טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח לחיידק<em> חיידקי Escherichia</em> שיכול לשמש לבודד ולאפיין קומפלקסים יציבים רב חלבון להומוגניות קרובה אפילו החל מלהעתיק מספרים נמוכים לתא.
מאחר שרוב התהליכים תאיים מתווכים על ידי אסיפות macromolecular, זיהוי השיטתי של אינטראקציות בין חלבונים (PPI) וזיהוי של רכב המקטע של חלבון רב קומפלקסים יכולים לספק תובנות לגבי תפקוד גן ולשפר את ההבנה של מערכות ביולוגיות 1, 2. אינטראקציות גופניות יכולות להיות ממופות עם בידוד גבוה ביטחון vialarge היקף ואפיון של קומפלקסי חלבונים אנדוגניים בתנאים כמעט פיסיולוגיים המבוססים על טיהור זיקה של חלבונים מתויגים-כרומוזומלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS). גישה זו יושמה בהצלחה באורגניזמים אבולוציונית מגוונים, כולל שמרים, זבובים, תולעים, תאי יונקים, וחיידקים 1-6. בפרט, לנו שנוצרנו מערכת תיוג כפולה זיקת Carboxy-מסוף פפטיד סדרתית (SPA) לקומפלקסי חלבוני ילידי זיקה לטיהור מחיידקי Escherichia גרם שלילי בתרבית, באמצעות geזני netically-צייתנים מארחים מעבדה שמתאימה היטב לחקירות הגנום של הביולוגיה הבסיסית ותהליכים משתמרים של 1 פרוקריוטים, 2, 7. מערכת ספא התיוג שלנו היא מקבילה לשיטת טיהור הזיקה מקביל פותחה במקור עבור שמרים 8, 9, והוא מורכב מcalmodulin מחייב פפטיד (CBP) ואחריו אתר המחשוף לטבק וירוס לחרוט (TEV) פרוטאז מאוד הספציפי ושלושה עותקים דגל epitope (FLAG 3X), ומאפשר לשני סיבובים רצופים של העשרת זיקה. לאחר הגברת קלטת, מוצרי PCR יניארי רצף ספציפי קידוד SPA-התג וסמן בחירה משולבים ובאים לידי ביטוי במסגרת כמו fusions Carboxy-מסוף בDY330 רקע שמושרה transiently לבטא מערכת יעילה ביותר Heterologous bacteriophage מבדה רקומבינציה 10. טיהור כפולה צעד בעקבות שימוש בחרוזי זיקה אנטי FLAG calmodulin ומאפשרת סלקטיביתוהחלמה יעילה של קומפלקסי חלבונים אפילו שפע נמוכים מתרבויות בקנה מידה גדולה. טנדם ספקטרומטריית מסה לאחר מכן נעשתה שימוש כדי לזהות את החלבונים ביציבות שיתוף לטיהור עם רגישות גבוהה (מגבלות זיהוי Nanogram נמוכות).
כאן, אנו מתארים את תהליכי צעד אחר צעד מפורטים אנחנו בדרך כלל משתמשים לתיוג חלבון, טיהור ושיטתית ניתוח ספקטרומטריית מבוססת של קומפלקסי חלבונים מסיסים מE. חיידק, שניתן לשנות את הגודל ופוטנציאל מותאם למיני חיידקים אחרים, כוללים פתוגנים מסוימים אופורטוניסטיים נוחות לrecombineering. האינטראקציות הפיזיות הנובעות לעתים קרובות יכולות לחשוף מרכיבים בלתי צפויים וחיבורים מעניינים המצביעים על קישורים מכניסטית רומן. אינטגרציה של נתוני PPI עם נתוני עמותה מולקולריים חלופיים כגון אינטראקציות גנטיות (גני גן) וגנומי להקשר (GC) תחזיות יכולות להקל הבהרה של הארגון המולקולרי הגלובלי של מתחמים רבים בחלבונים בתוך דומסלולי ological. הרשתות נוצרו עבור E. coli ניתן להשתמש כדי לקבל תובנה האדריכלות הפונקציונלית של מוצרי הגן orthologous בחיידקים אחרים שלהסברים פונקציונליים כרגע חסרים.
היבט מרכזי של גישת APMS ספא המבוססת המתוארים כאן הוא שהתיוג מתבצע במסגרת כרומוזומלית הטבעית, ובכך להבטיח רגולציה של גנים נורמליות נשמר (כלומר אמרגן פיתיון ילידים. נשמר, ומכאן רמות הביטוי אינה מוטרדות) וילידים הקשורים ביציבות קומפלקסי חלבונים הם התאוששו ברמה קרוב?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי כספים מהקרן הקנדית עבור חדשנות, הגנום קנדה, אונטריו מכון Genomics, אונטריו משרד החדשנות, ומכון הקנדי לבריאות מחקר המענק לJG ו AE אדום מבטא א coli הזן DY330 היה מתנה מסוג דונלד ל בית המשפט (המכון הלאומי לסרטן, פרדריק, מרילנד).
Materials | Vendor | and Catalog Numbers | |
I. Antibiotics | |||
Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
2. Terrific-Broth medium | |||
Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
Loading dye | NEB | #B7021S | |
Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
DNA ladder | NEB | #N3232L | |
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
6. PCR and Transformation Equipments | |||
Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
7. Electrophoresis and Western blotting | |||
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
n-butanol | Sigma | # B7906 | |
TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
8. Sonication Equipment and Reagents | |||
Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
EGTA | Sigma | #E3889 | |
LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
10. Silver Staining Reagents | |||
Methanol | Bioshop | #MET302 | |
Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
Formic acid | Sigma | #F0507 | |
HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
12. Labware | |||
4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
-80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |