تحديد بروتين في مجمعات<em> كولاي</em> استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Summary

تنقية البروتينات من تقارب الموسومة بالاشتراك مع مطياف الكتلة (الألغام المضادة للأفراد) هو وسيلة قوية لرسم خرائط منهجية لشبكات التفاعل البروتين وعن التحقيق في أساس الآلية من العمليات البيولوجية. هنا، نحن تصف والأمثل متتابعة الببتيد تقارب الإجراء الألغام المضادة للأفراد (SPA) وضعت لبكتيريا<em> كولاي</em> التي يمكن استخدامها لعزل وتوصيف البروتين مستقرة متعددة لمجمعات بالقرب من التجانس بدءا من أرقام حتى نسخة منخفضة لكل خلية.

Abstract

حيث أن معظم عمليات توسط الخليوي عن الجمعيات الجزيئات، وتحديد منهجية للبروتين البروتين التفاعلات (PPI) وتحديد تكوين الوحيدات من البروتين المجمعات متعددة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظائف الجينات وتعزيز فهم النظم البيولوجية ^{1 و 2.} يمكن تعيين التفاعلات المادية مع ارتفاع العزلة vialarge النطاق الثقة وتوصيف البروتين المجمعات المحلية تحت ظروف شبه الفسيولوجية على أساس تنقية تقارب من البروتينات صبغويا الموسومة بالاشتراك مع مطياف الكتلة (الألغام المضادة للأفراد). وقد تم تطبيق هذا النهج بنجاح في الكائنات المتنوعة تطويريا، بما في ذلك الخميرة والذباب، والديدان، وخلايا الثدييات، والبكتيريا ^1-6. على وجه الخصوص، قد ولدت لدينا محطة كربوكسي لتقارب الببتيد متتابعة (SPA) نظام ثنائي لوضع علامات تقارب تنقية البروتين المجمعات الأصلية من مثقف كولاي سالبة الجرام، وذلك باستخدام جنرال الكتريكnetically-لين العريكة سلالات مختبر المضيفة التي يتم مناسبة تماما للالجينوم على نطاق التحقيقات في البيولوجيا الأساسية وعمليات الحفظ من بدائيات النوى ^{1، 2، 7.} لدينا نظام العنونة SPA مماثل للأسلوب تنقية جنبا إلى جنب تقارب وضعت أصلا للخميرة ^{8، 9،} ويتكون من الببتيد ملزمة كالمودولين (CBP)، يليه موقع الانقسام البروتيني للفيروس التبغ محددة للغاية حفر (TEV) وثلاث نسخ من حاتمة FLAG (FLAG 3X)، والسماح لجولتين متتاليتين لتخصيب تقارب. بعد التضخيم راديو كاسيت، تتكامل تسلسل محدد الخطية المنتجات PCR-SPA ترميز علامة وعلامة اختيار في الإطار أعرب وكما كربوكسي لمحطة اندماج في خلفية DY330 التي يسببها عابر للتعبير عن ذات كفاءة عالية لامدا عاثية مغاير إعادة التركيب نظام ^10. الخطوة اللاحقة ثنائي تنقية باستخدام كالمودولين والخرز تقارب مكافحة FLAG تمكن انتقائية للغايةوالانتعاش كفاءة منخفضة حتى مجمعات البروتين وفرة من الثقافات على نطاق واسع. ثم يتم استخدام مطياف الكتلة جنبا إلى جنب لتحديد ثابت شارك في تنقية البروتينات مع حساسية عالية (الأقل حدود الكشف نانوغرام).

هنا، نحن تصف مفصلة خطوة بخطوة الإجراءات التي نستخدمها عادة للمنهجية تنقية البروتين، ووضع علامات قياس الطيف الكتلي على أساس تحليل المجمعات البروتين للذوبان من E. كولاي، والتي يمكن الارتقاء بها ومصممة يحتمل أن الأنواع البكتيرية الأخرى، بما في ذلك بعض مسببات الأمراض الانتهازية التي هي قابلة للrecombineering. يمكن للتفاعلات الناجمة المادية كثيرا ما تكشف مكونات غير متوقعة للاهتمام والاتصالات اقتراح روابط آليا الرواية. دمج البيانات مع البيانات البديلة PPI جمعية الجزيئية مثل تفاعل (الجينات الجين) الوراثي الجيني و-السياق (GC) التنبؤات يمكن أن يسهل استجلاء هذه المنظمة العالمية الجزيئية المتعددة البروتين داخل المجمعات ثنائيةological مسارات. شبكات توليد E. ويمكن استخدام القولونية إلى التبصر في العمارة الفنية للمنتجات الجين في orthologous الميكروبات الأخرى التي تعاني من نقص وظيفي الشروح حاليا.

Protocol

1. بناء الجينات المحددة في وضع العلامات SPA E. القولونية سلالة DY330 يتم استخدام البلازميد pJL148 يشمل تسلسل DNA-SPA علامة وعلامة الكاناميسين المقاومة للمضادات الحيوية كاسيت (اساسه R) كقالب في تفاعل البلمرة المتسلسل (PC…

Representative Results

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon…

Discussion

أحد الجوانب الرئيسية لنهج القائم على الألغام المضادة للأفراد SPA الموصوفة هنا هو أن يتم تنفيذ علامات في السياق الطبيعي الكروموسومات، وبالتالي ضمان تنظيم الجينات العادية يتم الاحتفاظ (أي. المروج الطعم الأصلي الحفاظ عليها، وبالتالي لا قلق مستويات التعبير) والأم ث…

Materials

Materials	Vendor	and Catalog Numbers
			I. Antibiotics
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
			2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
Yeast extract	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
			3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
			4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase	Fermentas	# EP0281
10 X PCR buffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Loading dye	NEB	#B7021S
Ethidium bromide	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Boric acid	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# E6768
DNA ladder	NEB	#N3232L
			5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	#28104
			6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler	BioRad	iCycler
Agarose gel electrophoresis	BioRad
Electroporator	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette	Bio-Rad
42 °C water bath shaker		Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 °C Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator	Fisher Scientific
			7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide	Bio-Rad	#161-0125
Ammonium persulfate	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 filter paper	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 cell	Bio-Rad	#165-3301
iBlot gel transfer device	Invitrogen	#IB1001
Nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody	Sigma	#F3165
Horseradish peroxidase	Amersham	#NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards	Bio-Rad	#161-0363
Chemiluminescence reagent	PIERCE	#1856136
Autoradiography film	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw blotting paper	Sigma	#P7796
C2 platform rocking shaker	New Brunswick Scientific, USA
			8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Protease inhibitors	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
			9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase nuclease	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 agarose beads	Sigma	#A2220
Calmodulin-sepharose beads	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558
			10. Silver Staining Reagents
Methanol	Bioshop	#MET302
Acetic acid	Bioshop	t#ACE222
Sodium-thiosulfate	Sigma	#S-7143
Silver nitrate	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldehyde	Bioshop	#FOR201
Sodium carbonate	Bioshop	#SOC512
			11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitrile	Sigma	#A998-4
Formic acid	Sigma	#F0507
HPLC grade water	Sigma	#95304
Iodoacetamide	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin	Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer		Thermo Fisher Scientific
			12. Labware
4 liter conical flasks	VWR	#89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes	Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Any Vendor
250 ml conical flaks	VWR	#29140-045
15 ml sterile culture tubes	Thermo Scientific	#366052
Cryogenic vials	VWR	#479-3221
-80 °C freezer	Fisher Scientific	#13-990-14
Speed vacuum system	Thermo Scientific
			Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g Yeast Extract 2% Glycerol 50 ml potassium salt stock solution 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10% Glycerol Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 30 g sodium carbonate 1000 ml distilled water 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid