Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

تحديد بروتين في مجمعات doi: 10.3791/4057 Published: November 12, 2012

Summary

تنقية البروتينات من تقارب الموسومة بالاشتراك مع مطياف الكتلة (الألغام المضادة للأفراد) هو وسيلة قوية لرسم خرائط منهجية لشبكات التفاعل البروتين وعن التحقيق في أساس الآلية من العمليات البيولوجية. هنا، نحن تصف والأمثل متتابعة الببتيد تقارب الإجراء الألغام المضادة للأفراد (SPA) وضعت لبكتيريا

Abstract

حيث أن معظم عمليات توسط الخليوي عن الجمعيات الجزيئات، وتحديد منهجية للبروتين البروتين التفاعلات (PPI) وتحديد تكوين الوحيدات من البروتين المجمعات متعددة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظائف الجينات وتعزيز فهم النظم البيولوجية 1 و 2. يمكن تعيين التفاعلات المادية مع ارتفاع العزلة vialarge النطاق الثقة وتوصيف البروتين المجمعات المحلية تحت ظروف شبه الفسيولوجية على أساس تنقية تقارب من البروتينات صبغويا الموسومة بالاشتراك مع مطياف الكتلة (الألغام المضادة للأفراد). وقد تم تطبيق هذا النهج بنجاح في الكائنات المتنوعة تطويريا، بما في ذلك الخميرة والذباب، والديدان، وخلايا الثدييات، والبكتيريا 1-6. على وجه الخصوص، قد ولدت لدينا محطة كربوكسي لتقارب الببتيد متتابعة (SPA) نظام ثنائي لوضع علامات تقارب تنقية البروتين المجمعات الأصلية من مثقف كولاي سالبة الجرام، وذلك باستخدام جنرال الكتريكnetically-لين العريكة سلالات مختبر المضيفة التي يتم مناسبة تماما للالجينوم على نطاق التحقيقات في البيولوجيا الأساسية وعمليات الحفظ من بدائيات النوى 1، 2، 7. لدينا نظام العنونة SPA مماثل للأسلوب تنقية جنبا إلى جنب تقارب وضعت أصلا للخميرة 8، 9، ويتكون من الببتيد ملزمة كالمودولين (CBP)، يليه موقع الانقسام البروتيني للفيروس التبغ محددة للغاية حفر (TEV) وثلاث نسخ من حاتمة FLAG (FLAG 3X)، والسماح لجولتين متتاليتين لتخصيب تقارب. بعد التضخيم راديو كاسيت، تتكامل تسلسل محدد الخطية المنتجات PCR-SPA ترميز علامة وعلامة اختيار في الإطار أعرب وكما كربوكسي لمحطة اندماج في خلفية DY330 التي يسببها عابر للتعبير عن ذات كفاءة عالية لامدا عاثية مغاير إعادة التركيب نظام 10. الخطوة اللاحقة ثنائي تنقية باستخدام كالمودولين والخرز تقارب مكافحة FLAG تمكن انتقائية للغايةوالانتعاش كفاءة منخفضة حتى مجمعات البروتين وفرة من الثقافات على نطاق واسع. ثم يتم استخدام مطياف الكتلة جنبا إلى جنب لتحديد ثابت شارك في تنقية البروتينات مع حساسية عالية (الأقل حدود الكشف نانوغرام).

هنا، نحن تصف مفصلة خطوة بخطوة الإجراءات التي نستخدمها عادة للمنهجية تنقية البروتين، ووضع علامات قياس الطيف الكتلي على أساس تحليل المجمعات البروتين للذوبان من E. كولاي، والتي يمكن الارتقاء بها ومصممة يحتمل أن الأنواع البكتيرية الأخرى، بما في ذلك بعض مسببات الأمراض الانتهازية التي هي قابلة للrecombineering. يمكن للتفاعلات الناجمة المادية كثيرا ما تكشف مكونات غير متوقعة للاهتمام والاتصالات اقتراح روابط آليا الرواية. دمج البيانات مع البيانات البديلة PPI جمعية الجزيئية مثل تفاعل (الجينات الجين) الوراثي الجيني و-السياق (GC) التنبؤات يمكن أن يسهل استجلاء هذه المنظمة العالمية الجزيئية المتعددة البروتين داخل المجمعات ثنائيةological مسارات. شبكات توليد E. ويمكن استخدام القولونية إلى التبصر في العمارة الفنية للمنتجات الجين في orthologous الميكروبات الأخرى التي تعاني من نقص وظيفي الشروح حاليا.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. بناء الجينات المحددة في وضع العلامات SPA E. القولونية سلالة DY330

  1. يتم استخدام البلازميد pJL148 يشمل تسلسل DNA-SPA علامة وعلامة الكاناميسين المقاومة للمضادات الحيوية كاسيت (اساسه R) كقالب في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) التضخيم 7. ال 45 NT الجينات المحددة التمهيدي إلى الأمام، وتقع المنبع مباشرة من المحطة كودون الهدف الجينات في الإطار مع بي بي في 27 ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) التمهيدي إلى الأمام علامة محددة، وقدرها 45 NT الجينات المحددة التمهيدي العكسي، وتقع مباشرة وتستخدم محطة المصب من كودون الهدف الجينات في الإطار مع بي بي 27 (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') علامة التمهيدي عكس محددة، لتضخيم علامة SPA-R كاسيت واساسه من pJL148 باستخدام PCR التالية الدراجات الظروف: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 30 ° C دورات 94 لل1 دقيقة و 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة 2 ثانية، تليها C ° 68 لمدة 10 دقيقة. هذه المتتاليات تضخيم خدمةق ركائز لعرض ectopically λ الأحمر آلات إعادة التركيب مثلي (انظر أدناه).
  2. يتم تنقيته من المنتج PCR PCR باستخدام تنقية Qiaquick عدة لإزالة الأملاح التي قد تتداخل مع الصعق الكهربائي. ويستهدف المنتج PCR في وقت لاحق إلى دمج المنقى في نهاية 3 '(المنبع مباشرة من كودون وقف الأم) من جين معين في DY330 سلالة وهو ما يعبر عنه في آلية إعادة التركيب λ الأحمر 10.
  3. ويزرع في DY330 λ الأحمر معربا عن سلالة بين عشية وضحاها في 2 مل المتوسطة (LB) لوريا Bertani-C ° 32 في بهز في 180 دورة في الدقيقة. وفيما بعد تلقيح 1 مل من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 70 مل المتوسطة LB جديدة في قارورة 500 مل المخروطية. ويزرع على اللقاح في C ° 32 عن طريق هز في 180 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى 600 OD ~ 0.8.
  4. يتم نقل الثقافة في قارورة جديدة 250 مل المخروطية، حيث يسببها الخلايا عن طريق احتضان القارورة في حمام مائي في 42 ° C عن طريق هز بلطف على180 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. مباشرة بعد الاستقراء، وحضنت القارورة في حمام الطين جليد الماء لمدة لا تقل 30 دقيقة مع اهتزاز.
  5. وعلى الفور انتقلت ثقافة الجليد الباردة إلى ما قبل 50 مل أنبوب المبرد البولي بروبلين وتعرض للالطرد المركزي في 3993 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. وبيليه معلق الخلية في 50 الماء المثلج مل العقيمة وطرد مرة أخرى في 3993 x ج لمدة 6 دقائق في C. ° 4 ومعلق ثم بيليه خلية في 1 مل من الماء البارد ونقل إلى أنبوب 1.5 مل Effendorf، وطرد في أقصى سرعة لمدة 20 ثانية في C. ° 4 بعد دورتين أو ثلاث خطوات الغسيل بالماء البارد الجليد، ومعلق على بيليه الخلية وأخيرا في 700 ميكرولتر من الماء المثلج العقيمة، مما أدى إلى الخلايا الكهربائية المختصة.
  6. من خلال الصعق الكهربائي، وقدم أحد ميكرولتر من AMPLICON المنقى إلى 40 ميكرولتر من الخلايا الكهربائية المختصة. وelectroporated الخلايا في الثاني GenePulser بيو راد مع الإعدادات التالية: 2.5 كيلو فولت، 25 المكثف مع نبضتحكم من 200 Ω. بعد إعادة التركيب مثلي والتكامل، يتم تحديد معاد بنجاح transformants أن العلامة / راديو كاسيت في الكروموسوم على أساس المقاومة لكان (الشكل 1A). ويتم اختيار transformants متعددة لغربي النشاف للتحقق من الجيل الصحيح (أي إشارة إيجابية) من SPA-الموسومة البروتينات الانصهار مع الأجسام المضادة لمكافحة FLAG M2 وهذا هو انتقائية ضد الحواتم علم TAG-SPA.
  7. وأكد مثقف كربوكسي سلالة محطة الانصهار SPA-علامة على نطاق واسع لعزل بروتين قابل للذوبان المجمعات تحصد من الخلايا باستخدام بروتوكول تنقية SPA. ويظهر الخطوط العريضة للخطوات التي ينطوي عليها إجراء تنقية تقارب العلامة في الشكل 1B.

2. زراعة وصوتنة

  1. تطعيم 100 ميكرولتر من E. SPA-الموسومة القولونية الأسهم الجلسرين إلى 50 مل مرق رائع (TB) وسط سائل تستكمل مع 50 ميكرولتر من 25 ميكروغرام / مل سو اساسه حل في قارورة 250 مل المخروطية. تنمو بين عشية وضحاها في ثقافة C. ° 32
    ملاحظة: بما أن درجة حرارة كاسيت λ-محرض الأحمر في سلالة DY330 تحت سيطرة كاظمة حساسة للحرارة 10، ويزرع في كولاي SPA-الموسومة سلالة في C. ° 32
  2. نقل 10 مل من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 990 مل الطازجة TB تستكمل مع 25 ميكروغرام / مل من اساسه في قارورة لتر 4. ويزرع ثقافة في 32 ° C مع ثابت تهتز في 250 دورة في الدقيقة، لمدة 5 إلى 6 ساعة، حتى تصل إلى 600 OD ~ 2 إلى 3.
  3. نقل E. 1 لتر القولونية SPA-علامة لتنظيف الزجاجات الثقافة الطرد المركزي وتدور الخلايا في 4 درجات مئوية في بيكمان J6-HC الطرد المركزي @ 3993 x ج لمدة 15 دقيقة.
  4. تتم إزالة طاف من زجاجات الطرد المركزي. إعادة تعليق على E. الكريات الخلايا القولونية مع 25 مل من العازلة صوتنة. ضمان للحفاظ على زجاجات الطرد المركزي على الجليد في جميع الأوقات.
  5. معلق بيليه هونقل إلى أنبوب 50 مل الصقر البولي بروبلين وجمدت باستخدام النيتروجين السائل. يتم تخزين الخلايا المجمدة في -80 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل الاستخدام.
  6. قبل صوتنة، ذوبان الجليد تماما الخلايا المجمدة عن طريق الحفاظ على الكريات على الجليد. يتم نقل عينات لإذابة الفولاذ المقاوم للصدأ كوب عقيمة وضعت على الجليد لصوتنة. هي غارقة التحقيق في العينة وsonicated لمدة 3 دقائق. يسمح إضافية لتبريد 2 دقيقة العينة من ارتفاع درجة الحرارة.
  7. يتم نقل lysate الخلية في أنبوب sonicated قبل الطرد المركزي المبردة العقيمة، وتعرض ل° C الطرد المركزي في 4 في أجهزة الطرد المركزي بيكمان باستخدام JA-17 @ 35267 XG الدوار (16،000 دورة في الدقيقة) لمدة 15 دقيقة مرتين.
    ملاحظة: في حالة تنقية البروتين الغشاء، ويتم طرد lysate الخلية sonicated مرة واحدة فقط لمدة 15 دقيقة لأننا لا نعرف في أي جزء من غشاء البروتينات، أي إما في بيليه أو في جزء طاف. لتجنب خسارة تتجاوز مالبروتينات الغشاء، ونحن تدور الخلايا لمدة 15 دقيقة في الطرد المركزي عالية السرعة وتتم معالجتها في وقت لاحق لتنقية طاف (انظر الخطوات أدناه) حيث يتم استخدام المنظفات 1٪ إلى ذوبان البروتينات الغشاء.
  8. يتم نقل بعناية طاف من أنبوب إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل فالكون البولي بروبلين وجمدت باستخدام النيتروجين السائل. يتم تخزين الخلايا المجمدة استخراج sonicated لمدة أقصاها 6 أشهر في C ° -80 لاستخدامها في المستقبل.

3. تقارب تنقية

  1. قبل الاستخدام، وغسل 100 ميكرولتر من الخرز مكافحة العلم M2 بنسبة 10 مجلدا من AFC العازلة (30 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 150 مم كلوريد الصوديوم، والمنظفات بنسبة 0.1٪، و0،1-0،5 ملم TCEP [تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين - حمض الهيدروكلوريك]) دون المنظفات والحد من TCEP عامل (تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين).
  2. وإذابة المجمدة، واستخراج الخلايا sonicated عن طريق وضع أنبوب في الماء البارد. وحضنت استخراج خلية إذابة مع 3 ميكرولتر من بنزوnase نوكلياز لمدة 30 دقيقة في C. ° 4 لهذا الخليط، إضافة المنظفات غير الأيونية تريتون X-100 (تركيز النهائي من المنظفات يجب أن يكون 0.1٪) و 200 ميكرولتر تعليق المضادة للعلم الخرز الاغاروز M2.
    ملاحظة: للحصول على جميع التنقيات البروتين القابلة للذوبان، 0.1٪ تريتون X يستخدم لتقليل-100 غير محددة الامتزاز، حيث كما لتنقية بروتين الغشاء، خفيفة مختلفة المنظفات غير الأيونية، مثل C12E8 (Octaethylene الأثير دوديسيل جليكول)، DDM ( ويمكن استخدام N-دوديسيل β-D-مالتوزيد) والمالتوز-neopentyl غليكول (MNG) بتركيز 1٪ المنظفات لتعزيز الانحلالية. منذ المنظفات المختلفة متفاوتة الكفاءة الانحلالية للبروتينات الغشاء، فمن المستحسن لأداء التنقيات البروتين مستقلة تستخدم أكثر من المنظفات.
  3. يتم خلط محتويات بلطف عن طريق تناوب أنبوب لمدة 3 ساعة في 4 درجات مئوية باستخدام شاكر LabQuake. بعد 3 ساعة من الدوران، يتم طرد الأنبوب في 1700 x ج لمدة 6 دقائق. ثم طاف هو Removed بعناية، قدر الإمكان، من دون إزعاج فضفاضة حبة بيليه.
  4. وبيليه معلق في طاف المتبقية ثم نقل إلى 0.8 * 4 سم بيو راد العمود الإعدادية البولي بروبلين. ضمان لإزالة المقابس مخرج الجزء السفلي من العمود، للسماح للeluates لاستنزاف من قبل تدفق الجاذبية. غسل العمود 5 مرات مع خطوة الانقسام TEV.
  5. بعد افراغ eluates غسلها، يتم إغلاق منفذ أسفل العمود. لنفس العمود، يتم تنفيذ الانقسام عن طريق إضافة ~ 5 حتي 10 ميكرولتر (50 وحدة) من الأنزيم البروتيني TEV و 400 ميكرولتر من العازلة AFC 1X على العمود. ضمان لإغلاق أعلى العمود مع قبعة. وتناوب العمود الذي يحتوي على حبات بلطف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية خلال الليل باستخدام شاكر LabQuake.
  6. إزالة الغطاء على الجزء العلوي والمكونات منفذ في الجزء السفلي من العمود، واستنزاف eluates عافيتها بعد انشقاق TEV في عمود الطازجة تحتوي على 200 ميكرولتر من تعليق كالمودولين-sepharose و الخرز، التي يتم غسلها بنسبة 10حجم المخزن المؤقت كالمودولين ملزمة.
  7. يتم تثبيتها على كل من أعلى وأسفل العمود بإحكام، ويتم خلط محتويات العمود بلطف عن طريق تناوب لمدة 3 ساعة في 4 درجات مئوية باستخدام شاكر LabQuake.
  8. بعد 3 ساعة التناوب، واستنزفت شطافة عن طريق إزالة الغطاء العلوي والمكونات السفلي من العمود. يتم غسل العمود أربع مرات مع 200 ميكرولتر من العازلة ملزمة كالمودولين 1X ثم وغسل صرامة مع 400 ميكرولتر من العازلة غسل كالمودولين.
  9. ومزال البروتين محددة في أربعة أجزاء من 50 ميكرولتر في أنبوب إيبندورف 1X العازلة جديد يعتمد شطف كالمودولين. يتم توزيع جزء مزال في اثنين من أنابيب إيبندورف نظيفة في أحجام متساوية. يتم تجفيفها بعد ذلك باستخدام كل من أنابيب فراغ السرعة.
  10. يتم استخدام المجفف شطافة من أنبوب واحد لتشغيل هلام تلطيخ الفضة، في حين يتم تخزين أخرى في C ° -80، قبل استخدام مطياف الكتلة.

