis fixativ och skär 2 x 2 mm till 4 x 5 mm bitar. Den återstående vävnaden kan användas för SEM.
  2. Tvätta bitar med natriumkakodylatbuffert, pH 7,35 under 1 timme.
  3. Inkubera i 1% (vikt / volym) osmiumtetroxid i dest. över natten.
  4. Avlägsna överskott av osmiumtetroxid genom tvättning 6x5 min i natriumkakodylatbuffert, pH 7,35.
  5. Avlägsna vatten genom inkubering i ökande koncentrationer av etanol i vatten (volym / volym) (30% i 2 h, 40% i 2 h, 50% i 2 h, 60% i 2 h, 70% över natten, 80% för 2 h, 90% under 1 timme, 95% i 1 h, 100% under 1 timme.
  6. Tvätta ut etanol under 2 x 15 min i propylenoxid och därefter överföra till en blandning av 50% (volym / volym) nyframställd Araldite (inklusive alla komponenter) i propylenglykol och inkubera över natten.
  7. Överföra till nyframställd Araldite (inklusive alla komponenter) under minst 1 tim.
  8. Överföring till platta inbäddningsmedel formar och fyll med Araldite.
  9. Låt Araldite härdaåtminstone 48 timmar vid 60 ° C
  10. Efter trimning av inbäddade prov skär semi tunna sektioner (700 nm) på en ultramikrotom med glas knivar eller en histo diamant kniv och färga med Richardsons fläcken.
  11. Klipp ultra-tunna sektioner (ca 70 nm) med en diamant kniv och överföring till koppar nät (t.ex. 150 kvadratiska maskor).
  12. Stain ultratunna sektioner med 0,5% (vikt / volym) uranylacetat i dest. följt av 3% (vikt / volym) blycitrat i dest. i en automatisk avsnitt Stainer. Alternativt kan delar färgas manuellt genom att lämna galler 15 min på en mättad centrifugerad lösning av uranylacetat i aqua dest. följt av 0,3% blycitrat (vikt / volym) i dest.

4. Framställning av HFT prov för SEM

  1. För SEM bort prov från Montis fixativ, orientera med epitel uppåt på en 1,5 x 1 cm kork ark och fäst position med hjälp insekter nålar.
  2. Överför provet på korken till lämpliga metall korgar ochTvätta under 30 min i natriumkakodylatbuffert, pH 7,35.
  3. Avlägsnande av vatten genom att inkubera provet i ökande koncentration av aceton / vatten-blandningar (volym / volym) 30% under 6 h, 40% i 6 h, 60% i 8 h, 70% över natten, 80% i 2 h, 90% för 2 h och 100% över natten (var extremt försiktig för att hålla provet kontinuerligt under vatten).
  4. Överföring till Fresh 100% aceton och torka prov genom kritisk punkt torkning (temperatur 40 ° C, tryck 80 bar).
  5. Ta bort nålar, kork och lim prov med epitelet uppåt på SEM provet montering utrustade med en ledande kol flik med ledande kol cement. Flytande ledande silver för att förbättra ledningsförmågan mellan fästet och det ledande kolet fliken.
  6. Framställa en ledande platina, guld eller palladium beläggning av provet med användning av en förstoftningsbeläggare.

5. Färgning av Semi tunna sektioner med Richardson Stain

  1. Låt semi tunna sektioner torr bild.
  2. Fläcka sektioner med färgning lösning vid 60 ° C under 1-2 minuter.
  3. Tvätta i aqua dest.
  4. Torra sektioner och täckglas.

6. Representativa resultat

Inom den humana äggledaren infektionsmodell kunde vi att visualisera skillnader i epitelial morfologi mellan de icke-infekterade kontroller (Figur 1) och C. trachomatis - infekterade rör (figur 2) under normoxisk skick. Karakteristiska morfologiska skillnader underförstått patogen-inducerad svullnad och lys av äggledaren epitelceller som inte kunde detekteras i icke-infekterade kontroller. Med semi tunna sektioner och transmissionselektronmikroskopi kunde vi bevisa intracellulär C. trachomatis inkludering bildning i ex vivo-infekterade humana äggledaren vävnad (fig 3, 5) men inte i icke-infekterade kontroller (Figur 4). Eftersom syrgas koncentrationtioner i den kvinnliga könsorgan redan låga under fysiologiska förhållanden 11, och ytterligare minska under en inflammatorisk process som vi också undersökt vår modell under hypoxiska förhållanden. Preliminära resultat indikerar modellen är användbar för att analysera klamydia tillväxt och avkomman under varierande syrehalter. Klamydia-inducerad epitelcellskada måste skiljas från artefakter som förmedlas via oförsiktig beredning och hantering av äggledarna före infektion (Figur 6).

Figur 1
Figur 1. Svepelektronmikroskopi (SEM) av en icke-infekterad människa fallopian efter en dag inkubation i kontroll medium (grön pil visar cilierad cell, blå pil visar inte cilierad cell).

Figur 2
Figur 2. Scanning electron MICROS kopia (SEM) av en ex vivo C. trachomatis infekterade humana äggledaren en dag efter infektion (vit pil uppbrutna integration).

Figur 3
Figur 3. Semi tunna sektioner uppvisar typiska intracellulära inneslutningar (vita pilar) 1d efter infektion av det humana äggledaren med C. trachomatis ex vivo.

Figur 4
Figur 4. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) av ett icke-infekterad human äggledar efter en dag inkubation i kontrollmediet.

Figur 5
Figur 5. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) av ett ex vivo C. trachomatis infekterade mänskliga äggledaren en dag efter infektion (vita pilar markerar klamydia inneslutningar).

ve_content "> Figur 6
Figur 6. Svepelektronmikroskopi (SEM) av äggledaren epitel skadas genom oförsiktig beredning och hantering av prov (vita pilar varumärket förstörs epitelial vävnad).

Discussion

Visualisering av patogen-inducerade skador på den infekterade vävnaden är besvärlig och ofta begränsat till experimentella procedurer hos möss. Vi etablerade ett ex-modell vivo-infektion i mänskliga äggledarna för att analysera C. trachomatis infektioner i de övre kvinnliga könsorgan. Genom användning av denna metod, kunde vi att visualisera C. trachomatis - inducerad skada på människors äggledaren epitel inom ett dygn efter infektion. Cellulär svallning och lys var typiska morfologiska förändringar som observerades i C. trachomatis - infekterade äggledarna, men inte hos icke-infekterade kontroller. TEM analyser visade att chlamydia genomföra en typisk intracellulär utvecklingscykel i infekterade vävnader, som visar stora inneslutningar med re-differentierade elementära organ men också mindre inneslutningar med förstorade retikulära organ som kan tyda uthållighet. Däremot räcker den morfologiska bilden ensamt att inte diskriminera mellan replicating och ihållande infektioner, som kännetecknas av minskad ämnesomsättning och ökad motståndskraft mot antibiotika 10.

Förstörelse av epitelet i infekterade äggledarna är antingen på grund av störningar av C. trachomatis - infekterade epitelceller efter avslutad den intracellulära utvecklingscykel och frisättning av infektiösa elementära organ eller frisättningen av pro-inflammatoriska cytokiner 8. Patogen-inducerad vävnadsskada och värd-inducerade immunreaktioner mot C. trachomatis är tänkta att vara de främsta orsakerna till förlust av epitelceller funktion, fibroblast ombyggnad och slutligen Tubal infertilitet in vivo 8,11.

En av de stora begränsningarna i denna modell är avsaknaden av inflammatoriska celler som hindrar en analys av sekundära effekter till den ursprungliga C. trachomatis infektion i äggledaren epitelet. Emellertid är den modell aphov av utomstående för att undersöka olika miljöförhållanden (t.ex. syrehalt) och den ursprungliga värd-immunsvar hos akut C. trachomatis-infektioner 8,9. Ytterligare planer är att skapa en modell för testning av antibiotika mot C. trachomatis i hela mänskliga äggledarna och för att karakterisera de metaboliska tillstånd för de olika utvecklingsstadier som observerats i äggledarna epitelet med 2-foton laserskanning mikroskopi.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av DFG-Cluster of Excellence "Inflammation i Gränsland" (RA-Om RA-D). Vi är tacksamma för den utmärkta tekniskt stöd Kristin Wischnat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-802
FCS PAA A15-101
Cycloheximide Sigma - Aldrich
SPG Buffer various see recipe below
Monti's fixative various see recipe below
sodium cacodylate buffer various see recipe below
Richardson's stain various see recipe below

Recipes:

1. SPG Buffer
  1. Add 75 g sucrose.
  2. Add 2.47 g disodium phosphate.
  3. Add 0.36 g monosodium phosphate.
  4. Add 0.72 g glutamic acid.
  5. Fill to 1 l with aqua dest.
  6. Adjust pH to 7.3.

2. 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.35.
  1. Add 42.80 g dimethylarsenic acid sodium salt.
  2. Add 68.46 g sucrose.
  3. Fill to 1 l with aqua dest. to get 0.2 M sodium cacodylate buffer.
  4. Before use dilute solution with aqua dest. to desired concentration and adjust pH to 7.35 if necessary.

3. Monti's fixative
  1. Add 156 ml 0.12 M sodium cacodylate buffer. 3.2 Add 25 ml 25% glutardialdehyde in aqua dest.
  2. Add 19 ml 10% paraformaldehyde in aqua dest.
  3. Add 3 ml 3% CaCl2 in aqua dest.
  4. Adjust pH to 7.35 and fill with aqua dest. to 312 ml final solution.

4. Richardson's stain
  1. Mix equal parts of 1% methylene blue in 1% aqueous borax solution and 1% Azur II in aqua dest.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping. J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).
  2. Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility. Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).
  3. Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).
  4. Mardh, P. A. Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).
  5. Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells. Mol. Cancer. 5, 55 (2006).
  6. Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells. Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).
  7. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
  8. Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection. Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).
  9. Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).
  10. Wyrick, P. B., Knight, S. T. Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin. J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).
  11. Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring. Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).

Tags

Medicin Infektion mikrobiologi fysiologi, Humant äggledaren vävnadsmodell svepelektron-mikroskopi transmissionselektronmikroskopi
A Human äggledaren Modell för utredning av<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Infektioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jerchel, S., Knebel, G., König, … More

Jerchel, S., Knebel, G., König, P., Bohlmann, M. K., Rupp, J. A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections. J. Vis. Exp. (66), e4036, doi:10.3791/4036 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter