Summary

Identifikation af protein-komplekser i<em> Escherichia coli</em> Hjælp Sekventiel Peptide Affinitetsrensning i kombination med Tandem massespektrometri

Published: November 12, 2012
doi:

Summary

Affinitetsoprensning af mærkede proteiner i kombination med massespektrometri (APMS) er en kraftig fremgangsmåde til systematisk kortlægning af protein-interaktion net og til undersøgelse af den mekanistiske basis af biologiske processer. Her beskriver vi en optimeret sekventiel peptid affinitet (SPA) APMS fremgangsmåde udviklet til bakterien<em> Escherichia coli</em>, Der kan anvendes til at isolere og karakterisere stabile multi-proteinkomplekser til næsten homogenitet, selv ud fra et lavt kopital pr celle.

Abstract

Da de fleste cellulære processer er medieret af makromolekylære forsamlinger, den systematiske identifikation af protein-protein interaktioner (PPI) og identifikation af subunit sammensætning af multi-protein komplekser kan give indblik i genfunktion og øge forståelsen af biologiske systemer 1, 2. Fysiske interaktioner kan kortlægges med stor sikkerhed vialarge omfattende isolering og karakterisering af endogene protein-komplekser under næsten fysiologiske betingelser baseret på affinitetsoprensning af kromosomalt-mærkede proteiner i kombination med massespektrometri (APMS). Denne strategi er blevet anvendt med succes i evolutionært forskellige organismer, herunder gær, fluer, orme, pattedyrceller og bakterier 1-6. Især har vi skabt en carboxyterminal sekventiel Peptide Affinity (SPA) to tagging system til affinitets-oprensning af native protein-komplekser fra dyrkede gramnegative Escherichia coli ved hjælp af genetically-medgørlig vært laboratoriestammer, der er velegnet til genom-dækkende undersøgelser af den grundlæggende biologi og bevarede processer prokaryoter 1, 2, 7. Vores SPA-mærkningssystem er analog med tandem affinitetsoprensning fremgangsmåde oprindeligt udviklet til gær 8, 9, og består af en calmodulin-bindende peptid (CBP) efterfulgt af spaltningsstedet for den meget specifikke Tobacco Etch Virus (TEV) protease og tre kopier af FLAG-epitopen (3X FLAG), der giver mulighed for to på hinanden følgende runder af affinitetsberigelse. Efter kassette amplifikation, er sekvensspecifikke lineære PCR-produkter koder for SPA-tag og en selekterbar markør integreret og udtrykt i rammen som carboxyterminale fusioner i en DY330 baggrunden, som induceres til transient udtrykker en meget effektiv heterolog bakteriofag lambda rekombination system 10. Efterfølgende to-trins oprensning under anvendelse af calmodulin og anti-FLAG-affinitetsperler muliggør meget selektiveog effektiv inddrivelse af selv lav hyppighed proteinkomplekser fra store kulturer. Tandem-massespektrometri anvendes derefter til at identificere de stabilt co-oprensning af proteiner med høj følsomhed (lavt nanogram detektionsgrænser).

Her beskriver vi detaljerede trin-for-trin procedurer, vi almindeligvis bruger til systematisk protein tagging, oprensning og massespektrometri-baseret analyse af opløselige proteinkomplekser fra E. coli, hvilket kan skaleres op og potentielt tilpasset andre bakteriearter, herunder visse opportunistiske patogener, der er modtagelige for recombineering. De resulterende fysiske interaktioner kan ofte afsløre interessante uventede komponenter og forbindelser tyder nye mekanistiske links. Integration af PPI data med alternative molekylære forening data såsom genetiske (gen-gen) interaktioner og genomisk-sammenhæng (GC) forudsigelser kan lette opklaringen af ​​den globale molekylære organisation af multi-protein-komplekser i bigiske pathways. De netværk genereret for E. coli kan anvendes til at opnå indsigt i den funktionelle arkitektur ortologe genprodukter i andre mikrober, for hvilke funktionelle annotationer i øjeblikket mangler.

Protocol

1. Konstruktion af Gene-specifik SPA-tagging i E. coli DY330 Strain Plasmidet pJL148 der omfatter SPA-tag DNA-sekvensen og kanamycin antibiotikumresistensmarkør kassette (kanR) anvendes som template i polymerasekædereaktion (PCR)-amplifikation 7. En 45 nt genspecifikke forward primer, som er placeret umiddelbart opstrøms for målgenet stopcodon i ramme med en 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') tag specifik fremadrettet primer og en 45 nt gen-specifik revers p…

Representative Results

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon…

Discussion

Et centralt aspekt af SPA-baserede APMS tilgang beskrevet her, er, at kodning er udført inden for det naturlige kromosomale sammenhæng og dermed sikre normal genregulering opretholdes (dvs.. Native agn promotor bevaret, og derfor ekspressionsniveauer ikke forstyrres) og native stabilt-associeret proteinkomplekser bliver indbetalt på nær-endogene niveauer. Operon polaritet problemer undgås også ved at indbefatte en udadvendende promotoren i den selekterbare markør. Dette SPA-tagging fremgangsmåde er effe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af midler fra den canadiske Institut for Innovation, Genome Canada, Ontario Genomics Institute, Ontario Ministeriet for Innovation, og den canadiske Institutes of Health Research tilskud til JG og AE The Red-udtrykkende E. coli-stamme DY330 var en slags gave fra Donald L. Court (National Cancer Institute, Frederick, MD).

Materials

Materials Vendor and Catalog Numbers  
      I. Antibiotics
Kanamycin Bioshop #KAN201  
Ampicillin Bioshop #AMP201  
      2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone Bioshop #TRP 402  
Yeast extract Bioshop #YEX 555  
Glycerol Bioshop #GLY 002  
K2HPO4 Bioshop #PPM 302  
KH2PO4 Bioshop #PPM 303  
      3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330   Yu et al. (2000)10  
pJL148   Zeghouf et al. (2004)7  
      4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase Fermentas # EP0281  
10 X PCR buffer Fermentas # EP0281  
10 mM dNTPs Fermentas # EP0281  
25 mM MgCl2 Fermentas # EP0281  
Agarose Bioshop # AGA002  
Loading dye NEB #B7021S  
Ethidium bromide Bioshop # ETB444  
10X TBE buffer Thermo Scientific #28355  
Tris Base Bioshop #TRS001  
Boric acid Bioshop #BOR001  
0.5 M EDTA (pH 8.0) Sigma # E6768  
DNA ladder NEB #N3232L  
      5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit Qiagen #12143  
QIAquick PCR purification kit Qiagen #28104  
      6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler BioRad iCycler  
Agarose gel electrophoresis BioRad    
Electroporator Bio-Rad GenePulser II  
0.2 cm electroporation cuvette Bio-Rad    
42 °C water bath shaker   Innova 3100  
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge Beckman Coulter TS-5.1-500  
32 °C Shaker New Brunswick Scientific, USA    
32 °C large Shaker New Brunswick Scientific, USA    
32 °C plate incubator Fisher Scientific    
      7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide Bio-Rad #161-0125  
Ammonium persulfate Bioshop # AMP001  
n-butanol Sigma # B7906  
TEMED Bioshop #TEM001  
Whatman No. 1 filter paper Fischer Scientific #09-806A  
Mini protean 3 cell Bio-Rad #165-3301  
iBlot gel transfer device Invitrogen #IB1001  
Nitrocellulose membranes Bio-Rad #162-0115  
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody Sigma #F3165  
Horseradish peroxidase Amersham #NA931V  
Pre-stained protein molecular weight standards Bio-Rad #161-0363  
Chemiluminescence reagent PIERCE #1856136  
Autoradiography film Clonex Corp #CLEC810  
Quick Draw blotting paper Sigma #P7796  
C2 platform rocking shaker New Brunswick Scientific, USA    
      8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator Branson Ultrasonic #23395  
NaCl Bioshop #SOD001  
Protease inhibitors Roche #800-363-5887  
0.5 mM TCEP-HCl Thermo Scientific #20490  
      9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column Bio-Rad #732-6008  
Benzonase nuclease Novagen #70746  
Anti-FLAG M2 agarose beads Sigma #A2220  
Calmodulin-sepharose beads GE Healthcare #17-0529-01  
TEV protease Invitrogen #12575-015  
Triton X-100 Sigma #T9284  
CaCl2 Sigma #C2661  
EGTA Sigma #E3889  
LabQuake Shaker Thermolyne #59558  
      10. Silver Staining Reagents
Methanol Bioshop #MET302  
Acetic acid Bioshop t#ACE222  
Sodium-thiosulfate Sigma #S-7143  
Silver nitrate Fischer Scientific #S181-100  
Formaldehyde Bioshop #FOR201  
Sodium carbonate Bioshop #SOC512  
      11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega # V5280  
50 mM NH4HCO3 Bioshop #AMC555  
1 mM CaCl2 Bioshop #CCL302  
Acetonitrile Sigma #A998-4  
Formic acid Sigma #F0507  
HPLC grade water Sigma #95304  
Iodoacetamide Sigma #16125  
Millipore Zip-Tip Millipore # ZTC18M960  
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin Phenomenex    
Proxeon nano HPLC pump Thermo Fisher Scientific    
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer   Thermo Fisher Scientific  
      12. Labware
4 liter conical flasks VWR #89000-372  
50 ml polypropylene falcon tubes Any Vendor    
1.5 ml micro-centrifuge tubes Any Vendor    
250 ml conical flaks VWR #29140-045  
15 ml sterile culture tubes Thermo Scientific #366052  
Cryogenic vials VWR #479-3221  
-80 °C freezer Fisher Scientific #13-990-14  
Speed vacuum system Thermo Scientific    
     

Buffers and Solutions

1. 1 liter Terrific Broth (TB) media

11 g Bio-Tryptone
22 g Yeast Extract
2% Glycerol
50 ml potassium salt stock solution

2. Potassium Salt Stock Solution

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. Sonication Buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
10% Glycerol
Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

5. TEV cleavage buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

6. Calmodulin binding buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

7. Calmodulin wash buffer

30 mM Tris-HCl pH 7.9
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. Calmodulin elution buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
100 mM NaCl
10 mM EGTA
0.1-0.5 mM TCEP

9. Developing solution (1L)

37% Formaldehyde
30 g sodium carbonate
1000 ml distilled water

10. Digestion buffer

50 mM NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. Wetting and Equilibration solution

70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid

12. Washing solution

100% H2O in 0.1% formic acid

References

  1. Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
  2. Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
  3. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  4. Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
  5. Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
  6. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
  7. Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
  8. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  9. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  10. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
  11. Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
  12. Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
  13. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
  14. Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).

Play Video

Cite This Article
Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).

View Video