4. الفضة تلوين

  1. للفضة stainiنانوغرام، يضاف نصف حجم SDS 3X (كبريتات الصوديوم دوديسيل) عينة العازلة إلى 50 ميكرولتر من شطافة المجففة. بعد غلي الخليط لمدة 5 دقائق، يتم تحميل العينات على هلام بولكرلميد SDS.
  2. بعد انتهاء تشغيل هلام، يتم وضع بعناية في حل تثبيت (الميثانول 50٪ وحامض الخليك 10٪) وتحريكها بلطف على شاكر دوارة لمدة 20 دقيقة. يتم شطف ثم جل في الإيثانول 20٪ لمدة 10 دقيقة.
  3. يتم غسل هلام الثابتة بدقة مرتين مع 500 مل من الماء المقطر مزدوجة لمدة 10 دقيقة للتأكد من انخفاض خلفية موحدة.
  4. يتم تحريكها بلطف ثم جل 500 مل في ثيوسلفات الصوديوم لمدة 1 دقيقة، تليها خطوتين الغسيل مع الماء المقطر لمدة 20 ثانية.
  5. يتم تجاهل المياه، وحضنت الجل في 200 مل من نترات الفضة 0.1٪ لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك الوقت، تتم إزالة نترات الفضة ويتم غسل هلام مع الماء المقطر لمدة 20 ثانية لإزالة نترات الفضة الزائدة.
  6. واخيرا ومن الجل تحريكها في 75 ملمن الحل النامية. عندما يتحقق شدة المطلوب، يتم تجاهل الحل النامية ويضاف 80 مل من حمض الخليك لوقف رد الفعل. ضمان لاحتضان الجل في حامض الخليك مدة لا تقل عن 20 دقيقة لتصور سليم من العصابات هلام.

5. التحلل البروتيني وتحضير العينة لقياس الطيف الكتلي

  1. إلى عينة المجففة، إضافة 50 ميكرولتر من العازلة ميكرولتر الهضم و 0.9 100 مم TCEP، حمض الهيدروكلوريك (تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين - حمض الهيدروكلوريك) واحتضان الخليط لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للخطوة التخفيض. المقبل، يتم إضافة 1 ميكرولتر من iodoacetamide 500 مم وحضنت في الظلام لمدة 40 دقيقة للسماح للألكلة العينة.
  2. بعد الجولة الثانية من الحضانة، إضافة 1 ميكروغرام من التربسين يجمد الخليط لاحتضان وإما في C ° 37 ساعة لمدة 5 أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. ضمان لوقف رد فعل من خلال إضافة 1 ميكرولتر من حمض الخليك.
  3. قبل الرطب Millipoتلميح ماصة إعادة الرمز البريدي تلميح بواسطة الشفط 10 ميكرولتر من حل التبول وموازنة. الاستغناء الحل لنضيعه. نضح في وقت لاحق 10 ميكرولتر من الحل الغسيل والاستغناء الحل لنضيعه. كرر هذه الخطوة مرتين.
  4. للربط الفعال للخليط الببتيد إلى الطرف، مزيج ماصة الخليط الببتيد 20 مرة. يتم غسل الخليط الببتيد التي انضمت إلى تلميح قبالة عن طريق الشفط والاستغناء الحل الغسيل. كرر هذا الإجراء مرتين للربط الفعال للخليط الببتيد إلى الحافة.
  5. مع تلميح التي تحتوي على الببتيد محدد، نضح 10 ميكرولتر من حل التبول وموازنة، والاستغناء في أنبوب إيبندورف نظيفة. كرر هذه الخطوة مرتين. بعد تجفيف العينات مزال في الفراغ سرعة، يمكن تحليل العينات على الفور من قبل مطياف الكتلة أو تخزينها في -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.

6. تحديد بروتين عن طريق مطياف الكتلة Orbitrap LTQ Velos

اليتم تحديد المكونات الإلكترونية ببتيد من المجمعات المعزولة باستخدام Orbitrap LTQ Velos الشامل جنبا إلى جنب مطياف الهجين. وOrbitrap لديه السلطة لحل استثنائية (> 60000 العرض الكامل نصف الحد الأقصى، أو FWHM) ودقة الشامل (<2 جزء في المليون) التي تقلل MS / MS أخذ العينات من الملوثات غير ذي صلة الخلفية غير محددة في الكشف عن التنقيات السيطرة، في حين أن عالية السرعة فخ أيون Velos يمكن الكشف عن مكون والببتيدات جزء فرة منخفضة باستخدام كل من الإلكترون والتفكك نقل التصادم الناجم عن وسائط التفكك. يتم تعيين ثقة عالية بين المباريات مما أدى MS / MS الأطياف المرجعية لE. تسلسل البروتين القولونية باستخدام قاعدة بيانات خوارزمية البحث مثل SEQUEST وكل تسلسل مطابقة تقييمها خلال خوارزمية احتمال مثل STATQUEST 11. وتعتبر عدد الأطياف المجموع، تفرد تسلسل الببتيد والملوثات المشتركة الكشف عن خلفية في السيطرة السلبية (أي. همية) التنقيات لتحقيق انخفاض التجريبية كاذبة ديسمعدل covery. يتم تنفيذ الخطوات التالية لتحديد البروتين:

  1. كانت معبأة في الأعمدة الصغيرة مع 10 سم من ~ 3 ميكرومتر لونا-C 18 و الراتنج وتفاعل لايون Proxeon مصدر nanoelectrospray التي يتم وضعها وفقا لأداة Orbitrap.
  2. ويستخدم تدفق نانو Proxeon ثنائي HPLC مضخة لتقديم نصيحة تدفق مستقر معدل ~ 300 دقيقة -1 NL خلال فصل الببتيد.
  3. لتحقيق شطف الببتيد، يتم تعيين التدرج العازلة يصل العضوية وفقا لتعقيد العينة. على سبيل المثال، يتم عادة تعيين التدرج التالي لتصل E. عينات SPA القولونية: يتم زيادة B المذيبات من 2٪ إلى 6٪ في 1 دقيقة، إلى 24٪ في 38 دقيقة، إلى 100٪ في الحد الأدنى 4 التالي، الذي عقد في 100٪ لمدة 1 دقيقة، ثم انخفضت إلى 2٪ في 1 دقيقة، وعقد في النهائي 2٪ لمدة 15 دقيقة. الطور المتحرك مذيب A لديه 95٪ HPLC والمياه التدرج ACN 5٪ مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪، في حين B المذيبات والماء 5٪ التدرج HPLC وACN 95٪ مع المجلس الدولي للمطارات الفورميك بنسبة 0.1٪د. تم تعيين معدل التدفق في رأس الإبرة إلى 300 دقيقة -1 NL لمدة 60 دقيقة.
  4. كما دورات مطياف الكتلة تشغيل المسح الشامل من خلال واحدة كاملة في قرارات 60000، يتم جمع 10 تجزئة المسح الشامل جنبا إلى جنب يصاحب ذلك للأيونات السلائف على أشده. يتم تمكين استبعاد الحيوية، monoisotopic اختيار الشامل، وحيازة الصك في الوقت الحقيقي ميزات البيانات التابعة.
  5. يتم البحث الأطياف باستخدام خوارزمية البحث في قاعدة البيانات مثل SEQUEST مقابل قاعدة بيانات من E. يتم تصفية إحصائيا تسلسل البروتين القولونية، والنتيجة باستخدام خوارزمية احتمال مثل STAQUEST 11 إلى ضمان انخفاض معدل اكتشاف كاذبة. ويتم اختيار المرشحين الثقة العالية فقط (99٪ الاحتمال)، في حين تظهر مباريات أكثر من 10 جزء في المليون مقارنة الخطأ الشامل لكتلة الببتيد النظرية يتم استبعاد لمزيد من الدراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أحد الجوانب الرئيسية لنهج القائم على الألغام المضادة للأفراد SPA الموصوفة هنا هو أن يتم تنفيذ علامات في السياق الطبيعي الكروموسومات، وبالتالي ضمان تنظيم الجينات العادية يتم الاحتفاظ (أي. المروج الطعم الأصلي الحفاظ عليها، وبالتالي لا قلق مستويات التعبير) والأم ثابت المرتبطة يتم استرداد مجمعات البروتين في شبه الذاتية المستويات. وتجنب أيضا قضايا القطبية OPERON من قبل بما في ذلك المروج الموجهة ظاهريا في علامة اختيار. هذا النهج هو SPA العنونة فعالة بما فيه الكفاية لتنقية مكونات منخفضة فرة مجمعات لتجانس القريب، بما في ذلك الغشاء المرتبطة الجمعيات، حتى لو يتم التعبير عن مفارز وصولا الى جزيئات قليلة فقط في الخلية البكتيرية. وعموما، يمكن هذا البروتوكول بسهولة والارتقاء لتنقية مجموعات واسعة من البروتينات القابلة للذوبان في المفتاحية E. القولونية أو من حيث المبدأ أي تحولات الأنواع الأخرى البكتيرية التي عبر وضع علامات recombineering من الممكن، أو تلك التي تمتلك وبطبيعة الحال عاليةالقدرة نشوئها، مثل الراكدة، وهو العمود الفقري لعلم الوراثة البكتيرية الناشئة، التي استخدمت، على سبيل المثال، لبناء مكتبة سلالة من الجينات المستهدفة بالضربة القاضية 13.

A القلق الرئيسي الكامن في النهج على نطاق واسع البروتين هو تحديد interactors غير محددة منحل وزائفة التلوث أثر. رغم جولتين من التخصيب، لدينا التنقيات SPA الروتينية بانتظام كشف الملوثات المتكررة التي عادة ما تكون البروتينات عالية التدبير المنزلي وفرة، مثل البروتينات والريباسي المحرمين، الذي ربط غير على وجه التحديد إلى الراتنج الكروماتوغرافي والبروتينات / أو الطعم. ويمكن التخفيف من هذه المشكلة بطريقتين. أولا، يعتبر العدد الإجمالي الطيفية وتفرد كل البروتين مع تحديد الطعم وخاصة بالنسبة الى مجموعة أوسع من التنقيات من البروتين متعددة الطعوم وغير ذات صلة من untagged (نوع. أي البرية) سلالات المراقبة السلبية (أي. تنقية تقارب وهمية experiments) للحد من الجمعيات إيجابية كاذبة. ثانيا، ينبغي التحقق من صحة جميع التفاعلات البروتين باستخدام علامات المرشح المتبادلة وتنقية شريك الربط المفترضة، وذلك بهدف تأكيد مستقل التفاعلات البروتين البروتين الفردية لتجنب الحالات النادرة التي وجود مجتمع طلال أبوغزاله للSPA يشوش إدراج البروتينات في الأم الجمعية البروتين الذاتية.

وتقتصر القائمة على الألغام المضادة للأفراد المسوحات البروتين بسبب عدم وجود حساسية من حيث تحديد التفاعلات عابرة أو دون متكافئة. في مثل هذه الحالات، يمكن استخدام الإجراءات تنقية خطوة واحدة لتعزيز الكشف عن الشركاء الأضعف التفاعل. أثناء الدراسة المستمرة العقد، الطويل للE. interactome القولونية، رأينا الكشف عن قدرات جديدة الطيف الشامل الجيل التحسن باطراد. منحازة لتحديد الأدوات القديمة المتكررة وفيرة من البروتينات عالية، غالبا ما يحول دون الكشف عن أقل أبوndant ولكنها مهمة للغاية يحتمل أن تكون البروتينات المتفاعلة. وعلى العكس، فإن Orbitrap Velos مطياف الكتلة الهجين التي نستخدمها حاليا وبشكل ملحوظ تحسين القرار، ودقة الشامل، وحساسية مما يتيح أكثر كفاءة، والكشف عن إنتاجية عالية من البروتينات وفرة منخفضة، بما في ذلك التفاعلات عابرة. وأخيرا، إذا كانت طبيعة التفاعل غير معروف تماما نقترح الباحثون إلى: (ط) تطبيق معايير صارمة لتعيين عشرات الثقة لجميع المباريات قاعدة بيانات البحث المفترضة. عادة ما تعتبر البروتينات مع اثنين أو أكثر من الببتيدات فريدة إيجابية، على افتراض كل مباراة يمر علامة مع عتبة الحد الأدنى احتمال القطع من 99٪ أو أكثر احتمال، (الثاني) للتأكد من فحص البروتين خصوصية interactors مرشح سجلت مع الطعم المفتاحية في مقارنة النتائج المتحصل عليها مع سلالات المراقبة السلبية untagged (تجارب وهمية) أو الطعم لا علاقة لها البروتين، (الثالث) تأكيد متبادل التفاعلات المحتملة التي تحتوي على البروتين غير معروف من جملةEST من خلال خلق علامة المقابلة SPA الانصهار الطعم على نطاق واسع تنقية أو التحقق من صحة الزوج الحكيم التفاعلات باستخدام التقليدية المشترك مع مناعي محدد البروتين أو الأجسام المضادة علامة محددة.

