La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la bacteria<em> Escherichia coli</em> Que se puede utilizar para aislar y caracterizar proteínas estables de múltiples complejos a cerca de homogeneidad incluso partiendo de bajo número de copias por célula.
Como la mayoría de los procesos celulares están mediadas por las asambleas macromoleculares, la identificación sistemática de las interacciones proteína-proteína (PPI) y la identificación de la composición de la subunidad de multi-proteína complejos pueden dar una idea de la función de genes y mejorar la comprensión de los sistemas biológicos 1, 2. Interacciones físicas se pueden mapear con alta confianza vialarge escala aislamiento y caracterización de complejos de proteínas endógenas en condiciones próximas a las condiciones fisiológicas basado en la purificación por afinidad de proteínas cromosómicamente etiquetados en combinación con espectrometría de masas (APMS). Este enfoque ha sido aplicado con éxito en diversos organismos evolutivamente, incluyendo levaduras, moscas, gusanos, células de mamíferos, bacterias y 1-6. En particular, hemos generado una afinidad carboxi-terminal del péptido secuencial (SPA) Sistema de marcado doble para los complejos de purificación por afinidad de proteínas nativas de cultivos de bacterias gram-negativas Escherichia coli, utilizando genetically-tratables cepas huésped de laboratorio que están bien adaptados para todo el genoma investigaciones de la biología fundamental y los procesos conservados de procariotas 1, 2, 7. Nuestro SPA-tagging sistema es análogo al método de purificación de afinidad en tándem desarrollado originalmente para la levadura 8, 9, y consta de un péptido de unión a calmodulina (CBP), seguido por el sitio de escisión para la proteasa altamente específica tabaco etch virus (TEV) y tres copias del epítopo FLAG (FLAG 3X), permitiendo por dos rondas consecutivas de enriquecimiento de afinidad. Después de la amplificación casete, específicas de secuencia lineales productos de PCR que codifican el SPA-tag y un marcador seleccionable se integran y se expresa en marco como carboxi-terminal de fusiones en un fondo DY330 que es inducida para expresar transitoriamente un muy eficiente sistema de recombinación heteróloga bacteriófago lambda 10. Posterior de doble etapa de purificación usando calmodulina y anti-FLAG perlas de afinidad permite que el altamente selectivoy la recuperación eficaz de incluso complejos de baja abundancia de proteínas de cultivos a gran escala. La espectrometría de masas se utiliza para identificar los purificadores de manera estable co-proteínas con alta sensibilidad (bajos límites de detección de nanogramos).
A continuación, describimos detalladas paso a paso los procedimientos que comúnmente se utilizan para el etiquetado sistemático de proteínas, purificación y espectrometría de masas basado en el análisis de complejos de proteínas solubles de E. coli, que pueden ser ampliadas y potencialmente adaptado a otras especies bacterianas, incluyendo ciertos patógenos oportunistas que son susceptibles de recombinería. Las interacciones físicas resultantes a menudo pueden revelar interesantes componentes y conexiones inesperadas que sugieren nuevos enlaces mecánicos. La integración de los datos de PPI con alternativas datos de la asociación molecular, tales como genéticos (gen-gen) las interacciones y el contexto genómico-(GC) predicciones pueden facilitar la elucidación de la organización mundial molecular de los complejos multi-proteína dentro de bivías metodológicas. Las redes generadas por E. coli se puede utilizar para obtener una perspectiva de la arquitectura funcional de los productos de genes ortólogos en otros microbios para que las anotaciones funcionales están faltando.
Un aspecto clave del enfoque basado en SPA APMS descrito aquí es que el marcado se realiza en el contexto cromosómico natural, garantizando así la regulación de genes normales se mantiene (es decir. Cebo promotor nativo conserva, por lo tanto, los niveles de expresión no es perturbado) y nativo de manera estable asociada a complejos de proteínas se recuperan casi a los niveles endógenos. Cuestiones operón polaridad también se evitan mediante la inclusión de un promotor orientada hacia fuera en el marc…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado con fondos de la Fundación Canadiense para la Innovación, Genoma Canadá, el Instituto de Genómica de Ontario, Ontario el Ministerio de Innovación, y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de subvención a JG y AE E. Rojo-expresión DY330 coli cepa fue una especie de regalo de Donald L. Corte (National Cancer Institute, Frederick, MD).
Materials | Vendor | and Catalog Numbers | |
I. Antibiotics | |||
Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
2. Terrific-Broth medium | |||
Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
Loading dye | NEB | #B7021S | |
Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
DNA ladder | NEB | #N3232L | |
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
6. PCR and Transformation Equipments | |||
Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
7. Electrophoresis and Western blotting | |||
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
n-butanol | Sigma | # B7906 | |
TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
8. Sonication Equipment and Reagents | |||
Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
EGTA | Sigma | #E3889 | |
LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
10. Silver Staining Reagents | |||
Methanol | Bioshop | #MET302 | |
Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
Formic acid | Sigma | #F0507 | |
HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
12. Labware | |||
4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
-80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |