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Biology

Identificação de complexos de proteínas em doi: 10.3791/4057 Published: November 12, 2012

Summary

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a bactéria

Abstract

Uma vez que a maioria dos processos celulares são mediadas por montagens macromoleculares, a identificação sistemática de interacções proteína-proteína (PPI) e à identificação da composição de subunidades de vários complexos de proteína pode fornecer informações sobre a função do gene e aumentar a compreensão dos sistemas biológicos 1 e 2. Interacções físicas podem ser mapeados com alta confiança isolamento vialarge escala e caracterização de complexos de proteínas endógenas sob condições fisiológicas quase baseados em purificação de afinidade de proteínas cromossomicamente etiquetados em combinação com espectrometria de massa (STDA). Esta abordagem tem sido aplicada com sucesso em organismos evolutivamente diversas, incluindo levedura, moscas, vermes, células de mamíferos e bactérias 1-6. Em particular, têm gerado um carboxi-terminal Affinity Peptide seqüencial (SPA) sistema de marcação dupla para afinidade com purificação de complexos de proteínas nativas cultivadas coli gram-negativas coli, usando genetically-tratáveis ​​hospedeiras estirpes laboratoriais que estão bem adaptados para as investigações do genoma da biologia fundamental e processos conservadas de procariotas 1, 2, 7. O nosso sistema de SPA-marcação é análogo ao método de purificação por afinidade em tandem desenvolvido originalmente para levedura 8, 9, e é composto por uma ligação peptídica a calmodulina (CBP), seguido do local de clivagem para a protease altamente específico do tabaco vírus etch (TEV) e três cópias do epitopo FLAG (FLAG 3X), permitindo dois ciclos consecutivos de enriquecimento por afinidade. Após a amplificação da cassete, a sequência específica de produtos lineares de PCR que codificam o SPA-tag e um marcador de selecção são integradas e expressas em quadro como carboxi-terminais fusões em um fundo DY330 que é induzida a expressar transitoriamente um altamente eficiente sistema de recombinação heteróloga bacteriófago lambda 10. Purificação de dupla etapa subsequente utilizando calmodulina e grânulos anti-FLAG de afinidade permite a altamente selectivoe recuperação eficiente de até complexos de baixa abundância de proteínas de grande escala culturas. Espectrometria de massa é, então, usado para identificar as estavelmente co purificação de proteínas com uma sensibilidade elevada (limites de detecção baixos de nanogramas).

Aqui, descrevemos detalhadas passo-a-passo os procedimentos que comumente utilizam para purificação de proteínas sistemática de marcação, e espectrometria de massa com base em análise de complexos de proteínas solúveis de E. coli, que podem ser expandidos e potencialmente adaptada para outras espécies bacterianas, incluindo certos agentes patogénicos oportunistas que são passíveis de recombineering. As interações físicas resultantes muitas vezes pode revelar interessantes componentes inesperados e conexões sugerindo novas ligações mecanicistas. Integração dos dados do PPI com alternativas de associação de dados moleculares, como genéticos (gene-gene) interações e genômica de contexto (GC) previsões podem facilitar a elucidação da organização global molecular de proteínas multi-complexos dentro bicaminhos fisiológicos. As redes geradas por E. coli pode ser usado para obter insights sobre a arquitetura funcional de produtos de genes ortólogos em outros micróbios para que anotações funcionais actualmente não existem.

Protocol

1. Construção de Gene-específico SPA-marcação em E. Strain coli DY330

  1. O plasmídeo pJL148 compreendendo a sequência de DNA SPA-tag e o cassete de canamicina marcador de resistência aos antibióticos (Kan R) são usadas como um modelo na reacção de polimerização em cadeia (PCR) 7. A 45 nt iniciador específico do gene para a frente, localizado imediatamente a montante do codão de paragem do gene alvo em enquadramento com um 27 ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) iniciador tag pb específica para a frente, e a 45 nt de primer reverso específico do gene, localizado imediatamente a jusante do codão de paragem do gene alvo, em moldura com uma pe 27 (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') tag primer reverso específico, são usados ​​para ampliar o SPA-tag e Kan R a partir da cassete de pJL148 utilizando as seguintes condições de ciclos de PCR: 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, 68 ° C durante 2 min 10 s, seguido de 68 ° C durante 10 min. Essas seqüências amplificadas servir a ums substratos para a maquinaria de recombinação ectópica introduzido λ-Red homólogas (ver abaixo).
  2. O produto da PCR é purificado usando um kit de purificação Qiaquick PCR, para remover os sais que podem interferir com a electroporação. O produto purificado PCR é subsequentemente dirigida para integrar na extremidade 3 '(, imediatamente a montante do codão de terminação nativo) de um gene específico em DY330 estirpe em que o λ-Red maquinaria de recombinação é expressa 10.
  3. A estirpe λ DY330-Red expressar é crescida durante a noite em 2 ml de meio Luria-Bertani (LB) a 32 ° C mediante agitação a 180 rpm. 1 ml da cultura durante a noite é posteriormente inoculada em 70 ml de meio LB fresco no frasco de 500 ml. O inóculo é cultivada a 32 ° C mediante agitação a 180 rpm até que a DO600 atinge ~ 0.8.
  4. A cultura é transferida para um novo balão de 250 ml, em que as células são induzidas através da incubação do balão num banho de água a 42 ° C agitando suavemente ao180 rpm durante 15 min. Imediatamente após a indução, o frasco é incubado num banho de lama de gelo e água durante pelo menos 30 min com agitação.
  5. A cultura gelada é imediatamente transferida para um pré-refrigerada tubo de polipropileno de 50 ml e submetida a centrifugação a 3993 xg durante 6 min a 4 ° C. O sedimento de células foi ressuspenso em 50 ml de água gelada estéril e centrifugada mais uma vez em 3993 xg durante 6 min a 4 ° C. O sedimento de células foi então ressuspenso em 1 ml de água fria e transferido para um tubo de 1,5 ml Effendorf, e centrifugado à velocidade máxima durante 20 segundos a 4 ° C. Após dois ou três passos de lavagem com água gelada, o sedimento de células foi ressuspenso em 700 ul finalmente de água gelada estéril, resultando em células electro-competentes.
  6. Através de electroporação, um ul do fragmento amplificado purificada é introduzida em 40 ul de células eletro-competentes. As células são electroporados em um GenePulser da Bio-Rad II, com os seguintes ajustes: 2,5 kV, 25 uF com pulsocontrolador de 200 Ω. Após a recombinação homóloga e de integração, os transformantes que recombinados com êxito a etiqueta / fita no cromossoma são seleccionados com base na resistência ao Kan (Figura 1A). Transformantes múltiplos são selecionados para Western blot para verificar a geração correta (ou seja, sinal positivo) de Spa-marcadas proteínas de fusão com o anticorpo anti-FLAG M2 que é seletiva contra os epítopos bandeira do SPA-tag.
  7. Confirmado carboxi terminal de tensão de fusão SPA-tag é cultivado em larga escala para isolar complexos proteína solúvel a partir de células colhidas usando o protocolo de purificação SPA. A descrição das etapas envolvidas no procedimento de purificação por afinidade de etiquetas é mostrada na Figura 1B.

2. Cultura e Sonication

  1. Inocular 100 ul de uma E. SPA-tagged coli estoque de glicerol em 50 ml de caldo óptimo (TB) meio líquido suplementado com 50 ul de 25 ug / ml of Kan solução num balão cónico de 250 ml. Fazer crescer a cultura durante a noite a 32 ° C.
    Observação: Uma vez que a cassete de λ temperatura induzível Vermelho na estirpe DY330 está sob o controlo de um repressor sensível à temperatura 10, o SPA-tagged estirpe de E. coli é cultivada a 32 ° C.
  2. Transferem-se 10 ml da cultura durante a noite em 990 ml de TB fresco suplementado com 25 ug / ml de Kan num frasco de 4 litros. A cultura é cultivada a 32 ° C com agitação constante a 250 rpm, durante 5 a 6 horas, até que a DO600 atinge a ~ 2-3.
  3. Transferir a E. 1 litro coli cultura SPA-tag para limpar garrafas de centrifugação e centrifugar as células a 4 ° C em Beckman J6-HC centrífuga @ 3993 xg durante 15 min.
  4. O sobrenadante é removido a partir dos frascos de centrifugação. Ressuspender o E. coli peletes de células com 25 ml de tampão de sonicação. Certifique-se de manter as garrafas de centrifugação em gelo em todos os momentos.
  5. O sedimento ressuspenso étransferido para 50 ml de tubo Falcon de polipropileno e congelou-se utilizando azoto líquido. As células congeladas são armazenadas a -80 ° C para uso a longo prazo.
  6. Antes de sonicação, descongelar as células congeladas, mantendo completamente os grânulos em gelo. As amostras descongeladas são transferidas para um copo de aço inoxidável estéril colocada em gelo durante sonicação. A sonda é submerso na amostra e sonicada durante 3 min. Um adicional de 2 minutos deixa-se arrefecer a amostra a partir de um sobreaquecimento.
  7. O lisado celular sonicado é transferida para o tubo de centrifugação estéril pré-refrigerado, e submetido a centrifugação a 4 ° C em centrífuga Beckman utilizando um rotor JA-17 @ 35267 xg (16000 rpm) durante 15 minutos duas vezes.
    Nota: No caso da purificação de proteínas de membrana, o ligado celular é centrifugado sonicado apenas uma vez durante 15 minutos, porque não se sabe em que fracção são as proteínas da membrana, isto é, ou no sedimento ou na fracção sobrenadante. Assim, para evitar a perda excessiva de memproteínas branas, que gira as células durante 15 minutos a alta velocidade de centrifugação e o sobrenadante é subsequentemente processado para purificação (veja as etapas a seguir) em que 1% de detergente é usado para solubilizar as proteínas da membrana.
  8. O sobrenadante do tubo de centrifugação é cuidadosamente transferido para um tubo de polipropileno de 50 ml Falcon e congelados usando azoto líquido. O extracto celular é armazenado congelado sonicado durante um período máximo de 6 meses à temperatura de -80 ° C para uso futuro.

3. A purificação por afinidade

  1. Antes de usar, 100 ul de anti-flag M2 pérolas são lavadas com 10 volumes de tampão de AFC (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% de detergente, e 0,1-0,5 mM TCEP [tris (2-carboxietil) fosfina - ácido clorídrico]), sem o detergente e o agente de redução de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina).
  2. A congelados, extrato celular sonicado é descongelado colocando o tubo em água fria. O extracto celular descongelado é incubado com 3 ul de benzonase nuclease durante 30 min a 4 ° C. A esta mistura, adicionar detergente não iónico Triton X-100 (concentração final do detergente deverá ser de 0,1%) e 200 ul de suspensões anti-FLAG M2 pérolas de agarose.
    Nota: Para todas as purificações de proteínas solúveis, 0,1% de Triton X-100 é utilizado para minimizar a adsorção não específica, enquanto que para a purificação de uma proteína de membrana, diferentes suaves detergentes não-iónicos, tais como o C12E8 (dodecil éter Octaethylene glicol), DDM ( n-dodecil β-D-maltósido) e maltose-neopentil-glicol (MNG) pode ser utilizado a uma concentração de 1% de detergente para melhorar a solubilização. Uma vez que os detergentes diferentes têm diferentes eficiência de solubilização de proteínas de membrana, é recomendável realizar a purificação de proteínas independentes, utilizando mais de um detergente.
  3. O conteúdo é misturado suavemente por rotação do tubo durante 3 horas a 4 ° C, utilizando um agitador LabQuake. Depois de 3 horas de rotação, o tubo é centrifugado a 1700 xg durante 6 min. O sobrenadante é então removed cuidadosamente, tanto quanto possível, sem perturbar o sedimento solto grânulo.
  4. O sedimento foi ressuspenso no sobrenadante remanescente e, em seguida, transferido para um 0,8 4 cm x Bio-Rad polipropileno coluna prep. Certifique-se de remover os tampões de saída do fundo da coluna, para permitir que os eluatos a escorrer por fluxo de gravidade. Lava-se a coluna 5 vezes com o passo de clivagem TEV.
  5. Depois de drenar os eluatos lavados, da saída de fundo da coluna é fechada. À mesma coluna, a clivagem é realizada por adição de ~ 5-10 ul (50 unidades) de protease de TEV e 400 ul de tampão 1X AFC na coluna. Assegurar a fechar o topo da coluna com um tampão. A coluna que contém os grânulos são rodadas suavemente durante a noite a 4 ° C durante a noite utilizando um agitador de LabQuake.
  6. Retire a tampa na parte superior e o tampão de saída na parte inferior da coluna, e drenar os eluatos recuperados após clivagem TEV em uma coluna de fresco contendo 200 ul de suspensões de calmodulina-sepharose grânulos, que é lavado por 10volumes de tampão de ligação a calmodulina.
  7. A parte superior e na parte inferior da coluna estão bem apertados, e o conteúdo da coluna são misturados suavemente por rotação durante 3 horas a 4 ° C, utilizando um agitador LabQuake.
  8. Depois de 3 horas de rotação, o eluato é drenada através da tampa superior e a tampa inferior da coluna. A coluna é lavada quatro vezes com 200 ul de 1X tampão de ligação a calmodulina, seguido por uma lavagem rigorosa com 400 ul de tampão de lavagem a calmodulina.
  9. A proteína ligada foi eluída em quatro fracções de 50 uL em um novo tubo Eppendorf utilizando 1X tampão de eluição calmodulina. A fracção eluida é distribuído em dois tubos Eppendorf limpo em volumes iguais. Ambos os tubos são em seguida secos usando um vácuo de velocidade.
  10. O eluato secas a partir de um tubo é usado para a execução de um gel de coloração de prata, enquanto o outro é armazenado a -80 ° C, antes de utilizar a espectrometria de massa.

4. A coloração de prata

  1. Para a prata staining, metade do volume de 3X SDS (dodecilsulfato de sódio) é adicionado tampão de amostra de 50 ul do eluído seco. Depois de ferver a mistura durante 5 min, as amostras são carregadas num gel de poliacrilamida SDS.
  2. Após o gel ter terminado a execução, é cuidadosamente colocado em solução de fixação (metanol a 50% e 10% de ácido acético) e agitada suavemente num agitador rotativo durante 20 min. O gel é então lavado com etanol a 20% durante 10 min.
  3. O gel é lavado duas vezes fixo cuidadosamente com 500 ml de água destilada duas vezes, durante 10 minutos para assegurar fundo uniforme baixa.
  4. O gel é então agitada suavemente em 500 ml de tiossulfato de sódio para 1 min, seguida de duas etapas de lavagem com água destilada durante 20 segundos.
  5. A água é eliminada, e o gel é incubado em 200 ml de nitrato de prata a 0,1% durante 30 min. Após esse tempo, o nitrato de prata é removida e o gel foi lavado com água destilada durante 20 segundos para remover o excesso de nitrato de prata.
  6. O gel é finalmente agitada à mão em 75 mlda solução de revelação. Quando a intensidade desejada é alcançada, a solução reveladora é descartado e 80 ml de ácido acético é adicionado para parar a reacção. Assegure-se incubar o gel em ácido acético durante um período mínimo de 20 min para a visualização adequada das bandas do gel.

5. Proteólise e Preparação de Amostras para Espectrometria de Massa

  1. Para a amostra seca, adicionar 50 ul de tampão de digestão do e 0,9 ul de 100 mM TCEP-HCl (tris (2-carboxietil) fosfina - ácido clorídrico) e incubar a mistura durante 45 min à temperatura ambiente para a fase de redução. Em seguida, 1 ml de 500 mM de iodoacetamida ea placa é incubada no escuro durante 40 min outro para permitir a alquilação de amostra.
  2. Depois da segunda ronda de incubação, adicionar 1 mg de tripsina imobilizada à mistura e incubar quer a 37 ° C durante 5 horas ou durante a noite à temperatura ambiente. Assegurar a parar a reacção por adição de 1 ul de ácido acético.
  3. Pré-molhado Millipo ore Zip Tip-ponta da pipeta de aspiração por 10 ul da solução de equilíbrio e de molhagem. Dispensar a solução para o lixo. Subsequentemente aspirar 10 ul de solução de lavagem e dispensar a solução para o lixo. Repetir este passo duas vezes.
  4. Para a ligação eficiente da mistura de péptidos para a ponta, pipeta misturar a mistura de péptidos de 20 vezes. A mistura de péptidos que adere à ponta é lavado, aspirando e dispensando a solução de lavagem. Repetir este procedimento duas vezes para a ligação eficiente da mistura de péptidos para a ponta.
  5. Com a ponta contendo o péptido ligado, aspirar 10 ul da solução de equilíbrio e de molhagem, e dispensar para um tubo eppendorf limpo. Repetir este passo duas vezes. Após a secagem das amostras eluídas em vácuo de velocidade, as amostras podem ser analisadas por espectrometria de massa imediatamente ou armazenados a -80 ° C antes da utilização.

6. Identificação de proteínas por LTQ Orbitrap Velos Espectrômetro de Massa

Thcomponentes electrónicos polipeptídicas dos complexos isolados são identificadas usando um Orbitrap LTQ Velos híbrido espectrómetro de massa em tandem. O Orbitrap tem poder de resolução excepcional (> 60.000 Máxima Meia Largura Total a, ou FWHM) e precisão de massa (<2 ppm), que minimiza a MS / MS de amostragem irrelevantes contaminantes não-específicos de fundo detectada em purificações de controlo, enquanto que a elevada velocidade Velos ion trap componente pode detectar e péptidos fragmento baixa abundância utilizando tanto a transferência de electrões e os modos de dissociação induzida por colisão de dissociação. Partidas de confiança elevados entre MS resultante / MS espectros são mapeados para referência E. seqüências de proteína coli usando o algoritmo de pesquisa de banco de dados como Sequest e cada seqüência de correspondência avaliados durante um algoritmo de probabilidade como STATQUEST 11. O número de espectros total, singularidade sequência peptídica e contaminantes detectados no fundo comuns de controlo negativo (isto é. Mock) são considerados purificações para alcançar um baixo empírica falso-distaxa de redescoberta. Os passos seguintes são realizados para identificação de proteínas:

  1. As micro-colunas são embalados com ~ 10 cm de 3 m Luna C-18 e da resina são interligados com uma fonte de iões Proxeon nanoelectrospray que é colocado em linha com o instrumento Orbitrap.
  2. Um fluxo Proxeon nano binário bomba HPLC é usada para fornecer uma taxa de fluxo estável ponta de ~ 300 nl min -1 durante as separações peptídicas.
  3. Para alcançar eluição peptídeo, um gradiente de tampão orgânico é criado de acordo com a complexidade da amostra. Por exemplo, o gradiente que se segue é tipicamente configurado para E. Amostras de E. coli SPA: solvente B é aumentada de 2% a 6% em 1 min, a 24% em 38 min, a 100% em 4 min em seguida, mantida a 100% durante 1 min, em seguida, reduzida para 2% em 1 min, e final mantenha a 2% durante 15 min. A fase móvel tem um solvente de 95% por HPLC de gradiente de água e 5% de ACN com 0,1% de ácido fórmico, enquanto B tem 5% de solvente HPLC gradiente de água e 95% de ACN com 0,1% de ácido fórmico acid. A taxa de fluxo a ponta da agulha está definido para 300 nl min -1 durante 60 min.
  4. Como os ciclos de espectrômetro de massa executado através de uma varredura completa em massa 60.000 resoluções, 10 concomitantes em tandem varreduras em massa de fragmentação são coletados para os íons precursores mais intensos. Exclusão dinâmica, seleção massal monoisotópico, e em tempo real de dados dependentes de características do instrumento de aquisição estão habilitados.
  5. Os espectros são pesquisados ​​utilizando um algoritmo de busca de banco de dados, tais como Sequest contra um banco de dados de E. sequências de proteínas de E. coli, e o resultado é estatisticamente filtrada utilizando um algoritmo de probabilidade, como STAQUEST 11 para assegurar uma taxa de detecção baixa falso. Apenas os candidatos de confiança elevada (99% de probabilidade) são seleccionados, enquanto os jogos mostrando mais do que 10 ppm de massa de erro em comparação com a massa teórica de péptidos são eliminadas de consideração posterior.

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Discussion

Um aspecto chave da abordagem baseada em STDA SPA descrito aqui, é que a marcação é feita dentro do contexto natural cromossómica, assegurando desse modo a regulação do gene normal é mantida (isto é. Isca promotor nativo conservado, portanto os níveis de expressão não é perturbada) e estavelmente nativo associado complexos de proteínas são recuperadas em quase endógenos níveis. Problemas de polaridade operão também são evitados mediante a inclusão de um promotor de orientada para o exterior do marcador seleccionável. Esta abordagem SPA-marcação é suficientemente eficaz para purificar os componentes de baixa abundância de complexos a homogeneidade perto, incluindo montagens associadas à membrana, mesmo que as subunidades são expressas para apenas poucas moléculas por célula bacteriana. No geral, este protocolo pode ser facilmente escalado para purificar-se grande-conjuntos de proteínas solúveis em marcadas E. coli ou, em princípio, quaisquer outras espécies bacterianas para que a marcação via recombineering é possível, ou os que possuem naturalmente elevado transformaçõescapacidade ção, como Acinetobacter, uma força de trabalho emergente da genética bacteriana, que tem sido utilizado, por exemplo, para criar uma biblioteca de genes de nocautes estirpe alvo 13.