حتى الآن، وذلك باستخدام هذا النهج المنتظم، تمكنا من وضع علامة وتنقية نحو ثلثي من E. 2750 ~ البروتينات القابلة للذوبان التي أعرب القولونية detectably تحت ثقافة غنية في المتوسط ​​1 و 2. وقد تكيفت نحن أيضا نفس هذا الأسلوب الأساسية لعزل بروتين منتظم مجمعات الأغشية المرتبطة بها، ويحاولون الآن تطهير كل من E. ~ 1000 المتبقية وتوقع أن تكون الإشريكية البروتينات الغشاء ملزمة. في حين أن تنقية البروتينات الغشاء يشكل في كثير من الأحيان تحديات فريدة من نوعها لأنه يتم في كثير من الأحيان لا solubilized كفاءة من خلال المخزن المؤقت استخراج التي نستخدمها عادة للأسلوب SPA، إضافة المنظفات غير الأيونية لدينا مخازن تمكن الانحلالية وتنقية أغلبية E. القولونية </ م> البروتينات الغشاء حاولنا حتى الآن (بابو آخرون، بيانات غير منشورة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل الأموال من المؤسسة الكندية للإبداع وكندا الجينوم، ومعهد أونتاريو علم الجينوم، وزارة أونتاريو للابتكار، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة ومنحة لJG AE E. والأحمر، معربا عن كان القولونية سلالة DY330 هدية من نوع دونالد L. المحكمة (المعهد الوطني للسرطان، فريدريك، MD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I. Antibiotics
Kanamycin Bioshop #KAN201
Ampicillin Bioshop #AMP201
2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone Bioshop #TRP 402
Yeast extract Bioshop #YEX 555
Glycerol Bioshop #GLY 002
K2HPO4 Bioshop #PPM 302
KH2PO4 Bioshop #PPM 303
3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330 Yu et al. (2000)10
pJL148 Zeghouf et al. (2004)7
4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase Fermentas # EP0281
10 X PCR buffer Fermentas # EP0281
10 mM dNTPs Fermentas # EP0281
25 mM MgCl2 Fermentas # EP0281
Agarose Bioshop # AGA002
Loading dye NEB #B7021S
Ethidium bromide Bioshop # ETB444
10X TBE buffer Thermo Scientific #28355
Tris Base Bioshop #TRS001
Boric acid Bioshop #BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0) Sigma # E6768
DNA ladder NEB #N3232L
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit Qiagen #12143
QIAquick PCR purification kit Qiagen #28104
6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler BioRad iCycler
Agarose gel electrophoresis BioRad
Electroporator Bio-Rad GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette Bio-Rad
42 °C water bath shaker Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge Beckman Coulter TS-5.1-500
32 °C Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator Fisher Scientific
7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide Bio-Rad #161-0125
Ammonium persulfate Bioshop # AMP001
n-butanol Sigma # B7906
TEMED Bioshop #TEM001
Whatman No. 1 filter paper Fischer Scientific #09-806A
Mini protean 3 cell Bio-Rad #165-3301
iBlot gel transfer device Invitrogen #IB1001
Nitrocellulose membranes Bio-Rad #162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody Sigma #F3165
Horseradish peroxidase Amersham #NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards Bio-Rad #161-0363
Chemiluminescence reagent PIERCE #1856136
Autoradiography film Clonex Corp #CLEC810
Quick Draw blotting paper Sigma #P7796
C2 platform rocking shaker New Brunswick Scientific, USA
8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator Branson Ultrasonic #23395
NaCl Bioshop #SOD001
Protease inhibitors Roche #800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl Thermo Scientific #20490
9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column Bio-Rad #732-6008
Benzonase nuclease Novagen #70746
Anti-FLAG M2 agarose beads Sigma #A2220
Calmodulin-sepharose beads GE Healthcare #17-0529-01
TEV protease Invitrogen #12575-015
Triton X-100 Sigma #T9284
CaCl2 Sigma #C2661
EGTA Sigma #E3889
LabQuake Shaker Thermolyne #59558
10. Silver Staining Reagents
Methanol Bioshop #MET302
Acetic acid Bioshop t#ACE222
Sodium-thiosulfate Sigma #S-7143
Silver nitrate Fischer Scientific #S181-100
Formaldehyde Bioshop #FOR201
Sodium carbonate Bioshop #SOC512
11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega # V5280
50 mM NH4HCO3 Bioshop #AMC555
1 mM CaCl2 Bioshop #CCL302
Acetonitrile Sigma #A998-4
Formic acid Sigma #F0507
HPLC grade water Sigma #95304
Iodoacetamide Sigma #16125
Millipore Zip-Tip Millipore # ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
12. Labware
4 liter conical flasks VWR #89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes Any Vendor
250 ml conical flaks VWR #29140-045
15 ml sterile culture tubes Thermo Scientific #366052
Cryogenic vials VWR #479-3221
-80 °C freezer Fisher Scientific #13-990-14
Speed vacuum system Thermo Scientific

Buffers and Solutions

1. 1 liter Terrific Broth (TB) media

11 g Bio-Tryptone
22 g Yeast Extract
2% Glycerol
50 ml potassium salt stock solution

2. Potassium Salt Stock Solution

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. Sonication Buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
10% Glycerol
Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

5. TEV cleavage buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

6. Calmodulin binding buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

7. Calmodulin wash buffer

30 mM Tris-HCl pH 7.9
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. Calmodulin elution buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
100 mM NaCl
10 mM EGTA
0.1-0.5 mM TCEP

9. Developing solution (1L)

37% Formaldehyde
30 g sodium carbonate
1000 ml distilled water

10. Digestion buffer

50 mM NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. Wetting and Equilibration solution

70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid

12. Washing solution

100% H2O in 0.1% formic acid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
  2. Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
  3. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  4. Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
  5. Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
  6. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
  7. Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
  8. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  9. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  10. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
  11. Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
  12. Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
  13. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
  14. Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).More

Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter