Summary

Identifiering av proteinkomplex i<em> Escherichia coli</em> Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Published: November 12, 2012
doi:

Summary

Affinitetsrening av märkta proteiner i kombination med masspektrometri (truppminor) är en kraftfull metod för systematisk kartläggning av nätverk proteininteraktioner och för undersökning av mekanistiska grunden för biologiska processer. Här beskriver vi en optimerad sekventiell peptid affinitet (SPA) truppminor förfarande utvecklats för bakterien<em> Escherichia coli</em> Som kan användas för att isolera och karakterisera stabila flera proteinkomplex till nära homogenitet även från låga kopieantal per cell.

Abstract

Eftersom de flesta cellulära processer förmedlas av makromolekylära församlingar, systematisk identifiering av protein-protein interaktioner (PPI) och identifiering av subenheten sammansättning av flera proteinkomplex kan ge insikt i geners funktion och öka förståelsen av biologiska system 1, 2. Fysiska samverkan kan mappas med hög tillförsikt vialarge skala isolering och karaktärisering av endogena protein komplexen med nära fysiologiska förhållanden baserade på affinitetsrening av kromosomalt-märkta proteiner i kombination med masspektrometri (truppminor). Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt tillämpats i evolutionärt olika organismer, inklusive jäst, flugor, maskar, däggdjursceller och bakterier 1-6. I synnerhet, har vi genererat en karboxiterminal peptid sekventiell affinitet (SPA) dubbla märkning för affinitets-rening nativa proteinkomplex från odlade gramnegativa Escherichia coli, med användning av GEnetically-lätthanterlig värd laboratoriestammar som är väl lämpade för genomet hela undersökningar av den grundläggande biologi och bevarade processer prokaryoter 1, 2, 7. Vår SPA-märkningssystem är analog med tandem affinitetsrening metod som ursprungligen utvecklades för jäst 8, 9, och består av en calmodulin-bindande peptid (CBP) följt av klyvningsstället för den mycket specifika tobak etch virus (TEV) proteas och tre kopior av FLAG-epitopen (3X FLAG), vilket möjliggör två på varandra följande rundor av affinitetsanrikning. Efter kassett amplifiering sekvensspecifika linjära PCR-produkter som kodar för SPA-tagg och en selekterbar markör integrerad och uttryckt i ram som karboxiterminala fusioner i en DY330 bakgrund som induceras att transient uttrycka en högeffektiv heterolog bakteriofag lambda rekombinationssystem 10. Efterföljande dubbla steg rening med kalmodulin och anti-FLAG pärlor affinitet möjliggör mycket selektivaoch effektiv indrivning av även låga komplex överflöd protein från storskaliga kulturer. Tandemmasspektrometri används sedan för att identifiera de stabilt sam-rening av proteiner med hög känslighet (låga nanogram detektionsgränser).

Här beskriver vi detaljerade steg-för-steg-anvisningar vi ofta använder för systematisk protein märkning, rening och masspektrometri-baserad analys av lösligt protein komplex från E. coli, som kan skalas upp och eventuellt anpassas till andra bakteriearter, inklusive vissa opportunistiska patogener som är mottagliga för recombineering. De resulterande fysiska interaktioner kan ofta avslöja intressanta oväntade komponenter och anslutningar tyder nya mekanistiska länkar. Integrering av PPI-data med alternativa molekylära föreningen data såsom genetiska (gen-gen) interaktioner och genomiska-sammanhang (GC) förutsägelser kan underlätta klargörande av den globala molekylära organisationen av multi-proteinkomplex inom bigiska vägar. Nätverken som genereras för E. E. coli kan användas för att få kunskap om den funktionella arkitektur ortologa genprodukter i andra mikrober som funktionella anteckningar närvarande saknas.

Protocol

1. Konstruktion av genspecifika SPA-märkning i E. E. coli DY330 stam Plasmiden pJL148 omfattar SPA-taggen DNA-sekvensen och kanamycin antibiotikaresistensmarkör kassett (Kan R) används som en mall i polymeraskedjereaktionen (PCR)-amplifiering 7. En 45 nt genspecifika framåtriktad primer, placerad omedelbart uppströms om målgenen stoppkodon i ram med en 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') tagg specifik framåtriktad primer, och en 45 nt genspecifik omvänd p…

Representative Results

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon…

Discussion

En viktig aspekt av SPA-baserade truppminor tillvägagångssätt som beskrivs här är att märkning utförs inom den naturliga kromosomala sammanhang och därigenom säkerställa normal genreglering bibehålls (dvs.. Infödda bete promotor bevaras, därför uttrycksnivåer inte störs) och infödda stabilt-associerade proteinkomplex återvinns vid nära-endogena nivåer. Operon polaritet frågor undviks också genom att inkludera en utåt orienterad promotor i den selekterbara markören. Denna SPA-märkning ti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av medel från den kanadensiska stiftelsen för innovation, Genome Canada, Ontario Genomics Institute, Ontario ministeriet för innovation, och den kanadensiska Institutes of Health Research bidrag till JG och AE Red uttrycker E. coli-stam DY330 var en vänlig gåva från Donald L. domstolen (National Cancer Institute, Frederick, MD).

Materials

Materials Vendor and Catalog Numbers  
      I. Antibiotics
Kanamycin Bioshop #KAN201  
Ampicillin Bioshop #AMP201  
      2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone Bioshop #TRP 402  
Yeast extract Bioshop #YEX 555  
Glycerol Bioshop #GLY 002  
K2HPO4 Bioshop #PPM 302  
KH2PO4 Bioshop #PPM 303  
      3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330   Yu et al. (2000)10  
pJL148   Zeghouf et al. (2004)7  
      4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase Fermentas # EP0281  
10 X PCR buffer Fermentas # EP0281  
10 mM dNTPs Fermentas # EP0281  
25 mM MgCl2 Fermentas # EP0281  
Agarose Bioshop # AGA002  
Loading dye NEB #B7021S  
Ethidium bromide Bioshop # ETB444  
10X TBE buffer Thermo Scientific #28355  
Tris Base Bioshop #TRS001  
Boric acid Bioshop #BOR001  
0.5 M EDTA (pH 8.0) Sigma # E6768  
DNA ladder NEB #N3232L  
      5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit Qiagen #12143  
QIAquick PCR purification kit Qiagen #28104  
      6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler BioRad iCycler  
Agarose gel electrophoresis BioRad    
Electroporator Bio-Rad GenePulser II  
0.2 cm electroporation cuvette Bio-Rad    
42 °C water bath shaker   Innova 3100  
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge Beckman Coulter TS-5.1-500  
32 °C Shaker New Brunswick Scientific, USA    
32 °C large Shaker New Brunswick Scientific, USA    
32 °C plate incubator Fisher Scientific    
      7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide Bio-Rad #161-0125  
Ammonium persulfate Bioshop # AMP001  
n-butanol Sigma # B7906  
TEMED Bioshop #TEM001  
Whatman No. 1 filter paper Fischer Scientific #09-806A  
Mini protean 3 cell Bio-Rad #165-3301  
iBlot gel transfer device Invitrogen #IB1001  
Nitrocellulose membranes Bio-Rad #162-0115  
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody Sigma #F3165  
Horseradish peroxidase Amersham #NA931V  
Pre-stained protein molecular weight standards Bio-Rad #161-0363  
Chemiluminescence reagent PIERCE #1856136  
Autoradiography film Clonex Corp #CLEC810  
Quick Draw blotting paper Sigma #P7796  
C2 platform rocking shaker New Brunswick Scientific, USA    
      8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator Branson Ultrasonic #23395  
NaCl Bioshop #SOD001  
Protease inhibitors Roche #800-363-5887  
0.5 mM TCEP-HCl Thermo Scientific #20490  
      9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column Bio-Rad #732-6008  
Benzonase nuclease Novagen #70746  
Anti-FLAG M2 agarose beads Sigma #A2220  
Calmodulin-sepharose beads GE Healthcare #17-0529-01  
TEV protease Invitrogen #12575-015  
Triton X-100 Sigma #T9284  
CaCl2 Sigma #C2661  
EGTA Sigma #E3889  
LabQuake Shaker Thermolyne #59558  
      10. Silver Staining Reagents
Methanol Bioshop #MET302  
Acetic acid Bioshop t#ACE222  
Sodium-thiosulfate Sigma #S-7143  
Silver nitrate Fischer Scientific #S181-100  
Formaldehyde Bioshop #FOR201  
Sodium carbonate Bioshop #SOC512  
      11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega # V5280  
50 mM NH4HCO3 Bioshop #AMC555  
1 mM CaCl2 Bioshop #CCL302  
Acetonitrile Sigma #A998-4  
Formic acid Sigma #F0507  
HPLC grade water Sigma #95304  
Iodoacetamide Sigma #16125  
Millipore Zip-Tip Millipore # ZTC18M960  
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin Phenomenex    
Proxeon nano HPLC pump Thermo Fisher Scientific    
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer   Thermo Fisher Scientific  
      12. Labware
4 liter conical flasks VWR #89000-372  
50 ml polypropylene falcon tubes Any Vendor    
1.5 ml micro-centrifuge tubes Any Vendor    
250 ml conical flaks VWR #29140-045  
15 ml sterile culture tubes Thermo Scientific #366052  
Cryogenic vials VWR #479-3221  
-80 °C freezer Fisher Scientific #13-990-14  
Speed vacuum system Thermo Scientific    
     

Buffers and Solutions

1. 1 liter Terrific Broth (TB) media

11 g Bio-Tryptone
22 g Yeast Extract
2% Glycerol
50 ml potassium salt stock solution

2. Potassium Salt Stock Solution

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. Sonication Buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
10% Glycerol
Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

5. TEV cleavage buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

6. Calmodulin binding buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

7. Calmodulin wash buffer

30 mM Tris-HCl pH 7.9
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. Calmodulin elution buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
100 mM NaCl
10 mM EGTA
0.1-0.5 mM TCEP

9. Developing solution (1L)

37% Formaldehyde
30 g sodium carbonate
1000 ml distilled water

10. Digestion buffer

50 mM NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. Wetting and Equilibration solution

70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid

12. Washing solution

100% H2O in 0.1% formic acid

References

  1. Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
  2. Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
  3. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  4. Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
  5. Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
  6. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
  7. Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
  8. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  9. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  10. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
  11. Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
  12. Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
  13. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
  14. Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).

Play Video

Cite This Article
Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).

View Video