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Biology

의 단백질 단지의 식별 doi: 10.3791/4057 Published: November 12, 2012

Summary

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를 설명

Abstract

대부분의 세포 프로세스 macromolecular 어셈블리, 단백질 - 단백질 상호 작용의 체계적인 식별 (PPI)와 단지는 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공하고 생물 시스템 1, 2의 이해를 향상시킬 수 있습니다 다중 단백질의 subunit 구성의 식별에 의해 중재되기 때문입니다. 물리적 상호 작용 대량 분석법 (APMS)와 함께 chromosomally 태그 단백질의 친 화성 정화에 따라 거의 생리적 조건 하에서 내생 단백질 단지의 높은 신뢰 vialarge 규모의 절연 및 특성에 매핑 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식이 성공적으로 효모, 파리, 웜, 포유류의 세포 및 박테리아 1-6 등의 evolutionarily 다양한 생물에 적용되었습니다. 특히, 우리는 GE를 사용하여 양식 그람 음성 대장균에서 선호도 - 정화 기본 단백질 단지의 카르복시 - 터미널 순차적 펩타이드 선호도 (SPA) 듀얼 태그 시스템을 생성 한기본 생물학, prokaryotes 1, 2, 7 보존 프로세스의 게놈 전체의 조사에 적합 아르 netically - 다루기 쉬운 호스트 실험실 변종. 우리 SPA 태그 시스템은 효모 8, 9 원래 개발 된 직렬 선호도 정화 방법 유사하며, calmodulin 바인딩 구체적인 담배 에칭 바이러스 (TEV) 단백 분해 효소의 절단 사이트에서 다음 펩타이드 (CBP) 및 사본 3 부를 구성되어 있습니다 연관성 농축의 연속 2 발을 허용 플래그 에피토프 (3 배 플래그)의. 카세트 증폭 후, SPA-태그와 선택 마커를 인코딩 순서 특정 선형 PCR 제품은 통합되어 transiently 고효율 heterologous 박테리오파지 람다 재결합 시스템 (10)을 표현하도록 유도하는 DY330 배경으로 카르복시 - 터미널 fusions와 같은 프레임으로 표현. calmodulin 및 안티 플래그 연관성 구슬을 사용하여 후속 듀얼 단계 정화는 높은 선택을 가능하게대규모 문화도 낮은 풍부한 단백질 단지의 효율적인 복구. 직렬 질량 분석법 그 다음 높은 감도 (낮은 nanogram 검출 한계)를 안정적으로 공동 정화 단백질을 식별하는 데 사용됩니다.

여기, 우리는 우리가 일반적으로 체계적인 단백질 태그, 정화 및 대량 E.에서 수용성 단백질 단지의 분석법 기반의 분석을 위해 사용하는 자세한 단계별 절차를 설명 까지 확장 될 가능성이 recombineering 의무가있는 특정 기회 병원균 등 다른 세균 종에 맞게 할 수 있습니다 대장균. 그 결과 물리적 상호 작용은 종종 재미있는 예상치 못한 구성 요소와 소설 기계론의 링크를 제안 연결을 공개 할 수 있습니다. 이러한 유전자 (유전자 유전자) 상호 작용과 예측은 이중에서 다중 단백질 단지의 글로벌 분자 조직의 해설을 촉진 할 수 게놈 - 컨텍스트 (GC)와 같은 다른 분자 협회 데이터와 PPI 데이터의 통합ological 경로. E.에 대해 생성 된 네트워크 대장균은 기능 주석이 현재 부족하는 다른 미생물의 orthologous 유전자 제품의 기능 구조에 대한 통찰력을 얻을하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

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1. E.의 유전자 별 SPA 태그 추가 구축 대장균 DY330 변형

  1. 플라스미드 pJL148은 SPA-태그 DNA 시퀀스와 kanamycin 항생제 저항 아이콘 카세트 (관 R)를 포함한는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 7의 템플릿으로 사용됩니다. 27 BP (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') 태그 특정 앞으로 프라이머와 프레임에서 대상 유전자 정지 코돈 즉시 상류에 위치한 45 NT 유전자 특정 앞으로 프라이머, 그리고 45 NT 유전자 특정 역방향 프라이머, 즉시 위치 94 : 27 BP (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT의 -3 ') 태그 특정 역 프라이머와 프레임에서 대상 유전자 정지 코돈의 하류는 다음과 PCR 사이클 조건을 사용하여 pJL148에서 SPA-태그와 칸 R 카세트를 증폭하는 데 사용됩니다 5 분에 대한 ° C, 1 분, 68 1 분, 55 ° C ° 10 분에 68 ° C에 이어 2 분 10 초에 C에 대해 94 ° C의 30주기. 이 증폭 시퀀스는 서비스를 제공ectopically 소개 λ - 레드 상동 재조합 기계를위한 S 기판 (아래).
  2. PCR 제품은 electroporation을 방해 할 수 염을 제거하는 Qiaquick PCR 정화 키트를 사용하여 정화하고 있습니다. 정화 PCR 제품은 이후 λ - 레드 재조합 기기는 10 표현되는 DY330 변형에서 특정 유전자의 3 '끝 (기본 정지 코돈의 바로 상류)에 통합하는 타겟팅됩니다.
  3. DY330 λ - 레드 표현 스트레인는 180 rpm으로 흔들어하여 32 ° C에서 2 ML Luria-Bertani (LB) 매체에 밤새 성장하고 있습니다. 밤 문화의 한 ML은 이후 500 ML 원뿔 플라스크에 70 ML 신선한 LB 매체에 주사합니다. inoculum는 OD 600 ~ 0.8에 도달 할 때까지 180 rpm으로 흔들어하여 32 ° C에서 성장하고 있습니다.
  4. 문화는 세포 ° C 부드럽게에 흔들림에 의해 42에 물 목욕에 휴대용 술병을 잠복기에 의해 유도되는 신선한 250 ML 원뿔 플라스크로 전송됩니다15 분 180 RPM. 즉시 유도 후 병이 흔들리고있는 최소 30 분 동안 얼음 물 슬러리 욕조에 incubated 수 있습니다.
  5. 얼음처럼 차가운 문화는 바로 사전 차가운 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브로 옮겨와 4에서 6 분에 3,993 XG에서 원심 분리를 받게 ° C.합니다 셀 펠렛은 50 ML 얼음처럼 차가운 멸균 물에 resuspended과 4 ° C.에서 6 분에 3,993 XG 다시 한 번 centrifuged 수 있습니다 셀 펠렛 그런 다음 차가운 물 1 ML에 resuspended와 1.5 ML Effendorf 튜브로 옮겨, 4 ° C.에 20 초에 최대 속도로 centrifuged합니다 얼음 냉수 두 개 또는 세 세척 단계 후, 세포 펠렛은 전기 관할 세포의 결과로, 얼음처럼 차가운 멸균 물 700 μl에 마지막으로 resuspended 있습니다.
  6. electroporation을 통해 정화의 amplicon 중 하나 μl은 전기 관할 세포의 40 μl로 소개되어 있습니다. 2.5 KV, 펄스 25 μF : 세포는 다음과 같이 설정 바이오 RAD GenePulser II에 electroporated 아르200 Ω의 컨트롤러입니다. 상동 재조합과 통합 한 후 성공적으로 염색체에 태그 / 카세트를 재결합 transformants는 관 (그림 1A)에 대한 저항에 따라 선택됩니다. 여러 transformants는 서양의 SPA 태그의 국기 epitopes에 대한 선택입니다 안티 - 플래그 M2 항체와 SPA 태그 융합 단백질의 정확한 생성 (즉, 긍정적 신호)를 확인하는 blotting에 대해 선택됩니다.
  7. 확인 카르복시 말단 SPA 태그 융합 스트레인은 ​​SPA 정화 프로토콜을 사용하여 수확 세포 용해 단백질 복합체를 분리 할 수​​있는 대규모의 배양입니다. 연관성 태그 정화 절차에 관여 단계의 개요는 그림 1B에 표시됩니다.