Uma preocupação principal inerente às grandes abordagens proteômicas é a identificação de promíscuos não específicos interactores e contaminação traço espúrio. Apesar de duas rondas de enriquecimento, os nossos purificações SPA rotina regularmente detectar contaminantes frequentes, que são geralmente proteínas de alta abundância de limpeza, tais como proteínas ribossomais e acompanhantes, que se ligam de forma não específica à resina cromatograf ica e / ou proteínas de isca. Este problema pode ser atenuado de duas maneiras. Primeiro, o número total de espectro e singularidade de cada proteína identificada com uma isca especial é considerado em relação a um conjunto mais amplo de purificações de várias iscas de proteína independentes e de untagged (isto é tipo. Selvagem) estirpes de controlo negativo (isto é. Exper purificação simulada afinidadeiments) para minimizar falsos positivos associações. Segundo, todas as interações proteína candidatos devem ser validados usando marcação recíproca e purificação do parceiro putativo de ligação, com o objetivo de confirmar de forma independente individuais interações proteína-proteína para evitar casos raros em que a presença do SPA-tag perturba incorporação de proteínas nativas em a montagem da proteína endógena.

STDA pesquisas baseadas proteômicas são limitados pela falta de sensibilidade, em termos de identificação de interacções transientes ou sub-estequiométrica. Em tais casos, os procedimentos de um único passo de purificação pode ser usado para melhorar a detecção de parceiros de interacção mais fracos. Durante o curso do estudo década em curso, comprimento da E. coli interactome, temos visto as capacidades de detecção de espectrômetros de massa da nova geração melhorar constantemente. Instrumentação mais velho é tendenciosa para identificação recorrente de proteínas muito abundantes, muitas vezes impedindo a detecção de abu menosndant mas potencialmente muito importante de proteínas que interagem. Por outro lado, o espectrómetro de massa Orbitrap velos híbrido usamos atualmente acentuadamente melhor resolução, precisão de massa, permitindo assim que a sensibilidade e muito mais eficiente, a detecção de alto rendimento de proteínas de baixa abundância, incluindo interacções transientes. Finalmente, se a natureza da interação é completamente desconhecido sugerimos pesquisadores a: (i) aplicar critérios rigorosos para atribuir pontuação de confiança a todos os jogos da pesquisa putativos banco de dados. Proteínas com dois ou mais péptidos únicos são geralmente consideradas positivas, assumindo cada jogo passa com um limiar de probabilidade mínima de corte de 99% ou maior probabilidade, (ii) não deixe de examinar a especificidade da proteína candidatos interactores gravado com o isco etiquetado comparação com os resultados obtidos com as estirpes de controlo negativo não marcados (experiências simuladas) ou iscos de proteínas não relacionadas (iii) reciprocamente confirmar potenciais interacções que contêm uma proteína desconhecida de interest criando o correspondente SPA fusão isca tag para purificação em grande escala ou validar de pares interações utilizando tradicional co-imunoprecipitação com anticorpos específicos de proteínas ou de tags específicas.

Até à data, usando essa abordagem sistemática, conseguimos marcar e purificar cerca de dois terços do ~ 2750 E. proteínas solúveis em E. coli que expressa de forma detectável sob cultura em meio rico em 1, 2. Temos também adaptado este mesmo método básico para isolar complexos sistematicamente associadas à membrana da proteína, e estão agora a tentativa de purificar cada um dos restantes ~ 1000 E. proteínas de E. coli previsto para ser ligada à membrana. Enquanto a purificação de proteínas da membrana, muitas vezes coloca problemas únicos porque muitas vezes não são eficientemente solubilizada por o tampão de extracção que se utiliza normalmente para o método SPA, a adição de detergentes não iónicos para os buffers permite a solubilização e purificação de uma maioria do E. coli </ Em> proteínas da membrana que tentamos data (Babu et al., Dados não publicados).

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por fundos da Fundação Canadense para Inovação, Canadá Genoma, do Instituto de Genômica de Ontário, o Ministério de Ontário, da Inovação e do Canadian Institutes of Health Research subvenção para JG e AE O E. Vermelha expressando coli DY330 foi um presente tipo de Donald L. Tribunal de Justiça (Instituto Nacional do Câncer, Frederick, MD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I. Antibiotics
Kanamycin Bioshop #KAN201
Ampicillin Bioshop #AMP201
2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone Bioshop #TRP 402
Yeast extract Bioshop #YEX 555
Glycerol Bioshop #GLY 002
K2HPO4 Bioshop #PPM 302
KH2PO4 Bioshop #PPM 303
3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330 Yu et al. (2000)10
pJL148 Zeghouf et al. (2004)7
4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase Fermentas # EP0281
10 X PCR buffer Fermentas # EP0281
10 mM dNTPs Fermentas # EP0281
25 mM MgCl2 Fermentas # EP0281
Agarose Bioshop # AGA002
Loading dye NEB #B7021S
Ethidium bromide Bioshop # ETB444
10X TBE buffer Thermo Scientific #28355
Tris Base Bioshop #TRS001
Boric acid Bioshop #BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0) Sigma # E6768
DNA ladder NEB #N3232L
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit Qiagen #12143
QIAquick PCR purification kit Qiagen #28104
6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler BioRad iCycler
Agarose gel electrophoresis BioRad
Electroporator Bio-Rad GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette Bio-Rad
42 °C water bath shaker Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge Beckman Coulter TS-5.1-500
32 °C Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator Fisher Scientific
7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide Bio-Rad #161-0125
Ammonium persulfate Bioshop # AMP001
n-butanol Sigma # B7906
TEMED Bioshop #TEM001
Whatman No. 1 filter paper Fischer Scientific #09-806A
Mini protean 3 cell Bio-Rad #165-3301
iBlot gel transfer device Invitrogen #IB1001
Nitrocellulose membranes Bio-Rad #162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody Sigma #F3165
Horseradish peroxidase Amersham #NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards Bio-Rad #161-0363
Chemiluminescence reagent PIERCE #1856136
Autoradiography film Clonex Corp #CLEC810
Quick Draw blotting paper Sigma #P7796
C2 platform rocking shaker New Brunswick Scientific, USA
8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator Branson Ultrasonic #23395
NaCl Bioshop #SOD001
Protease inhibitors Roche #800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl Thermo Scientific #20490
9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column Bio-Rad #732-6008
Benzonase nuclease Novagen #70746
Anti-FLAG M2 agarose beads Sigma #A2220
Calmodulin-sepharose beads GE Healthcare #17-0529-01
TEV protease Invitrogen #12575-015
Triton X-100 Sigma #T9284
CaCl2 Sigma #C2661
EGTA Sigma #E3889
LabQuake Shaker Thermolyne #59558
10. Silver Staining Reagents
Methanol Bioshop #MET302
Acetic acid Bioshop t#ACE222
Sodium-thiosulfate Sigma #S-7143
Silver nitrate Fischer Scientific #S181-100
Formaldehyde Bioshop #FOR201
Sodium carbonate Bioshop #SOC512
11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega # V5280
50 mM NH4HCO3 Bioshop #AMC555
1 mM CaCl2 Bioshop #CCL302
Acetonitrile Sigma #A998-4
Formic acid Sigma #F0507
HPLC grade water Sigma #95304
Iodoacetamide Sigma #16125
Millipore Zip-Tip Millipore # ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
12. Labware
4 liter conical flasks VWR #89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes Any Vendor
250 ml conical flaks VWR #29140-045
15 ml sterile culture tubes Thermo Scientific #366052
Cryogenic vials VWR #479-3221
-80 °C freezer Fisher Scientific #13-990-14
Speed vacuum system Thermo Scientific

Buffers and Solutions

1. 1 liter Terrific Broth (TB) media

11 g Bio-Tryptone
22 g Yeast Extract
2% Glycerol
50 ml potassium salt stock solution

2. Potassium Salt Stock Solution

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. Sonication Buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
10% Glycerol
Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

5. TEV cleavage buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

6. Calmodulin binding buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

7. Calmodulin wash buffer

30 mM Tris-HCl pH 7.9
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. Calmodulin elution buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
100 mM NaCl
10 mM EGTA
0.1-0.5 mM TCEP

9. Developing solution (1L)

37% Formaldehyde
30 g sodium carbonate
1000 ml distilled water

10. Digestion buffer

50 mM NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. Wetting and Equilibration solution

70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid

12. Washing solution

100% H2O in 0.1% formic acid

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References

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Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem
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Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).More

Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).

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