Summary

تحديد بروتين في مجمعات<em> كولاي</em> استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Published: November 12, 2012
doi:

Summary

تنقية البروتينات من تقارب الموسومة بالاشتراك مع مطياف الكتلة (الألغام المضادة للأفراد) هو وسيلة قوية لرسم خرائط منهجية لشبكات التفاعل البروتين وعن التحقيق في أساس الآلية من العمليات البيولوجية. هنا، نحن تصف والأمثل متتابعة الببتيد تقارب الإجراء الألغام المضادة للأفراد (SPA) وضعت لبكتيريا<em> كولاي</em> التي يمكن استخدامها لعزل وتوصيف البروتين مستقرة متعددة لمجمعات بالقرب من التجانس بدءا من أرقام حتى نسخة منخفضة لكل خلية.

Abstract

حيث أن معظم عمليات توسط الخليوي عن الجمعيات الجزيئات، وتحديد منهجية للبروتين البروتين التفاعلات (PPI) وتحديد تكوين الوحيدات من البروتين المجمعات متعددة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظائف الجينات وتعزيز فهم النظم البيولوجية 1 و 2. يمكن تعيين التفاعلات المادية مع ارتفاع العزلة vialarge النطاق الثقة وتوصيف البروتين المجمعات المحلية تحت ظروف شبه الفسيولوجية على أساس تنقية تقارب من البروتينات صبغويا الموسومة بالاشتراك مع مطياف الكتلة (الألغام المضادة للأفراد). وقد تم تطبيق هذا النهج بنجاح في الكائنات المتنوعة تطويريا، بما في ذلك الخميرة والذباب، والديدان، وخلايا الثدييات، والبكتيريا 1-6. على وجه الخصوص، قد ولدت لدينا محطة كربوكسي لتقارب الببتيد متتابعة (SPA) نظام ثنائي لوضع علامات تقارب تنقية البروتين المجمعات الأصلية من مثقف كولاي سالبة الجرام، وذلك باستخدام جنرال الكتريكnetically-لين العريكة سلالات مختبر المضيفة التي يتم مناسبة تماما للالجينوم على نطاق التحقيقات في البيولوجيا الأساسية وعمليات الحفظ من بدائيات النوى 1، 2، 7. لدينا نظام العنونة SPA مماثل للأسلوب تنقية جنبا إلى جنب تقارب وضعت أصلا للخميرة 8، 9، ويتكون من الببتيد ملزمة كالمودولين (CBP)، يليه موقع الانقسام البروتيني للفيروس التبغ محددة للغاية حفر (TEV) وثلاث نسخ من حاتمة FLAG (FLAG 3X)، والسماح لجولتين متتاليتين لتخصيب تقارب. بعد التضخيم راديو كاسيت، تتكامل تسلسل محدد الخطية المنتجات PCR-SPA ترميز علامة وعلامة اختيار في الإطار أعرب وكما كربوكسي لمحطة اندماج في خلفية DY330 التي يسببها عابر للتعبير عن ذات كفاءة عالية لامدا عاثية مغاير إعادة التركيب نظام 10. الخطوة اللاحقة ثنائي تنقية باستخدام كالمودولين والخرز تقارب مكافحة FLAG تمكن انتقائية للغايةوالانتعاش كفاءة منخفضة حتى مجمعات البروتين وفرة من الثقافات على نطاق واسع. ثم يتم استخدام مطياف الكتلة جنبا إلى جنب لتحديد ثابت شارك في تنقية البروتينات مع حساسية عالية (الأقل حدود الكشف نانوغرام).

هنا، نحن تصف مفصلة خطوة بخطوة الإجراءات التي نستخدمها عادة للمنهجية تنقية البروتين، ووضع علامات قياس الطيف الكتلي على أساس تحليل المجمعات البروتين للذوبان من E. كولاي، والتي يمكن الارتقاء بها ومصممة يحتمل أن الأنواع البكتيرية الأخرى، بما في ذلك بعض مسببات الأمراض الانتهازية التي هي قابلة للrecombineering. يمكن للتفاعلات الناجمة المادية كثيرا ما تكشف مكونات غير متوقعة للاهتمام والاتصالات اقتراح روابط آليا الرواية. دمج البيانات مع البيانات البديلة PPI جمعية الجزيئية مثل تفاعل (الجينات الجين) الوراثي الجيني و-السياق (GC) التنبؤات يمكن أن يسهل استجلاء هذه المنظمة العالمية الجزيئية المتعددة البروتين داخل المجمعات ثنائيةological مسارات. شبكات توليد E. ويمكن استخدام القولونية إلى التبصر في العمارة الفنية للمنتجات الجين في orthologous الميكروبات الأخرى التي تعاني من نقص وظيفي الشروح حاليا.

Protocol

1. بناء الجينات المحددة في وضع العلامات SPA E. القولونية سلالة DY330 يتم استخدام البلازميد pJL148 يشمل تسلسل DNA-SPA علامة وعلامة الكاناميسين المقاومة للمضادات الحيوية كاسيت (اساسه R) كقالب في تفاعل البلمرة المتسلسل (PC…

Representative Results

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon…

Discussion

أحد الجوانب الرئيسية لنهج القائم على الألغام المضادة للأفراد SPA الموصوفة هنا هو أن يتم تنفيذ علامات في السياق الطبيعي الكروموسومات، وبالتالي ضمان تنظيم الجينات العادية يتم الاحتفاظ (أي. المروج الطعم الأصلي الحفاظ عليها، وبالتالي لا قلق مستويات التعبير) والأم ث…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل الأموال من المؤسسة الكندية للإبداع وكندا الجينوم، ومعهد أونتاريو علم الجينوم، وزارة أونتاريو للابتكار، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة ومنحة لJG AE E. والأحمر، معربا عن كان القولونية سلالة DY330 هدية من نوع دونالد L. المحكمة (المعهد الوطني للسرطان، فريدريك، MD).

Materials

Materials Vendor and Catalog Numbers  
      I. Antibiotics
Kanamycin Bioshop #KAN201  
Ampicillin Bioshop #AMP201  
      2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone Bioshop #TRP 402  
Yeast extract Bioshop #YEX 555  
Glycerol Bioshop #GLY 002  
K2HPO4 Bioshop #PPM 302  
KH2PO4 Bioshop #PPM 303  
      3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330   Yu et al. (2000)10  
pJL148   Zeghouf et al. (2004)7  
      4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase Fermentas # EP0281  
10 X PCR buffer Fermentas # EP0281  
10 mM dNTPs Fermentas # EP0281  
25 mM MgCl2 Fermentas # EP0281  
Agarose Bioshop # AGA002  
Loading dye NEB #B7021S  
Ethidium bromide Bioshop # ETB444  
10X TBE buffer Thermo Scientific #28355  
Tris Base Bioshop #TRS001  
Boric acid Bioshop #BOR001  
0.5 M EDTA (pH 8.0) Sigma # E6768  
DNA ladder NEB #N3232L  
      5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit Qiagen #12143  
QIAquick PCR purification kit Qiagen #28104  
      6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler BioRad iCycler  
Agarose gel electrophoresis BioRad    
Electroporator Bio-Rad GenePulser II  
0.2 cm electroporation cuvette Bio-Rad    
42 °C water bath shaker   Innova 3100  
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge Beckman Coulter TS-5.1-500  
32 °C Shaker New Brunswick Scientific, USA    
32 °C large Shaker New Brunswick Scientific, USA    
32 °C plate incubator Fisher Scientific    
      7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide Bio-Rad #161-0125  
Ammonium persulfate Bioshop # AMP001  
n-butanol Sigma # B7906  
TEMED Bioshop #TEM001  
Whatman No. 1 filter paper Fischer Scientific #09-806A  
Mini protean 3 cell Bio-Rad #165-3301  
iBlot gel transfer device Invitrogen #IB1001  
Nitrocellulose membranes Bio-Rad #162-0115  
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody Sigma #F3165  
Horseradish peroxidase Amersham #NA931V  
Pre-stained protein molecular weight standards Bio-Rad #161-0363  
Chemiluminescence reagent PIERCE #1856136  
Autoradiography film Clonex Corp #CLEC810  
Quick Draw blotting paper Sigma #P7796  
C2 platform rocking shaker New Brunswick Scientific, USA    
      8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator Branson Ultrasonic #23395  
NaCl Bioshop #SOD001  
Protease inhibitors Roche #800-363-5887  
0.5 mM TCEP-HCl Thermo Scientific #20490  
      9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column Bio-Rad #732-6008  
Benzonase nuclease Novagen #70746  
Anti-FLAG M2 agarose beads Sigma #A2220  
Calmodulin-sepharose beads GE Healthcare #17-0529-01  
TEV protease Invitrogen #12575-015  
Triton X-100 Sigma #T9284  
CaCl2 Sigma #C2661  
EGTA Sigma #E3889  
LabQuake Shaker Thermolyne #59558  
      10. Silver Staining Reagents
Methanol Bioshop #MET302  
Acetic acid Bioshop t#ACE222  
Sodium-thiosulfate Sigma #S-7143  
Silver nitrate Fischer Scientific #S181-100  
Formaldehyde Bioshop #FOR201  
Sodium carbonate Bioshop #SOC512  
      11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega # V5280  
50 mM NH4HCO3 Bioshop #AMC555  
1 mM CaCl2 Bioshop #CCL302  
Acetonitrile Sigma #A998-4  
Formic acid Sigma #F0507  
HPLC grade water Sigma #95304  
Iodoacetamide Sigma #16125  
Millipore Zip-Tip Millipore # ZTC18M960  
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin Phenomenex    
Proxeon nano HPLC pump Thermo Fisher Scientific    
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer   Thermo Fisher Scientific  
      12. Labware
4 liter conical flasks VWR #89000-372  
50 ml polypropylene falcon tubes Any Vendor    
1.5 ml micro-centrifuge tubes Any Vendor    
250 ml conical flaks VWR #29140-045  
15 ml sterile culture tubes Thermo Scientific #366052  
Cryogenic vials VWR #479-3221  
-80 °C freezer Fisher Scientific #13-990-14  
Speed vacuum system Thermo Scientific    
     

Buffers and Solutions

1. 1 liter Terrific Broth (TB) media

11 g Bio-Tryptone
22 g Yeast Extract
2% Glycerol
50 ml potassium salt stock solution

2. Potassium Salt Stock Solution

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. Sonication Buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
10% Glycerol
Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

5. TEV cleavage buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

6. Calmodulin binding buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

7. Calmodulin wash buffer

30 mM Tris-HCl pH 7.9
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. Calmodulin elution buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
100 mM NaCl
10 mM EGTA
0.1-0.5 mM TCEP

9. Developing solution (1L)

37% Formaldehyde
30 g sodium carbonate
1000 ml distilled water

10. Digestion buffer

50 mM NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. Wetting and Equilibration solution

70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid

12. Washing solution

100% H2O in 0.1% formic acid

References

  1. Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
  2. Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
  3. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  4. Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
  5. Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
  6. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
  7. Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
  8. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  9. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  10. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
  11. Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
  12. Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
  13. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
  14. Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).

Play Video

Cite This Article
Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).

View Video