2. 배양 및 Sonication

  1. SPA 태그 E. 100 μl의 예방 50 ML 훌륭한 국물 (TB)로 대장균의 글리세롤 주식은 액체 매체는 25 μg / ML O의 50 μl로 보충250 ML 원뿔 플라스크에 F 칸 솔루션입니다. 32 ° C.에서 밤 문화를 성장
    참고 : 변형 DY330의 온도 inducible의 λ 레드 카세트가 온도에 민감한 억제 (10)의 통제하에 있기 때문에 SPA 태그 대장균의 변종은 32 ° C.에 성장하고 있습니다
  2. 4리터 플라스크에 관의 25 μg / ML로 보충 990 ML 신선한 TB로 밤 문화의 10 ML을 전송합니다. OD 600 ~ 2-3에 도달 할 때까지 문화는, 32의 ° C 상수는 5-6 시간에, 250 rpm으로 흔들어와 함께 성장하고 있습니다.
  3. 1리터 E.를 전송 대장균은 SPA 태그 문화 원심 분리 병을 청소하고 15 분에 Beckman의 ° C J6-HC의 원심 분리기 @ 3,993 XG 4에서 셀을 회전합니다.
  4. 표면에 뜨는는 원심 분리 병에서 제거됩니다. E.를 Resuspend sonication 버퍼의 25 ML과 대장균 세포 펠릿. 항상 얼음에 원심 분리 병을 유지 있는지 확인하십시오.
  5. resuspended 펠렛은50 ML 폴리 프로필렌 팔콘 튜브로 옮겨와 액체 질소를 사용하여 냉동. 냉동 세포는 -80 ° C에서 장기 사용을 위해 저장됩니다.
  6. 이전 sonication에, 얼음에 알약을 유지하여 완전히 냉동 세포를 해동. 해동 샘플은 sonication을 위해 얼음에 위치 멸균 스테인레스 스틸 컵으로 전송됩니다. 프로브가 샘플로 잠수 3 분 동안 sonicated 수 있습니다. 추가 2 분은 과열에서 샘플을 냉각 할 수 있습니다.
  7. sonicated 세포 lysate은 사전 차가운 멸균 원심 분리 관에 전송하고, 두 번 15 분을 위해 JA-17 로터 @ 35,267 XG (16,000 RPM)를 사용하여 Beckman의 원심 분리기에서 4 ° C에서 원심 분리를 받게됩니다.
    참고 : 우리는 막 단백질이있는 소수의 모르기 때문에 막 단백질 정화의 경우, sonicated 세포 lysate는 15 분에 한 번만 centrifuged 있으며, 그 펠렛이나 표면에 뜨는 분수의 하나입니다. 따라서 가상을 초과하는 손실을 방지하기brane 단백질, 우리는 15 고속 원심 분리의 분, 1 %의 세제가 막 단백질을 solubilize하는 데 사용되는 표면에 뜨는가 이후 (아래 단계 참조) 정화에 대한 처리의 세포를 스핀.
  8. 원심 분리 관에서 표면에 뜨는는 신중하게 50 ML 폴리 프로필렌 팔콘 튜브로 옮겨와 액체 질소를 사용하여 냉동하고 있습니다. sonicated 냉동 세포 추출물은 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 6 개월 최대 기간 동안 저장됩니다.

3. 친 화성 정제

  1. 사용하기 전에, 안티 - 플래그 M2 구슬의 100 μl은 AFC 버퍼의 10 권 (30 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, 0.1 %의 세제, 그리고 0.1-0.5 MM TCEP [트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine에 의해 씻겨 있습니다 - 세제없이 염산])와 환원제 TCEP (트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine).
  2. 냉동, sonicated 세포 추출물은 차가운 물에 튜브를 삽입하여 해동합니다. 해동 세포 추출물은 benzo 3 μl와 incubated 수 있습니다4 ° C.에 30 분을위한 nase nuclease 이 혼합물에, 비 이온 세제를 추가 트리톤 X-100 (세제의 최종 농도가 0.1 %이어야 함) 및 안티 플래그 M2 아가로 오스 비즈 200 μl 중지.주세요
    참고 : 모든 수용성 단백질 purifications를 들어, 0.1 %는 트라이 튼 X-100가 아닌 특정 흡착을 최소화하기 위해 사용되는 곳으로 막 단백질 등 C12E8 (Octaethylene 글리콜 dodecyl 에테르) 등 다양한 온난 한 비 이온 세제, DDM을 (정화를위한 N-Dodecyl β-D-maltoside)와 말토오스 - neopentyl 글리콜 (MNG)는 solubilization을 향상시키기 위해 1 %의 세제 농도에서 사용할 수 있습니다. 다른 세제는 막 단백질의 solubilization 효율을 변화 때문에, 그것은 하나 이상의 세제를 사용하여 독립적 인 단백질 purifications을 수행하는 것이 좋습니다.
  3. 내용은 부드럽게 ° C가 LabQuake 흔드는을 사용하여 4에서 3 시간 동안 튜브를 회전하여 혼합합니다. 회전 3 시간 후, 관은 6 분에 1,700 XG에서 centrifuged 있습니다. 표면에 뜨는는 r이된다느슨한 구슬 펠렛을 방해하지 않고, 최대한 신중하게 emoved.
  4. 펠렛은 남아있는 표면에 뜨는에 resuspended 후 0.8 X 4cm 바이오 RAD 폴리 프로필렌 사립 칼럼으로 전송됩니다. eluates 중력 흐름에 의해 배출 할 수 있도록, 컬럼의 하단 콘센트 플러그를 제거하려면 확인하십시오. TEV 절단 단계로 열 다섯 번 씻으십시오.
  5. 세척 eluates을 빨아 후, 열 하단의 출구가 닫힙니다. 같은 열까지 절단은 열에 TEV 단백 분해 효소와 1X AFC 버퍼 400 μl의 ~​​ 5-10 μl (50 단위)를 추가하여 수행됩니다. 캡 열 상단을 닫습니다 있는지 확인하십시오. 구슬을 포함하는 열은 LabQuake 흔드는을 사용하여 ° C 박 4에서 하루 아침에 부드럽게 회전합니다.
  6. 열 하단에있는 상단 및 콘센트 플러그에 뚜껑을 제거하고, (10)에 의해 쓸려 calmodulin-세 파로스 비즈 200 μl 정지를 포함한 새로운 칼럼으로 TEV 절단 한 후 복구 eluates을 배수calmodulin 바인딩 버퍼의 권.
  7. 상단과 열 하단의 모두 단단히 고정되며, 열에서 내용은 ° C LabQuake 흔드는을 사용하여 4에서 3 시간에 돌려 부드럽게 혼합되어 있습니다.
  8. 회전 3 시간 후, eluate은 열 상단 캡과 하단에 플러그를 제거하여 배수입니다. 열은 calmodulin 세척 버퍼 400 μl과 하나가 엄격한 세척 한 다음 1X calmodulin 바인딩 버퍼 200 μl를 네 번 세탁하고 있습니다.
  9. 바인딩 단백질은 1X calmodulin의 용출 버퍼를 사용하여 새로운 Eppendorf 튜브에 50 μl 네 개의 분수에 용출되어 있습니다. 용출 분획은 동일한 볼륨에 두 개의 깨끗한 Eppendorf 튜브에 배포됩니다. 튜브 모두 이후 속도 진공을 사용하여 건조합니다.
  10. 다른이 사전에 질량 분광법을 사용하여, -80 ° C에 저장되는 동안 관에서 건조 eluate은 실버 착색 젤을 실행하는 데 사용됩니다.

4. 실버 얼룩

  1. 실버 staini에 대한NG, 3 배 SDS (나트륨 dodecyl 황산) 샘플 버퍼의 절반 볼륨이 건조 eluate의 50 μl에 추가됩니다. 5 분의 혼합물을 끓고 후, 샘플은 SDS의 polyacrylamide 젤에로드됩니다.
  2. 젤이 실행 완료 후, 조심스럽게 고정 솔루션에 배치 (50 % 메탄올와 10 % 아세트산)와 20 분의 회전 흔드는을 부드럽게 교반하고 있습니다. 젤 그 다음 10 분 20 % 에탄올에 헹구어 있습니다.
  3. 고정 젤은 낮은 균일 한 배경을 보장하기 위해 10 분에 두 번 증류수 500 ML에 두 번 철저하게 세척합니다.
  4. 젤 그런 다음 20 초에 증류수 두 세척 단계에 이어 1 분, 500 ML 나트륨-thiosulfate에 부드럽게 교반하고 있습니다.
  5. 물은 폐기되고, 젤은 30 분에 0.1 % 실버 질산염 200 ML에 incubated 수 있습니다. 그 이후에는 실버 질산염이 제거되고 젤이 초과 실버 질산염을 제거하는 20 초에 증류수로 세척합니다.
  6. 젤은 결국 75 ML에 흥분 손으로개발 솔루션의. 원하는 강도가 달성되면, 개발 솔루션은 삭제되며 아세트산의 80 ML는 반응을 중지에 추가됩니다. 겔 밴드의 적절한 시각화를위한 20 분의 최소 아세트산의 젤을 배양 할 수 있는지 확인합니다.

5. 질량 분석법에 대한 Proteolysis 및 샘플 준비

  1. 말린 샘플에, 소화 버퍼 50 μl 100 MM TCEP-HCL (트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine - 염산)의 0.9 μl를 추가하고 실온에서 45 분의 혼합물을 품다 감소 단계. 다음, 500 밀리미터 iodoacetamide 1 μl를 추가 및 샘플 알킬화 할 수 있도록하는 또 다른 40 분 어둠 속에서 incubated입니다.
  2. 부화의 두 번째 라운드 후, 혼합물에 고정 트립신의 1 μg을 추가로 5 시간 또는 실온에서 하룻밤에 37 ° C에서 중 품다. 아세트산 1 μl를 추가하여 반응을 중지 확인합니다.
  3. 사전 젖은 Millipo으러 및 평균 솔루션 10 μl를 aspirating하여 다시 우편 - 팁 피펫 팁. 낭비 할 수있는 솔루션을 투여. 이후에 세척 용액 10 μl를 기음과 낭비 할 수있는 솔루션을 투여. 이 단계를 두 번 반복합니다.
  4. 끝으로 펩타이드 혼합물의 효율적인 바인딩, 피펫은 펩타이드 혼합물을 20 번 섞는다. 끝을 준수하는 펩타이드 혼합물은 aspirating 및 세척 용액을 조제하여 씻어 수 있습니다. 끝으로 펩타이드 혼합물의 효율적인 결합에 대해 두 번이 절차를 반복합니다.
  5. 바인딩 펩타이드를 포함하는 팁과 함께 으러 및 평균 솔루션 10 μl를 대기음, 그리고 깨끗한 eppendorf 튜브에 조제. 이 단계를 두 번 반복합니다. 사용하기 ° C 사전을 속도 진공에서 용출 샘플을 건조 후, 샘플은 질량 분광법에 의해 즉시 분석 할 수 또는 -80에 저장됩니다.

6. LTQ Velos Orbitrap 질량 분광계에 의한 단백질 식별

일고립 된 단지의 전자 폴리펩티드 구성 요소 LTQ Velos의 Orbitrap 하이브리드 탠덤 질량 분석기를 사용하여 식별됩니다. Orbitrap은 뛰어난 해결 능력 (> 60,000 전체 너비 하프 최대, 또는 FWHM) 및 제어 purifications에서 감지 관련이없는 비 특정 배경 오염 물질의 MS / MS 샘플링을 최소화 대량의 정확도를 (<2 PPM)가 고속 Velos 이온 트랩 동안 구성 요소가 감지 할 수 있습니다 전자 전달 분리와 충돌 유발 분해 모드를 사용하여 조각 낮은 풍요의 펩티드. 결과 MS / MS 스펙트럼 사이에서 높은 신뢰 일치는 참조 E.에 매핑됩니다 대장균 단백질 시퀀스는 SEQUEST와 STATQUEST 11 같은 확률 알고리즘 동안 평가를 각각의 일치 시퀀스 같은 데이터베이스 검색 알고리즘을 사용합니다. 총 스펙트럼 번호, 펩타이드 시퀀스 고유 대조군 (예. 모의) purifications에서 감지 일반적인 배경 오염 물질은 낮은 경험적 허위 - 비밀입니다 달성하기 위해 간주됩니다covery 속도. 다음 단계는 단백질 식별을 위해 수행됩니다 :

  1. 마이크로 열은 3 μm 루나-C 18 수지의 ~ 10cm로 포장하고 Orbitrap 악기와 라인에 배치되어있는 Proxeon nanoelectrospray 이온 소스에 연결할 있습니다.
  2. Proxeon 나노 흐름 바이너리 HPLC 펌프는 펩타이드 분리시 ~ 300 NL 분 -1의 안정 팁 유량을 제공하는 데 사용됩니다.
  3. 펩타이드 용출을 달성하기 위해, 유기 버퍼 기울기는 샘플의 복잡성에 따라 설정됩니다. 예를 들어, 다음과 같은 그라디언트는 일반적으로 E.에 설정되어 대장균의 SPA 샘플 : 용매 B는 1 분에 100 % 개최 옆에 4 분에서 100 %로, 38 분에서 24 %로, 1 분에 2퍼센트 6 %에서 증가 한 다음, 1 분에서 2 %로 감소 15 분에서 2 %로 개최 최종. 모바일 상 용매 용매 B는 0.1 % 개미의 ACI와 5% HPLC 기울기 물과 95 % ACN가있을 때, 0.1 % 개미의 산성과 95% HPLC 기울기 물과 5 % ACN이D. 바늘의 끝의 유량은 60 분 300 NL 분 -1로 설정되어 있습니다.
  4. 질량 분광계주기는 60,000 해상도에 하나의 전체 질량 검사를 통해 실행으로, 10 수반하는 협동 조각 질량 검사는 가장 강렬한 전구체 이온에 대한 수집하고 있습니다. 동적 제외, monoisotopic 대량 선택, 실시간으로 데이터에 의존 수집 악기 기능을 사용할 수 있습니다.
  5. 스펙트럼은 E.의 데이터베이스에 대해 이러한 SEQUEST 같은 데이터베이스 검색 알고리즘을 사용하여 검색됩니다 대장균 단백질 시퀀스, 그리고 결과는 통계적으로 낮은 잘못된 검색 속도를 보장하기 위해 이러한 STAQUEST 11과 같은 확률 알고리즘을 사용하여 필터링하고 있습니다. 일치하는 이론적 펩티드 질량에 비해 10 개 이상의 PPM 질량 오류를 보여주는 더 고려에서 제거하는 동안 만 높은 신뢰 (99 % 확률) 후보자가 선택됩니다.

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Discussion

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여기에 설명 된 SPA 기반 APMS 방식의 핵심 부분은 태그가함으로써 정상적인 유전자 조절을 보장하는 것은 유지 (예. 기본 미끼업자의 앞 표현 수준이 어리둥절하지 않습니다, 보존) 및 안정적-관련 기본입니다, 자연 염색체 컨텍스트 내에서 수행되는 것입니다 단백질 단지는 거의 내생 수준에서 회수하고 있습니다. 오페론 극성 문제도 선택 마커의 외측 중심의 발기인을 포함하여 피할 수 있습니다. 이 SPA 태그 추가 방법은 subunits는 세균 세포 당 몇 분자으로 표현 된 경우에도 막 관련 어셈블리를 포함한 근처의 동질성에 대한 낮은 풍부한 단지,​​의 구성 요소를 정화 할 수있을만큼 효과적입니다. 전반적으로,이 프로토콜은 E.에 태그 가용성 단백질의 대형 세트를 정화에 쉽게 스케일 업 할 수 있습니다 대장균이나 원칙적으로 recombineering를 통해 태그이 가능하는 다른 박테리아 종, 또는 사람이 소유하고 자연스럽게 높은 transformaAcinetobacter, 타겟 유전자 knockouts 13 스트레인 라이브러리를 구축 할 수 예를 들어, 사용 된 세균 유전학의 새로운 주력,,, 같은 기 기능.

대규모 proteomic 접근법에 내재 된 주요 관심사는 난잡한 비 특정 interactors와 가짜 추적 오염의 식별합니다. 농축의 두 발에도 불구하고, 우리의 일상 SPA의 purifications는 정기적으로 일반적으로 크로마토 그래피 수지 및 / 또는 미끼 단백질에 비 특별히에 바인딩 ribosomal 단백질 및 보호자와 같은 높은 풍부한 가사 단백질입니다 자주 오염 물질을 감지합니다. 이 문제는 두 가지 방법으로 해결할 수 있습니다. 첫째, 특정 미끼로 식별 각 단백질의 총 스펙트럼 번호와 고유성은 여러 관련이없는 단백질 baits의 purifications의 광범위한 세트를 기준으로하여 태그가 지정되지 않은 (즉,. 야생 타입) 부정적인 제어 변종 (예. 가짜 친화 정화 exper에서 간주됩니다거짓 긍정적 인 협회를 최소화 할 수 iments). 둘째, 모든 후보 단백질 상호 작용은 SPA 태그의 존재가에 기본 단백질의 결합을 perturbs하는 드문 경우를 방지 할 수 독자적으로 확인 개인 단백질 단백질 상호 작용의 목적으로 상반 태그 및 putative 바인딩 파트너 정화를 사용하여 검증해야 내생 단백질 조립.

APMS 기반 proteomic 설문 조사는 과도 또는 하위 화학 양 론적 상호 작용을 식별하는 측면에서 감성의 부족에 의해 제한됩니다. 이러한 경우, 단일 단계 정화 절차는 약한 상호 작용 파트너의 검출을 향상시키기 위해 사용할 수 있습니다. E. 우리의 지속적 년대 긴 연구 기간 동안 대장균 interactome, 우리는 차세대 질량 분석기의 감지 기능이 꾸준히 개선 보았다. 이전 장비는 종종 덜 아부의 확인을 precluding, 매우 풍부한 단백질의 재발 식별에 바이어스ndant하지만 잠재적으로 매우 중요한 상호 작용 단백질. 반대로, Orbitrap은 우리가 현재 현저하게 향상 해상도, 대량 정확성, 그리고 감도는 이에 과도 상호 작용을 포함하여 낮은 풍부한 단백질의 훨씬 더 효율적으로, 높은 처리량 감지를 허용하고 있습니다 사용하는 하이브리드 질량 분석기를 Velos. 상호 작용의 성격이 완전히 알 수없는 경우 마지막으로, 우리는에 연구를 제안 :은 (i) 모든 putative 데이터베이스 검색 검색으로 신뢰 점수를 할당 할 엄격한 기준을 적용 할 수 있습니다. 두 개 이상의 고유 한 펩티드와 단백질은 일반적으로 각 경기의 99 % 이상 확률의 최소 가능성 임계 값 컷 - 오프로 통과 가정, 긍정적 간주됩니다 경우, (ii)에 태그를 미끼로 기록 된 후보 단백질 interactors의 특이성을 조사해야합니다 대조군 태그가 지정되지 않은 변종 (모의 실험) 또는 관련이없는 단백질 baits와 함께 얻은 결과를 비교, (III) 서로 간의 알 수없는 단백질을 포함하는 잠재적 인 상호 작용을 확인동부 표준시 대규모 정화에 해당하는 SPA 태그 미끼 융합을 만들거나 단백질의 특정 또는 태그 특정 항체 전통적인 공동 immunoprecipitation을 사용하여 한 쌍의 측면에서 상호 작용을 검증하여.

현재까지이 체계적인 접근 방법 사용, 우리는 ~ 2750 E.의 3 분의 2 주위에 태그를 추가하고 정화하기 위해 관리했습니다 detectably 풍부한 매체, 1, 2의 문화에서 표현 대장균 용해 단백질. 우리는 또한 체계적으로 막 관련 단백질 복합체를 분리하려면이 같은 기본적인 방법을 적응, 이제 남은 ~ 1000 E. 각각의 정화하려고 시도 중입니다 대장균 단백질은 막 준수 할 것에 예측했다. 그들은 종종 효율적으로 우리가 일반적으로 SPA 방법에 사용하는 추출 버퍼에 의해 solubilized하지 않기 때문에 막 단백질의 정화는 종종 독특한 도전을 포즈 있지만, 우리의 버퍼를 비 이온 세제의 추가는 대부분의 solubilization 및 정화 수 있습니다 E. 대장균 </ em>는 막 단백질 우리는 (간디 외., 게시되지 않은 데이터) 날짜로 시도했습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 혁신 게놈 캐나다, 온타리오 유전체학 연구소, 혁신의 온타리오 교육부, 그리고 JG에 건강 연구 기금의 캐나다 연구소와 AE 적목 표현 E.에 대한 캐나다 재단에서 기금에 의해 지원되었다 대장균은 변형 DY330는 도널드 L. 법원 (국립 암 연구소, 프레데릭, MD)에서 일종의 선물이었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I. Antibiotics
Kanamycin Bioshop #KAN201
Ampicillin Bioshop #AMP201
2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone Bioshop #TRP 402
Yeast extract Bioshop #YEX 555
Glycerol Bioshop #GLY 002
K2HPO4 Bioshop #PPM 302
KH2PO4 Bioshop #PPM 303
3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330 Yu et al. (2000)10
pJL148 Zeghouf et al. (2004)7
4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase Fermentas # EP0281
10 X PCR buffer Fermentas # EP0281
10 mM dNTPs Fermentas # EP0281
25 mM MgCl2 Fermentas # EP0281
Agarose Bioshop # AGA002
Loading dye NEB #B7021S
Ethidium bromide Bioshop # ETB444
10X TBE buffer Thermo Scientific #28355
Tris Base Bioshop #TRS001
Boric acid Bioshop #BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0) Sigma # E6768
DNA ladder NEB #N3232L
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit Qiagen #12143
QIAquick PCR purification kit Qiagen #28104
6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler BioRad iCycler
Agarose gel electrophoresis BioRad
Electroporator Bio-Rad GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette Bio-Rad
42 °C water bath shaker Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge Beckman Coulter TS-5.1-500
32 °C Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator Fisher Scientific
7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide Bio-Rad #161-0125
Ammonium persulfate Bioshop # AMP001
n-butanol Sigma # B7906
TEMED Bioshop #TEM001
Whatman No. 1 filter paper Fischer Scientific #09-806A
Mini protean 3 cell Bio-Rad #165-3301
iBlot gel transfer device Invitrogen #IB1001
Nitrocellulose membranes Bio-Rad #162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody Sigma #F3165
Horseradish peroxidase Amersham #NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards Bio-Rad #161-0363
Chemiluminescence reagent PIERCE #1856136
Autoradiography film Clonex Corp #CLEC810
Quick Draw blotting paper Sigma #P7796
C2 platform rocking shaker New Brunswick Scientific, USA
8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator Branson Ultrasonic #23395
NaCl Bioshop #SOD001
Protease inhibitors Roche #800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl Thermo Scientific #20490
9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column Bio-Rad #732-6008
Benzonase nuclease Novagen #70746
Anti-FLAG M2 agarose beads Sigma #A2220
Calmodulin-sepharose beads GE Healthcare #17-0529-01
TEV protease Invitrogen #12575-015
Triton X-100 Sigma #T9284
CaCl2 Sigma #C2661
EGTA Sigma #E3889
LabQuake Shaker Thermolyne #59558
10. Silver Staining Reagents
Methanol Bioshop #MET302
Acetic acid Bioshop t#ACE222
Sodium-thiosulfate Sigma #S-7143
Silver nitrate Fischer Scientific #S181-100
Formaldehyde Bioshop #FOR201
Sodium carbonate Bioshop #SOC512
11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega # V5280
50 mM NH4HCO3 Bioshop #AMC555
1 mM CaCl2 Bioshop #CCL302
Acetonitrile Sigma #A998-4
Formic acid Sigma #F0507
HPLC grade water Sigma #95304
Iodoacetamide Sigma #16125
Millipore Zip-Tip Millipore # ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
12. Labware
4 liter conical flasks VWR #89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes Any Vendor
250 ml conical flaks VWR #29140-045
15 ml sterile culture tubes Thermo Scientific #366052
Cryogenic vials VWR #479-3221
-80 °C freezer Fisher Scientific #13-990-14
Speed vacuum system Thermo Scientific

Buffers and Solutions

1. 1 liter Terrific Broth (TB) media

11 g Bio-Tryptone
22 g Yeast Extract
2% Glycerol
50 ml potassium salt stock solution

2. Potassium Salt Stock Solution

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. Sonication Buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
10% Glycerol
Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

5. TEV cleavage buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

6. Calmodulin binding buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

7. Calmodulin wash buffer

30 mM Tris-HCl pH 7.9
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. Calmodulin elution buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
100 mM NaCl
10 mM EGTA
0.1-0.5 mM TCEP

9. Developing solution (1L)

37% Formaldehyde
30 g sodium carbonate
1000 ml distilled water

10. Digestion buffer

50 mM NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. Wetting and Equilibration solution

70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid

12. Washing solution

100% H2O in 0.1% formic acid

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References

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의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여
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Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).More

Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).

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