Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Определение белковых комплексов в doi: 10.3791/4057 Published: November 12, 2012

Summary

Affinity очистки меченых белков в сочетании с масс-спектрометрии (ППМ) является мощным методом для систематического отображения сети взаимодействия белка и для исследования механистической основе биологических процессов. Здесь мы описываем оптимизированный последовательных пептидов близости (SPA) ППМ процедуры, разработанные для бактерии

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Строительство ген-специфического SPA-пометки в E. Штамм кишечной DY330

  1. Плазмиды pJL148 охватывает SPA-теги последовательности ДНК и канамицин антибиотиков кассеты маркер устойчивости (Кан R) используется в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) 7. 45 нуклеотидов гена конкретных прямой праймер, расположенный непосредственно перед остановкой целевого гена кодон в рамке с 27 б.п. ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) теги конкретных прямого праймера, и в 45 нуклеотидов генов конкретного обратный праймер, расположенный сразу вниз по течению от остановки целевого гена кодон в рамке с 27 б.п. (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') тег специфического праймера обратного, используется для усиления SPA-теги и Кан R кассету из pJL148, используя следующие велосипедные Условия ПЦР: 94 ° C в течение 5 мин, 30 циклов при 94 ° C в течение 1 мин, 55 ° C в течение 1 мин, 68 ° С в течение 2 мин 10 сек, а затем 68 ° С в течение 10 мин. Эти усиленные последовательности служитьс субстратом для эктопически введен λ-красный гомологичной рекомбинации техники (см. ниже).
  2. ПЦР-продукт очищают с использованием очистки QIAquick ПЦР комплект для удаления солей, которые могут помешать электропорации. Очищенный продукт ПЦР в дальнейшем направлены на интеграцию в конце 3 '(непосредственно перед родной стоп-кодон) конкретного гена в DY330 штамм, в котором λ-красный рекомбинации техники выражается 10.
  3. DY330 λ-красный выражения штамм выращивают в течение ночи в 2 мл Лурия-Bertani (LB) среде при 32 ° C при встряхивании при 180 оборотах в минуту. 1 мл ночной культуры в дальнейшем вносили в 70 мл свежей среды LB в 500 мл коническую колбу. Посевной выращивают при 32 ° C при встряхивании на 180 оборотов в минуту до OD 600 достигает ~ 0,8.
  4. Культуры переносят в свежий 250 мл коническую колбу, в которой клетки индуцированные инкубирования колбу в водяную баню при 42 ° C, осторожно встряхивая при180 оборотов в минуту в течение 15 мин. Сразу же после индукции, колбы инкубируют в суспензии бане с ледяной водой в течение не менее 30 мин при встряхивании.
  5. Ледяной культуры немедленно переносится в предварительно охлажденный трубы полипропиленовые 50 мл и подвергали центрифугирования при 3993 х г в течение 6 мин при 4 ° C. Осадок клеток суспендируют в 50 мл ледяного стерильной водой и центрифугируют еще раз в 3993 мкг в течение 6 мин при 4 ° C. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл холодной воды и переносят в 1,5 мл трубки Effendorf, и центрифугировали при максимальной скорости в течение 20 секунд при 4 ° C. После двух или трех этапов промывки с ледяной водой, осадок клеток ресуспендируют, наконец, в 700 мкл ледяной стерильной воды, в результате электро-компетентных клеток.
  6. С помощью электропорации, один мкл ампликонов очищенный вводят в 40 мкл электро-компетентных клеток. Клетки электропорации в Bio-Rad GenePulser II со следующими настройками: 2,5 кВ, 25 мкФ с импульснымКонтроллер на 200 Ω. После гомологичной рекомбинации и интеграции, трансформанты, которые успешно рекомбинируют тег / кассеты в хромосому выбирается в зависимости от сопротивления Кан (рис. 1А). Несколько трансформанты отбирают для вестерн-блоттинга, чтобы проверить правильность поколения (т.е. положительный сигнал) СПА-меченных белков слияния с анти-FLAG M2 антитела, которые избирательно против FLAG эпитопов SPA-тегов.
  7. Подтверждено карбокси терминала SPA-теги слияния штамм культивировали на крупномасштабные, чтобы изолировать растворимые комплексы белка из собранных клеток с использованием протокола SPA очистки. Схема этапов процедуры очистки тегу сродство показано на рисунке 1b.

2. Культивирование и Озвучивание

  1. Инокуляции 100 мкл SPA-отмеченных E. палочки глицерина акций в 50 мл бульона потрясающий (ТБ) жидкой среде, дополненной 50 мкл 25 мкг / мл оF Кан решения в 250 мл коническую колбу. Рост культуры в течение ночи при 32 ° C.
    Примечание: Так как температура индуцируемых λ Красной кассету в штамм DY330 находится под контролем чувствительных к температуре репрессор 10, SPA-отмеченных штамма E.coli выращивают при температуре 32 ° C.
  2. Передача 10 мл ночной культуры в 990 мл свежего ТБ с добавлением 25 мкг / мл Кан в 4-литровую колбу. Культуру выращивают при температуре 32 ° C с постоянной тряски при 250 оборотах в минуту, от 5 до 6 часов, пока OD 600 достигает ~ 2 до 3.
  3. Передача 1 литр E. палочки SPA-теги культуры для очистки центрифугированием бутылки и спина клеток при 4 ° С в Beckman J6-HC центрифуги @ 3993 х г в течение 15 мин.
  4. Супернатант удаляют из бутылки центрифугирования. Ресуспендируют E. кишечной клетки окатышей с 25 мл ультразвуком буфера. Обеспечить, чтобы сохранить центрифугирования бутылки на лед во все времена.
  5. Ресуспендированный осадок являетсяпередано 50 мл трубки сокола полипропилена и замораживают с использованием жидкого азота. Замороженных клеток хранится при температуре -80 ° С в течение длительного использования.
  6. Перед обработкой ультразвуком, оттаивать замороженные клетки полностью, сохраняя окатышей на льду. Талых образцы переносят в стерильную чашку из нержавеющей стали помещают на лед для обработки ультразвуком. Зонд погружается в образец и обрабатывали ультразвуком в течение 3 мин. Дополнительные 2 мин охлаждают образца от перегрева.
  7. Ультразвуком клеточный лизат переносится в предварительно охлажденный стерильную пробирку центрифугированием и подвергали центрифугированием при 4 ° С в центрифуге Beckman использованием JA-17 ротор @ 35267 мкг (16.000 оборотов в минуту) в течение 15 мин дважды.
    Примечание: В случае мембранной очистки белков, ультразвуком клеточный лизат центрифугируют только один раз в течение 15 минут, потому что мы не знаем, в которых доля мембранных белков, то есть либо в гранулах или в надосадочной фракции. Таким образом, чтобы избежать лишних потерь сувенирыбранные белки, мы вращаем клетки в течение 15 мин на высокой скорости центрифугирования и супернатант затем обрабатываются для очистки (см. ниже), где 1% моющего средства для растворения мембранных белков.
  8. Супернатант от центрифугирования трубку осторожно переносят в 50 мл трубки сокола полипропилена и замораживают с использованием жидкого азота. Ультразвуком замороженного клеточного экстракта сохраняется в течение не более 6 месяцев при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.

3. Аффинной очистки

  1. Перед использованием 100 мкл Anti-Flag M2 бисер омывается 10 томов АФК буфера (30 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 0,1% моющего средства, и 0.1-0.5 мМ TCEP [трис (2-карбоксиэтил) фосфин - соляная кислота]) без моющих средств и восстановителя TCEP (трис (2-карбоксиэтил) фосфин).
  2. Замороженные, ультразвуком клеточного экстракта размораживают путем размещения трубы в холодной воде. Талых клеточный экстракт инкубируют с 3 мкл бензNase нуклеазы в течение 30 мин при 4 ° C. К этой смеси добавить неионных моющих средств Triton X-100 (конечная концентрация моющего средства должна быть 0,1%) и 200 мкл суспензии Anti-Flag M2 бисером агарозы.
    Примечание: Для всех растворимых очищения белка, 0,1% Triton X-100 используется для минимизации неспецифической адсорбции, где, как для очистки мембранного белка, различные мягкие неионных детергентов, таких как C12E8 (Octaethylene эфире додецилсульфата гликоль), DDM ( н-додецил β-D-maltoside) и мальтоза-неопентилгликоля (MNG) могут быть использованы на 1% моющего средства для повышения концентрации солюбилизации. Так как различные моющие средства имеют различную эффективность солюбилизации мембранных белков, рекомендуется выполнять независимые очищения белка использовании более одного моющего средства.
  3. Содержание осторожно перемешивают, вращая трубку в течение 3 ч при температуре 4 ° С с использованием LabQuake шейкере. Через 3 часа вращения, трубки центрифугируют при 1700 х г в течение 6 мин. Супернатант то гemoved тщательно, насколько это возможно, не нарушая свободную борта гранул.
  4. Осадок суспендируют в остальных супернатанта, а затем переносят в 0,8 х 4 см Bio-Rad колонке полипропилена преп. Обеспечить, чтобы снять нижнюю пробки выходе из колонки, чтобы элюатов для слива самотеком. Промойте колонку 5 раз TEV шаг расщепления.
  5. После слива промытый элюатов, нижняя выходе из колонки закрыт. К этой же колонке, расщепление осуществляется путем добавления ~ 5 до 10 мкл (50 единиц) TEV протеазы и 400 мкл буфера 1X АФК на колонку. Обеспечить, чтобы закрыть верхнюю часть колонны с крышкой. Колонка, содержащая гранулы поворачивается мягко ночи при 4 ° С в течение ночи помощью LabQuake шейкере.
  6. Снимите крышку на верхней и выходе пробку в нижней части колонны, и слейте элюатов восстановился после расщепления TEV в свежую колонку, содержащую 200 мкл суспензии кальмодулин-сефарозе бисером, который промывают на 10Объемы кальмодулин связывающего буфера.
  7. Оба верхней и нижней части колонны крепятся плотно, и содержимое в колонке смешиваются осторожно вращая в течение 3 ч при температуре 4 ° С с использованием LabQuake шейкере.
  8. Через 3 часа вращения, элюата сливают, удалив верхнюю крышку и нижнюю пробку колонны. Колонку промывают четыре раза 200 мкл 1X кальмодулин буфера для связывания следуют один строгий мыть с 400 мкл промывочного буфера кальмодулина.
  9. Связанного белка вымывается в четырех фракций 50 мкл в новую пробирку Eppendorf использованием 1X кальмодулин элюции буфером. Элюированную фракции распространяется в двух чистые трубы Эппендорф в равных объемах. Обе трубы сушат использованием скорости вакуум.
  10. Высушенные элюата из одной трубки используется для запуска гель окрашивания серебром, а другой хранится в -80 ° C, перед использованием масс-спектрометрии.

4. Окрашиванием серебром

  1. Для серебра stainiнг, половина объема 3X SDS (сульфат натрия додецилсульфата) буфера для образца добавляют 50 мл сухого элюата. После кипячения смесь в течение 5 мин, образцы загружают в полиакриламидном геле SDS.
  2. После того, как гель завершения работы, он осторожно положил в фиксирующем растворе (50% метанола и 10%-ной уксусной кислоты) и перемешивают осторожно на ротационном шейкере в течение 20 мин. Гель затем промыть в 20% этаноле в течение 10 мин.
  3. Фиксированные гель тщательно промывают два раза по 500 мл дважды дистиллированной воде в течение 10 мин, чтобы обеспечить низкий фон форма.
  4. Гель затем перемешивают осторожно в 500 мл натрия тиосульфат в течение 1 мин, затем две стадии промывки дистиллированной водой в течение 20 сек.
  5. Вода сбрасывается, и гель инкубируют в 200 мл 0,1% раствора нитрата серебра в течение 30 мин. После этого времени, нитрат серебра удаляют, а гель промывают дистиллированной воды в течение 20 секунд, чтобы удалить избыток нитрата серебра.
  6. Гель, наконец, ручной перемешивают в 75 млразвивающейся решение. Когда желаемая интенсивность достигается, развивающиеся решение отбрасывается и 80 мл уксусной кислоты добавляют, чтобы остановить реакцию. Обеспечить для инкубации гель в уксусной кислоте в течение как минимум 20 минут для правильной визуализации геля полосы.

5. Протеолиз и подготовки проб для масс-спектрометрии

  1. Для высушенного образца, добавить 50 мкл буфера пищеварения и 0,9 мкл 100 мМ TCEP-HCl (трис (2-карбоксиэтил) фосфин - соляная кислота) и инкубируют смесь в течение 45 мин при комнатной температуре для уменьшения шага. Далее, 1 мкл 500 мМ иодацетамида и инкубируют в темноте в течение еще 40 минут, чтобы позволить образца алкилирования.
  2. После второго раунда инкубации, добавьте 1 мкг иммобилизованным трипсином к смеси и инкубировать либо при 37 ° C в течение 5 часов или на ночь при комнатной температуре. Обеспечить, чтобы остановить реакцию добавлением 1 мкл уксусной кислоты.
  3. Предварительно мокрой MillipoRe Zip-Tip пипетки путем аспирации 10 мкл смачивания и уравновешивания раствора. Внесите решение впустую. Впоследствии аспирации 10 мкл моющего раствора и отказаться от решения впустую. Повторите этот шаг дважды.
  4. Для эффективного связывания пептида смесь до кончика, пипетки перемешать смесь пептидов в 20 раз. Смесь пептидов, которые присоединились к кончику смывается аспирации и дозирования моющего раствора. Повторите эту процедуру дважды для эффективного связывания пептида смеси чаевых.
  5. С кончика содержащие связанный пептид, аспирацию 10 мкл смачивания и уравновешивания решение, и обойтись в чистую пробирку Эппендорф. Повторите этот шаг в два раза. После высыхания Элюированную образцов в скорости вакуум, образцы могут быть проанализированы сразу же методом масс-спектрометрии или хранится при температуре -80 ° C до использования.

6. Идентификации белков по LTQ Orbitrap Velos Масс-спектрометр

Thэлектронной полипептидных компонентов изолированные комплексы идентифицируются с помощью Orbitrap LTQ Velos гибридных тандемной масс-спектрометра. Orbitrap имеет исключительное разрешающей способностью (> 60000 Полная максимальная полуширина или FWHM) и масс точностью (<2 частей на миллион), что сводит к минимуму MS / MS выборки не имеет значения неспецифический фон загрязнения обнаружены в управление очищений, в то время как высокая скорость Velos ионной ловушкой компонент можно обнаружить и фрагмент низким пептиды изобилия, используя как перенос электронов диссоциации и индуцированных столкновениями диссоциации режимах. Высокая матчей доверия между результатом MS / MS спектры сопоставлены с ссылкой E. последовательностей белков палочка с помощью алгоритма поиска в базе данных, как SEQUEST и каждой соответствующей последовательности рассмотрен во время вероятность алгоритм, как STATQUEST 11. Общее количество спектров пептидов уникальность последовательность и общих загрязнений фона обнаружено в отрицательном контроле (то есть. Макет) очищений считаются для достижения низкой эмпирической ложно-дисплееоткрытием курс. Следующие шаги выполняются для идентификации белков:

  1. Микро-колонны упакованы с ~ 10 см 3 мкм Luna-C 18 смолой и сопряжены с ионом Proxeon nanoelectrospray источника, который находится в соответствии с Orbitrap инструмента.
  2. Поток двоичных Proxeon нано HPLC насоса используются, чтобы предоставить стабильную скорость потока оконечности п ~ 300 мин -1 в течение пептида увольнений.
  3. Для достижения пептида элюирования органических градиент буфера устанавливается в соответствии с образцом сложности. Например, следующий градиент, как правило, созданы для E. палочки SPA образцов: растворитель B увеличен с 2% до 6% в 1 мин, до 24% в 38 мин, до 100% в следующие 4 мин, состоявшегося на 100% в течение 1 мин, затем снизились до 2% в 1 мин, и окончательное держать на уровне 2% в течение 15 мин. Подвижная фаза растворителя имеет 95% ВЭЖХ градиент воды и 5% ACN с 0,1% муравьиной кислоты, в то время как растворитель B имеет 5% ВЭЖХ градиент воды и 95% ACN с 0,1% муравьиной ациD. Расход на кончике иглы установлено до 300 NL мин -1 в течение 60 мин.
  4. Когда масса циклов спектрометра работать через одну полную проверку массы в 60000 резолюций, 10 сопутствующих сканирование фрагментация тандемной масс собираются для наиболее интенсивные ионы предшественника. Динамические исключения, моноизотопном выбор массы и данных в реальном времени зависит от особенностей приобретения инструмент включен.
  5. Спектры поиск с использованием алгоритма поиска в базах данных, таких как SEQUEST по базе данных E. палочки белковых последовательностей, и результат статистически фильтровали с использованием алгоритма вероятность таких как STAQUEST 11 по обеспечению низкий уровень ложных открытий. Только высокое доверие (99% вероятности) кандидаты отбираются, в то время матчей показывать более 10 млн массу ошибки по сравнению с теоретической массы пептида исключается из дальнейшего рассмотрения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ключевым аспектом SPA-подхода ППМ описано здесь является то, что пометки осуществляется в пределах естественной хромосомной контексте, обеспечивая тем самым нормальное регулирование генов сохраняется (то есть. Родной промоутер приманки сохранились, следовательно, уровни экспрессии не возмущается) и родным стабильно связанного белковых комплексов будут восстановлены в ближайшее эндогенного уровня. Вопросы Operon полярности также избежать, в том числе внешне ориентированной промоутер в селективного маркера. Этот SPA-теги подход является достаточно эффективным для очистки компонентов с низким обилием комплексов вблизи однородности, в том числе ассоциированных с мембранами сборки, даже если подразделений выражается до всего несколько молекул в бактериальную клетку. В целом, этот протокол может быть легко масштабных мер для очистки больших наборов отмеченных растворимых белков в E. палочки или в принципе любого другого вида бактерий, для которых пометки через recombineering возможно, или те, которые обладают высоким естественным преобразованиемния возможностей, как Acinetobacter, возникающих рабочая лошадка бактериальной генетики, которая была использована, например, для создания штамма библиотеке целевого гена нокаутом 13.

Одной из основных проблем присущих крупномасштабных протеомных подходов является определение беспорядочную неспецифической interactors и ложных следов загрязнения. Несмотря на два этапа обогащения нашей повседневной очищение SPA регулярно обнаружения частых загрязнителей, которые, как правило, высоким обилием уборка белки, такие как белки рибосом и сопровождающих, которые связываются неспецифически в хроматографических смол и / или приманку белков. Эта проблема может быть смягчена в двух направлениях. Во-первых, общее число спектральных и уникальность каждого белка отождествляется с конкретной приманки считается по отношению к более широкому набору очищения от нескольких несвязанных приманки белка и от немаркированные (то есть. Дикий тип) отрицательные штаммы контроля (то есть. Макет эксперимента аффинной очисткипериментов), чтобы минимизировать ложные положительные ассоциации. Во-вторых, все взаимодействия кандидата белка должно быть подтверждено взаимное использование маркировки и очистки предполагаемого партнера по связыванию, с целью самостоятельно подтверждающих индивидуальный белок-белковых взаимодействий, чтобы избежать редких случаях, когда присутствие SPA-теги возмущает включение нативных белков в эндогенных сборки белка.

ППМ на основе протеомных исследования ограничены из-за отсутствия чувствительности в плане определения временной или субстехиометрических взаимодействия. В таких случаях одним шагом процедуры очистки могут быть использованы для улучшения обнаружения слабых партнеров взаимодействия. В ходе нашей текущей, десятилетнего изучения E. палочки интерактома, мы видели возможности обнаружения новых масс-спектрометров поколения неуклонно улучшаться. Старые приборы смещена к повторяющимся идентификации весьма распространенных белков, часто исключающих обнаружения меньше Абу-ndant, но потенциально очень важным взаимодействующих белков. Наоборот, Orbitrap Velos гибридного масс-спектрометра настоящее время мы используем заметно улучшилось разрешение, масса точность и чувствительность таким образом, позволяя гораздо более эффективно, высокая пропускная способность обнаружения низких изобилие белков, в том числе переходных взаимодействий. Наконец, если характер взаимодействия совершенно неизвестен мы предлагаем исследователей: (I) применяются строгие критерии назначить доверия оценки для всех предполагаемых матчей базы данных поиска. Белки с двумя или более уникальных пептидов, которые обычно считаются положительными, предполагая, что каждый матч проходит с минимальным порогом вероятности отключения на 99% или выше вероятность; (II), убедитесь, что для изучения специфики interactors кандидата белка, записанных с помощью отмеченных приманку в по сравнению с результатами, полученными с отрицательным контролем немаркированные штаммов (макет экспериментов) или не связанных приманки белка; (III) взаимно подтвердить потенциал взаимодействия содержащий неизвестный белок межEst путем создания соответствующей SPA теги приманки слияния для крупномасштабной очистки или проверки парных взаимодействий с использованием традиционных совместной иммунопреципитации с конкретным белком или тег специфических антител.

На сегодняшний день, используя эту системный подход, нам удалось теги и очистить около двух третей ~ 2750 E. палочки растворимые белки, которые детектируемо выразил в культуре в обогащенной среде 1, 2. Мы также адаптировать эту же основной метод систематического изолировать мембран-ассоциированных комплексов белков, и в настоящее время пытаются очистить каждый из оставшихся ~ 1000 E. палочки белков прогнозам, будет мембраны связаны. В то время как очистка мембранных белков часто ставит уникальные вопросы, потому что они часто не эффективно растворяли в буфере для экстракции, что мы обычно используем для метода SPA, добавление неионных детергентов нашего буфера позволяет солюбилизации и очистки большинства E. палочка </ EM> мембранных белков, мы попытались дату (Бабу и соавт., Неопубликованные данные).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана за счет средств от Канадского фонда инноваций, Геном Канада, Онтарио геномики Института, Онтарио Министерство инноваций и Канадский институт исследований в области здравоохранения гранта JG и AE Красный выражения E. Штамм DY330 был своего рода подарок от Donald L. суд (Национальный институт рака, Фредерик, Мэриленд).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I. Antibiotics
Kanamycin Bioshop #KAN201
Ampicillin Bioshop #AMP201
2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone Bioshop #TRP 402
Yeast extract Bioshop #YEX 555
Glycerol Bioshop #GLY 002
K2HPO4 Bioshop #PPM 302
KH2PO4 Bioshop #PPM 303
3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330 Yu et al. (2000)10
pJL148 Zeghouf et al. (2004)7
4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase Fermentas # EP0281
10 X PCR buffer Fermentas # EP0281
10 mM dNTPs Fermentas # EP0281
25 mM MgCl2 Fermentas # EP0281
Agarose Bioshop # AGA002
Loading dye NEB #B7021S
Ethidium bromide Bioshop # ETB444
10X TBE buffer Thermo Scientific #28355
Tris Base Bioshop #TRS001
Boric acid Bioshop #BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0) Sigma # E6768
DNA ladder NEB #N3232L
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit Qiagen #12143
QIAquick PCR purification kit Qiagen #28104
6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler BioRad iCycler
Agarose gel electrophoresis BioRad
Electroporator Bio-Rad GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette Bio-Rad
42 °C water bath shaker Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge Beckman Coulter TS-5.1-500
32 °C Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator Fisher Scientific
7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide Bio-Rad #161-0125
Ammonium persulfate Bioshop # AMP001
n-butanol Sigma # B7906
TEMED Bioshop #TEM001
Whatman No. 1 filter paper Fischer Scientific #09-806A
Mini protean 3 cell Bio-Rad #165-3301
iBlot gel transfer device Invitrogen #IB1001
Nitrocellulose membranes Bio-Rad #162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody Sigma #F3165
Horseradish peroxidase Amersham #NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards Bio-Rad #161-0363
Chemiluminescence reagent PIERCE #1856136
Autoradiography film Clonex Corp #CLEC810
Quick Draw blotting paper Sigma #P7796
C2 platform rocking shaker New Brunswick Scientific, USA
8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator Branson Ultrasonic #23395
NaCl Bioshop #SOD001
Protease inhibitors Roche #800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl Thermo Scientific #20490
9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column Bio-Rad #732-6008
Benzonase nuclease Novagen #70746
Anti-FLAG M2 agarose beads Sigma #A2220
Calmodulin-sepharose beads GE Healthcare #17-0529-01
TEV protease Invitrogen #12575-015
Triton X-100 Sigma #T9284
CaCl2 Sigma #C2661
EGTA Sigma #E3889
LabQuake Shaker Thermolyne #59558
10. Silver Staining Reagents
Methanol Bioshop #MET302
Acetic acid Bioshop t#ACE222
Sodium-thiosulfate Sigma #S-7143
Silver nitrate Fischer Scientific #S181-100
Formaldehyde Bioshop #FOR201
Sodium carbonate Bioshop #SOC512
11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega # V5280
50 mM NH4HCO3 Bioshop #AMC555
1 mM CaCl2 Bioshop #CCL302
Acetonitrile Sigma #A998-4
Formic acid Sigma #F0507
HPLC grade water Sigma #95304
Iodoacetamide Sigma #16125
Millipore Zip-Tip Millipore # ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
12. Labware
4 liter conical flasks VWR #89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes Any Vendor
250 ml conical flaks VWR #29140-045
15 ml sterile culture tubes Thermo Scientific #366052
Cryogenic vials VWR #479-3221
-80 °C freezer Fisher Scientific #13-990-14
Speed vacuum system Thermo Scientific

Buffers and Solutions

1. 1 liter Terrific Broth (TB) media

11 g Bio-Tryptone
22 g Yeast Extract
2% Glycerol
50 ml potassium salt stock solution

2. Potassium Salt Stock Solution

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. Sonication Buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
10% Glycerol
Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

5. TEV cleavage buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

6. Calmodulin binding buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

7. Calmodulin wash buffer

30 mM Tris-HCl pH 7.9
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. Calmodulin elution buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
100 mM NaCl
10 mM EGTA
0.1-0.5 mM TCEP

9. Developing solution (1L)

37% Formaldehyde
30 g sodium carbonate
1000 ml distilled water

10. Digestion buffer

50 mM NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. Wetting and Equilibration solution

70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid

12. Washing solution

100% H2O in 0.1% formic acid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
  2. Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
  3. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  4. Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
  5. Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
  6. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
  7. Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
  8. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  9. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  10. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
  11. Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
  12. Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
  13. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
  14. Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
Определение белковых комплексов в<em&gt; Кишечной палочки</em&gt; С помощью последовательного аффинной очистки пептидов в сочетании с тандемной масс-спектрометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).More

Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter