Identifizierung von Protein-Komplexen in<em> Escherichia coli</em> Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Summary

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium entwickelt<em> Escherichia coli</em> Das verwendet werden kann, zu isolieren und zu charakterisieren stabilen Multi-Protein-Komplexen zur Homogenität, auch ausgehend von einer geringen Kopienzahl pro Zelle ist.

Abstract

Da die meisten zellulären Prozesse werden von makromolekularen Anordnungen, die systematische Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) und die Identifizierung der Untereinheitzusammensetzung von Multi-Protein-Komplexen Einblick in Genfunktion Verfügung stellen können und besseren Verständnis der biologischen Systeme ^{1, 2} vermittelt wird. Physikalische Wechselwirkungen können mit hoher Konfidenz vialarge angelegte Isolierung und Charakterisierung von endogenen Proteinkomplexe unter nahezu physiologischen Bedingungen auf Affinitätsreinigung chromosomal-markierte Proteine ​​in Kombination mit Massenspektrometrie (APMS) basierend abgebildet werden. Dieser Ansatz ist erfolgreich in evolutionär diversen Organismen, einschließlich Hefe, Fliegen, Würmern, Säugetierzellen, Bakterien und ^1-6 aufgebracht. Insbesondere haben wir eine Carboxy-terminale Peptid Sequentielle Affinity (SPA) dualen Markierungssystem für Affinitäts-Reinigungskatalysator native Protein-Komplexen aus kultivierten gramnegativen Escherichia coli erzeugt wird, unter Verwendung genetically Spann Gastlabor Stämme, die für genomweite Untersuchungen der grundlegenden Biologie und konservierte Prozesse der Prokaryoten ^{1, 2, 7} gut geeignet. Unsere SPA-Kennzeichnungssystem ist analog zu dem Tandem Affinitätsreinigung Methode ursprünglich für Hefe ^{8, 9} entwickelt, und besteht aus einem Calmodulin-Bindungspeptid (CBP) durch die Spaltstelle für die hochspezifische Tobacco Etch Virus (TEV)-Protease gefolgt und drei Kopien des FLAG-Epitop (3X FLAG), so dass für zwei aufeinanderfolgende Runden von Affinitätsanreicherung. Nach Kassette Amplifikation werden sequenzspezifische lineare PCR-Produkte Codieren des SPA-tag und einen selektierbaren Marker integriert und ausgedrückt in Rahmen als carboxyterminale Fusionen in einem Hintergrund, der DY330 veranlaßt transient exprimieren ein hocheffizientes heterologe Bakteriophagen Lambda Rekombinationssystem ¹⁰ ist. Nachfolgende Dual-Schritt-Reinigung mit Calmodulin und anti-FLAG Affinitätsbeads ermöglicht die hochselektiveund effizienten Beitreibung sogar geringer Menge Protein-Komplexe von großen Kulturen. Tandem-Massenspektrometrie wird dann verwendet, um die stabil co-reinigenden Proteine ​​mit hoher Empfindlichkeit (niedrige Nachweisgrenzen Nanogramm) zu identifizieren.

Hier beschreiben wir detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren, die wir üblicherweise für die systematische Protein-Tagging, Reinigung und Massenspektrometrie-basierte Analyse von löslichem Protein-Komplexen aus E. verwenden coli, die bis skaliert werden und kann potenziell auf andere Bakterienarten, einschließlich bestimmter opportunistischer Krankheitserreger, die zugänglich Recombineering zugeschnitten sind. Die resultierenden physikalischen Wechselwirkungen zeigen oft interessante unerwartete Komponenten und Verbindungen hindeutet neuartige mechanistische Links. Integration der PPI-Daten mit alternativen molekulare Assoziation Daten wie genetische (Gen-Gen-) Wechselwirkungen und genomische-Kontext (GC) Prognosen Aufklärung der globalen molekulare Organisation von Multi-Protein-Komplexe in bi erleichtern kanngische Wege. Die Netzwerke für E. erzeugten coli können verwendet werden, um einen Einblick in die funktionelle Architektur von orthologen Genprodukte in anderen Mikroben für die funktionelle Annotationen derzeit fehlen gewinnen.

Protocol

Ein. Bau von Gen-spezifische SPA-Tagging in E. coli DY330 Stamm Das Plasmid pJL148 umfassend den SPA-tag-DNA-Sequenz und die Kanamycin Antibiotikaresistenzmarker Kassette (Kan R) als Matrize in der Polymerasekettenreaktion (PCR)-Amplifikation 7 verwendet. A 45 nt genspezifischen Vorwärtsprimer, unmittelbar stromaufwärts des Zielgens Stoppcodon im Leserahmen mit einem 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') tag spezifischen Vorwärtsprimer befindet, und eine 45 nt g…

Representative Results

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon…

Discussion

Ein wichtiger Aspekt des SPA-basierte APMS hier beschriebene Ansatz ist, dass Tagging innerhalb der natürlichen chromosomalen Kontext durchgeführt wird, wodurch eine normale Genregulation wird beibehalten (dh Muttersprache. Köder Promoter erhalten, damit Expression nicht gestört wird) und native stabil-assoziierten Protein-Komplexe werden bei nahezu endogenen zurückgewonnen. Operon Polarität Probleme werden ebenfalls durch Einschließen eines nach außen gerichteten Promotor in der Selektionsmarker vermie…

Materials

Materials	Vendor	and Catalog Numbers
			I. Antibiotics
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
			2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
Yeast extract	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
			3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
			4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase	Fermentas	# EP0281
10 X PCR buffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Loading dye	NEB	#B7021S
Ethidium bromide	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Boric acid	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# E6768
DNA ladder	NEB	#N3232L
			5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	#28104
			6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler	BioRad	iCycler
Agarose gel electrophoresis	BioRad
Electroporator	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette	Bio-Rad
42 °C water bath shaker		Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 °C Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator	Fisher Scientific
			7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide	Bio-Rad	#161-0125
Ammonium persulfate	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 filter paper	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 cell	Bio-Rad	#165-3301
iBlot gel transfer device	Invitrogen	#IB1001
Nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody	Sigma	#F3165
Horseradish peroxidase	Amersham	#NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards	Bio-Rad	#161-0363
Chemiluminescence reagent	PIERCE	#1856136
Autoradiography film	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw blotting paper	Sigma	#P7796
C2 platform rocking shaker	New Brunswick Scientific, USA
			8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Protease inhibitors	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
			9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase nuclease	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 agarose beads	Sigma	#A2220
Calmodulin-sepharose beads	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558
			10. Silver Staining Reagents
Methanol	Bioshop	#MET302
Acetic acid	Bioshop	t#ACE222
Sodium-thiosulfate	Sigma	#S-7143
Silver nitrate	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldehyde	Bioshop	#FOR201
Sodium carbonate	Bioshop	#SOC512
			11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitrile	Sigma	#A998-4
Formic acid	Sigma	#F0507
HPLC grade water	Sigma	#95304
Iodoacetamide	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin	Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer		Thermo Fisher Scientific
			12. Labware
4 liter conical flasks	VWR	#89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes	Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Any Vendor
250 ml conical flaks	VWR	#29140-045
15 ml sterile culture tubes	Thermo Scientific	#366052
Cryogenic vials	VWR	#479-3221
-80 °C freezer	Fisher Scientific	#13-990-14
Speed vacuum system	Thermo Scientific
			Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g Yeast Extract 2% Glycerol 50 ml potassium salt stock solution 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10% Glycerol Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 30 g sodium carbonate 1000 ml distilled water 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid