Identifikation af protein-komplekser i<em> Escherichia coli</em> Hjælp Sekventiel Peptide Affinitetsrensning i kombination med Tandem massespektrometri

Summary

Affinitetsoprensning af mærkede proteiner i kombination med massespektrometri (APMS) er en kraftig fremgangsmåde til systematisk kortlægning af protein-interaktion net og til undersøgelse af den mekanistiske basis af biologiske processer. Her beskriver vi en optimeret sekventiel peptid affinitet (SPA) APMS fremgangsmåde udviklet til bakterien<em> Escherichia coli</em>, Der kan anvendes til at isolere og karakterisere stabile multi-proteinkomplekser til næsten homogenitet, selv ud fra et lavt kopital pr celle.

Abstract

Da de fleste cellulære processer er medieret af makromolekylære forsamlinger, den systematiske identifikation af protein-protein interaktioner (PPI) og identifikation af subunit sammensætning af multi-protein komplekser kan give indblik i genfunktion og øge forståelsen af biologiske systemer ^{1, 2.} Fysiske interaktioner kan kortlægges med stor sikkerhed vialarge omfattende isolering og karakterisering af endogene protein-komplekser under næsten fysiologiske betingelser baseret på affinitetsoprensning af kromosomalt-mærkede proteiner i kombination med massespektrometri (APMS). Denne strategi er blevet anvendt med succes i evolutionært forskellige organismer, herunder gær, fluer, orme, pattedyrceller og bakterier ^1-6. Især har vi skabt en carboxyterminal sekventiel Peptide Affinity (SPA) to tagging system til affinitets-oprensning af native protein-komplekser fra dyrkede gramnegative Escherichia coli ved hjælp af genetically-medgørlig vært laboratoriestammer, der er velegnet til genom-dækkende undersøgelser af den grundlæggende biologi og bevarede processer prokaryoter ^{1, 2, 7.} Vores SPA-mærkningssystem er analog med tandem affinitetsoprensning fremgangsmåde oprindeligt udviklet til gær ^{8, 9,} og består af en calmodulin-bindende peptid (CBP) efterfulgt af spaltningsstedet for den meget specifikke Tobacco Etch Virus (TEV) protease og tre kopier af FLAG-epitopen (3X FLAG), der giver mulighed for to på hinanden følgende runder af affinitetsberigelse. Efter kassette amplifikation, er sekvensspecifikke lineære PCR-produkter koder for SPA-tag og en selekterbar markør integreret og udtrykt i rammen som carboxyterminale fusioner i en DY330 baggrunden, som induceres til transient udtrykker en meget effektiv heterolog bakteriofag lambda rekombination system ^10. Efterfølgende to-trins oprensning under anvendelse af calmodulin og anti-FLAG-affinitetsperler muliggør meget selektiveog effektiv inddrivelse af selv lav hyppighed proteinkomplekser fra store kulturer. Tandem-massespektrometri anvendes derefter til at identificere de stabilt co-oprensning af proteiner med høj følsomhed (lavt nanogram detektionsgrænser).

Her beskriver vi detaljerede trin-for-trin procedurer, vi almindeligvis bruger til systematisk protein tagging, oprensning og massespektrometri-baseret analyse af opløselige proteinkomplekser fra E. coli, hvilket kan skaleres op og potentielt tilpasset andre bakteriearter, herunder visse opportunistiske patogener, der er modtagelige for recombineering. De resulterende fysiske interaktioner kan ofte afsløre interessante uventede komponenter og forbindelser tyder nye mekanistiske links. Integration af PPI data med alternative molekylære forening data såsom genetiske (gen-gen) interaktioner og genomisk-sammenhæng (GC) forudsigelser kan lette opklaringen af ​​den globale molekylære organisation af multi-protein-komplekser i bigiske pathways. De netværk genereret for E. coli kan anvendes til at opnå indsigt i den funktionelle arkitektur ortologe genprodukter i andre mikrober, for hvilke funktionelle annotationer i øjeblikket mangler.

Protocol

1. Konstruktion af Gene-specifik SPA-tagging i E. coli DY330 Strain Plasmidet pJL148 der omfatter SPA-tag DNA-sekvensen og kanamycin antibiotikumresistensmarkør kassette (kanR) anvendes som template i polymerasekædereaktion (PCR)-amplifikation 7. En 45 nt genspecifikke forward primer, som er placeret umiddelbart opstrøms for målgenet stopcodon i ramme med en 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') tag specifik fremadrettet primer og en 45 nt gen-specifik revers p…

Representative Results

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon…

Discussion

Et centralt aspekt af SPA-baserede APMS tilgang beskrevet her, er, at kodning er udført inden for det naturlige kromosomale sammenhæng og dermed sikre normal genregulering opretholdes (dvs.. Native agn promotor bevaret, og derfor ekspressionsniveauer ikke forstyrres) og native stabilt-associeret proteinkomplekser bliver indbetalt på nær-endogene niveauer. Operon polaritet problemer undgås også ved at indbefatte en udadvendende promotoren i den selekterbare markør. Dette SPA-tagging fremgangsmåde er effe…

Materials

Materials	Vendor	and Catalog Numbers
			I. Antibiotics
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
			2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
Yeast extract	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
			3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
			4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase	Fermentas	# EP0281
10 X PCR buffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Loading dye	NEB	#B7021S
Ethidium bromide	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Boric acid	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# E6768
DNA ladder	NEB	#N3232L
			5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	#28104
			6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler	BioRad	iCycler
Agarose gel electrophoresis	BioRad
Electroporator	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette	Bio-Rad
42 °C water bath shaker		Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 °C Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator	Fisher Scientific
			7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide	Bio-Rad	#161-0125
Ammonium persulfate	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 filter paper	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 cell	Bio-Rad	#165-3301
iBlot gel transfer device	Invitrogen	#IB1001
Nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody	Sigma	#F3165
Horseradish peroxidase	Amersham	#NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards	Bio-Rad	#161-0363
Chemiluminescence reagent	PIERCE	#1856136
Autoradiography film	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw blotting paper	Sigma	#P7796
C2 platform rocking shaker	New Brunswick Scientific, USA
			8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Protease inhibitors	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
			9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase nuclease	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 agarose beads	Sigma	#A2220
Calmodulin-sepharose beads	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558
			10. Silver Staining Reagents
Methanol	Bioshop	#MET302
Acetic acid	Bioshop	t#ACE222
Sodium-thiosulfate	Sigma	#S-7143
Silver nitrate	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldehyde	Bioshop	#FOR201
Sodium carbonate	Bioshop	#SOC512
			11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitrile	Sigma	#A998-4
Formic acid	Sigma	#F0507
HPLC grade water	Sigma	#95304
Iodoacetamide	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin	Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer		Thermo Fisher Scientific
			12. Labware
4 liter conical flasks	VWR	#89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes	Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Any Vendor
250 ml conical flaks	VWR	#29140-045
15 ml sterile culture tubes	Thermo Scientific	#366052
Cryogenic vials	VWR	#479-3221
-80 °C freezer	Fisher Scientific	#13-990-14
Speed vacuum system	Thermo Scientific
			Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g Yeast Extract 2% Glycerol 50 ml potassium salt stock solution 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10% Glycerol Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 30 g sodium carbonate 1000 ml distilled water 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid