Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Identifiering av proteinkomplex i doi: 10.3791/4057 Published: November 12, 2012

Summary

Affinitetsrening av märkta proteiner i kombination med masspektrometri (truppminor) är en kraftfull metod för systematisk kartläggning av nätverk proteininteraktioner och för undersökning av mekanistiska grunden för biologiska processer. Här beskriver vi en optimerad sekventiell peptid affinitet (SPA) truppminor förfarande utvecklats för bakterien

Abstract

Eftersom de flesta cellulära processer förmedlas av makromolekylära församlingar, systematisk identifiering av protein-protein interaktioner (PPI) och identifiering av subenheten sammansättning av flera proteinkomplex kan ge insikt i geners funktion och öka förståelsen av biologiska system 1, 2. Fysiska samverkan kan mappas med hög tillförsikt vialarge skala isolering och karaktärisering av endogena protein komplexen med nära fysiologiska förhållanden baserade på affinitetsrening av kromosomalt-märkta proteiner i kombination med masspektrometri (truppminor). Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt tillämpats i evolutionärt olika organismer, inklusive jäst, flugor, maskar, däggdjursceller och bakterier 1-6. I synnerhet, har vi genererat en karboxiterminal peptid sekventiell affinitet (SPA) dubbla märkning för affinitets-rening nativa proteinkomplex från odlade gramnegativa Escherichia coli, med användning av GEnetically-lätthanterlig värd laboratoriestammar som är väl lämpade för genomet hela undersökningar av den grundläggande biologi och bevarade processer prokaryoter 1, 2, 7. Vår SPA-märkningssystem är analog med tandem affinitetsrening metod som ursprungligen utvecklades för jäst 8, 9, och består av en calmodulin-bindande peptid (CBP) följt av klyvningsstället för den mycket specifika tobak etch virus (TEV) proteas och tre kopior av FLAG-epitopen (3X FLAG), vilket möjliggör två på varandra följande rundor av affinitetsanrikning. Efter kassett amplifiering sekvensspecifika linjära PCR-produkter som kodar för SPA-tagg och en selekterbar markör integrerad och uttryckt i ram som karboxiterminala fusioner i en DY330 bakgrund som induceras att transient uttrycka en högeffektiv heterolog bakteriofag lambda rekombinationssystem 10. Efterföljande dubbla steg rening med kalmodulin och anti-FLAG pärlor affinitet möjliggör mycket selektivaoch effektiv indrivning av även låga komplex överflöd protein från storskaliga kulturer. Tandemmasspektrometri används sedan för att identifiera de stabilt sam-rening av proteiner med hög känslighet (låga nanogram detektionsgränser).

Här beskriver vi detaljerade steg-för-steg-anvisningar vi ofta använder för systematisk protein märkning, rening och masspektrometri-baserad analys av lösligt protein komplex från E. coli, som kan skalas upp och eventuellt anpassas till andra bakteriearter, inklusive vissa opportunistiska patogener som är mottagliga för recombineering. De resulterande fysiska interaktioner kan ofta avslöja intressanta oväntade komponenter och anslutningar tyder nya mekanistiska länkar. Integrering av PPI-data med alternativa molekylära föreningen data såsom genetiska (gen-gen) interaktioner och genomiska-sammanhang (GC) förutsägelser kan underlätta klargörande av den globala molekylära organisationen av multi-proteinkomplex inom bigiska vägar. Nätverken som genereras för E. E. coli kan användas för att få kunskap om den funktionella arkitektur ortologa genprodukter i andra mikrober som funktionella anteckningar närvarande saknas.

Protocol

1. Konstruktion av genspecifika SPA-märkning i E. E. coli DY330 stam

  1. Plasmiden pJL148 omfattar SPA-taggen DNA-sekvensen och kanamycin antibiotikaresistensmarkör kassett (Kan R) används som en mall i polymeraskedjereaktionen (PCR)-amplifiering 7. En 45 nt genspecifika framåtriktad primer, placerad omedelbart uppströms om målgenen stoppkodon i ram med en 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') tagg specifik framåtriktad primer, och en 45 nt genspecifik omvänd primer, placerad omedelbart nedströms av målgenen stoppkodon i ram med en 27 bp (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') tagg specifik omvänd primer, används för att amplifiera SPA-taggen och Kan R kassett från pJL148 användning av följande PCR-cykling villkor: 94 ° C under 5 min, 30 cykler av 94 ° C under 1 minut, 55 ° C under 1 min, 68 ° C under 2 min 10 sek, följt av 68 ° C under 10 minuter. Dessa amplifierade sekvenser tjänar ens substrat för ektopiskt introducerade λ-Röd homolog rekombination maskiner (se nedan).
  2. PCR-produkten renas med användning av en Qiaquick PCR-reningskit för att avlägsna salter som kan störa elektroporering. Den renade PCR-produkten därefter riktad att integrera vid 3-änden (omedelbart uppströms av den nativa stoppkodonet) av en specifik gen i DY330 stam i vilken λ-Red rekombination maskiner uttrycks 10.
  3. Den DY330 λ-röd uttryckande stammen odlas över natten i 2 ml Luria-Bertani (LB)-medium vid 32 ° C genom skakning vid 180 varv per minut. 1 ml av den över natten odlade kulturen därefter inokuleras i 70 ml färskt LB-medium i 500 ml konisk kolv. Inokulatet odlas vid 32 ° C genom skakning vid 180 rpm tills OD 600 når ~ 0,8.
  4. Kulturen överfördes till en ny 250 ml konisk kolv, där cellerna induceras genom inkubering kolven i ett vattenbad vid 42 ° C genom försiktig skakning vid180 rpm under 15 minuter. Omedelbart efter induktionen, kolven inkuberas i en is-vatten-uppslamning bad under minst 30 min med skakning.
  5. Den iskalla kultur överfördes omedelbart till pre-kyld 50 ml polypropylenrör och underkastades centrifugering vid 3.993 xg i 6 minuter vid 4 ° C. Cellpelleten återsuspenderas i 50 ml iskallt sterilt vatten och centrifugerades återigen vid 3.993 xg under 6 min vid 4 ° C. Cellpelleten resuspenderas därefter i 1 ml kallt vatten och överfördes till en 1,5 ml Effendorf rör och centrifugerades vid maximal hastighet under 20 sekunder vid 4 ° C. Efter två eller tre tvättningssteg med iskallt vatten, cellpelleten återsuspenderades slutligen i 700 pl iskallt sterilt vatten, vilket resulterar i elektro-kompetenta celler.
  6. Genom elektroporation är en il av det renade amplikon införes i 40 pl av de elektro-kompetenta celler. Cellerna elektroporerades i en Bio-Rad GenePulser II med följande inställningar: 2,5 kV, 25 mF med pulsstyrenheten för 200 Ω. Efter homolog rekombination och integration, är de transformanter som framgångsrikt rekombineras taggen / kassetten i kromosomen väljs baserat på resistens mot Kan (figur 1A). Flera transformanter väljs för Western blotting för att verifiera korrekt generationen (dvs. positiv signal) SPA-märkta fusionsproteiner med anti-FLAG M2 antikropp som är selektiv mot flaggan epitoper av SPA-taggen.
  7. Bekräftad karboxiterminala SPA-tag fusion stammen odlas på en stor skala för att isolera lösliga proteinkomplex från skördade celler som använder protokollet SPA-reningen. Konturen av stegen involverade i affinitetsmarkören reningsförfarandet visas i figur 1B.

2. Odling och Sonikering

  1. Inokulera 100 pl av en SPA-märkt E. E. coli glycerolförråd i 50 ml Terrific Broth (TB) flytande medium kompletterat med 50 | il av 25 pg / ml of Kan lösning i en 250 ml konisk kolv. Odla kulturen över natten vid 32 ° C.
    Obs: Eftersom temperaturen-inducerbara λ Röd kassett i stammen DY330 är under kontroll av en temperaturkänslig repressor 10, SPA-märkta E. coli-stam odlades vid 32 ° C.
  2. Överför 10 ml av den över natten odlade kulturen i 990 ml färsk tbc kompletterat med 25 pg / ml av Kan i en 4 liters kolv. Kulturen odlas vid 32 ° C med konstant skakning vid 250 varv per minut, under 5 till 6 timmar, tills OD 600 når ~ 2 till 3.
  3. Överför 1 liter E. E. coli SPA-tagg kultur för att rengöra flaskor centrifugering och snurra cellerna vid 4 ° C i Beckman J6-centrifug HC @ 3993 x g under 15 min.
  4. Supernatanten avlägsnas från centrifugeringen flaskorna. Resuspendera E. coli cellpelletar med 25 ml sonikeringsbuffert. Säkerställ att hålla centrifugering flaskor på is vid alla tidpunkter.
  5. Den återsuspenderade pelleten äröverfördes till 50 ml polypropen-Falcon-rör och frystes med flytande kväve. De frysta cellerna lagras vid -80 ° C för långvarig användning.
  6. Före sonikering, tina de frusna cellerna fullständigt genom att hålla pelletarna på is. De upptinade proverna överförs till en steril rostfri bägare placerades på is under sonikering. Sonden nedsänkt i provet och sonikerades under 3 minuter. En ytterligare 2 minuter får svalna provet från överhettning.
  7. Den sonikerade cellysat överföres till före-kylda sterilt centrifugrör, och underkastades centrifugering vid 4 ° C i Beckman-centrifug med användning av en JA-17 rötor @ 35.267 x g (16.000 rpm) under 15 minuter två gånger.
    Obs: När det gäller membranprotein rening är sonikerade cellysat centrifugeras endast en gång i 15 min eftersom vi inte vet i vilken fraktion av membranproteiner är, att, antingen i pellet eller i supernatanten fraktionen. Så för att undvika överskjutande förlust av medlemmarbrane proteiner, snurra vi cellerna under 15 min vid höghastighetscentrifugering och supematanten därefter bearbetas för rening (se stegen nedan) där 1% detergent används för att solubilisera membranproteiner.
  8. Supernatanten från centrifugeringen röret överfördes försiktigt till en 50 ml polypropen-Falcon-rör och frystes med flytande kväve. Den sonikerade frysta cellextraktet lagras i högst 6 månader vid -80 ° C för framtida användning.

3. Affinitetsrening

  1. Före användning, är 100 | il av anti-flag M2 tvättas pärlorna med 10 volymer av AFC-buffert (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% detergent, och 0,1-0,5 mm TCEP [tris (2-karboxietyl) fosfin - saltsyra]) utan tvättmedlet och reduktionsmedlet TCEP (tris (2-karboxietyl) fosfin).
  2. Den frusna, sonikerade cellextraktet tinas genom att placera röret i kallt vatten. Den tinade cell-extraktet inkuberas med 3 pl bensoNase nukleas under 30 minuter vid 4 ° C. Till denna blandning, lägga till icke-joniska detergenten Triton X-100 (slutlig koncentration av detergent bör vara 0,1%) och 200 ul suspensioner av anti-flag M2 agarospärlor.
    Anm: För alla lösliga protein reningar, Triton X-100 0,1% används för att minimera icke-specifik adsorption, där som för rening av ett membranprotein, olika milda icke-joniska detergenter, såsom C12E8 (oktaetylenglykol dodecyl eter), DDM ( n-dodecyl β-D-maltosid) och Maltos-neopentylglykol (MNG) kan användas vid en 1% koncentration detergent för att förbättra solubilisering. Eftersom olika rengöringsmedel har olika upplösning effektivitet membranproteiner, rekommenderas att utföra oberoende protein reningar som använder mer än en diskmedel.
  3. Innehållet blandades försiktigt genom att rotera röret under 3 timmar vid 4 ° C med användning av en Labquake skakare. Efter 3 timmar av rotation, är röret centrifugeras vid 1.700 x g under 6 minuter. Supernatanten är då removed noga så mycket som möjligt, utan att störa den lösa strängen pelleten.
  4. Pelleten återsuspenderas i den återstående supernatanten och överfördes sedan till en 0,8 x 4 cm Bio-Rad polypropylen prep kolonn. Säkerställ att avlägsna bottenutloppet pluggar av kolonnen, så att eluaten rinna genom gravitationsflöde. Tvätta kolonnen 5 gånger med TEV klyvning steg.
  5. Efter dränering de tvättade eluaten är bottenutloppet av kolonnen stängd. Till samma kolonn, är klyvning utförs genom att tillsätta ~ 5 till 10 ^ il (50 enheter) av TEV-proteas och 400 pl 1X AFC-buffert på kolonnen. Säkerställ att stänga den övre delen av kolonnen med ett lock. Kolonnen innehållande pärlorna roteras försiktigt över natten vid 4 ° C över natten med användning av en Labquake skakare.
  6. Ta bort locket på toppen och utloppet kontakten i botten av kolonnen, och töm eluaten återvunna efter TEV klyvning i en ny kolumn som innehåller 200 pl suspensioner av kalmodulin-Sepharose-pärlor, som tvättas med 10volymer av kalmodulin bindningsbuffert.
  7. Både topp och botten av kolonnen är fastsatta tätt, och innehållet i kolonnen blandas försiktigt genom att rotera under 3 timmar vid 4 ° C med användning av en Labquake skakare.
  8. Efter 3 timmar av rotation eluatet dräneras genom att ta bort den övre locket och bottenpluggen av kolonnen. Kolonnen tvättas fyra gånger med 200 pl 1X kalmodulin bindningsbuffert följt av en stringent tvätt med 400 pl av kalmodulin tvättbuffert.
  9. Det bundna proteinet elueras i fyra fraktioner av 50 pl i ett rent Eppendorf rör med användning av 1X kalmodulin elueringsbuffert. Den eluerade fraktionen fördelas i två rena Eppendorf-rör i lika volymer. Båda rören torkas därefter med användning av en hastighet vakuum.
  10. Den torkade eluatet från ett rör som används för att köra en gel silverfärgning, medan den andra är lagrad i -80 ° C innan användning av masspektrometri.

4. Silverfärgning

  1. För silver staining, är halv volym 3X SDS (natriumdodecylsulfat) provbuffert sattes till 50 | il av den torkade eluatet. Efter kokning av blandningen under 5 min, proverna laddades på en SDS-polyakrylamidgel.
  2. Efter det att gelén har körts, det placerades försiktigt i fixeringslösning (50% metanol och 10% ättiksyra) och omrördes försiktigt på en roterande skakanordning under 20 minuter. Gelén sköljdes sedan i 20% etanol under 10 minuter.
  3. Den fasta gelén tvättas två gånger noggrant med 500 ml dubbeldestillerat vatten under 10 minuter för att säkerställa låg enhetlig bakgrund.
  4. Gelén omrördes sedan försiktigt i 500 ml natrium-tiosulfat under 1 min, följt av två tvättningssteg med destillerat vatten för 20 sek.
  5. Vattnet kastas, och gelén inkuberas i 200 ml 0,1% silvernitratlösning under 30 minuter. Efter denna tid, är silvernitrat bort och gelén tvättas med destillerat vatten under 20 s för att avlägsna överskottet av silvernitrat.
  6. Gelén slutligen för hand omröres i 75 mlav framkallningslösningen. När den önskade intensiteten uppnåtts, framkallningslösningen kasseras och 80 ml ättiksyra tillsattes för att stoppa reaktionen. Säkerställ att inkubera gelén i ättiksyra under minst 20 minuter för korrekt visualisering av gelbanden.

5. Proteolys och Provberedning för masspektrometri

  1. Till det torkade provet, tillsätt 50 pl av digereringsbuffert och 0,9 pl 100 mM TCEP-HCI (tris (2-karboxietyl) fosfin - saltsyra) och inkubera blandningen under 45 minuter vid rumstemperatur för reduktionssteget. Därefter är 1 pl 500 mM jodacetamid tillsattes och inkuberades i mörker under ytterligare 40 minuter för att tillåta prov alkylering.
  2. Efter den andra omgången av inkuberingen, tillsätt 1 | ig immobiliserad trypsin till blandningen och inkubera antingen vid 37 ° C under 5 timmar eller över natten vid rumstemperatur. Säkerställ att stoppa reaktionen genom att tillsätta 1 pl ättiksyra.
  3. Pre-wet den Millipoåter Zip-Tip pipettspets genom att aspirera 10 ul av vätande och ekvilibrering lösning. Fördela lösningen till spillo. Därefter aspirera 10 ul av tvättlösningen och dispensera lösningen till avfall. Upprepa detta steg två gånger.
  4. För effektiv bindning av peptidblandningen till spetsen, blanda pipett peptidblandningen 20 gånger. Peptidblandningen som vidhäftade till spetsen tvättas bort genom aspirering och dispensering av tvättlösningen. Upprepa denna procedur två gånger för effektiv bindning av peptidblandningen till spetsen.
  5. Med spetsen innehållande den bundna peptiden, aspirera 10 ul av vätande och ekvilibrering lösning, och fördela i en ren eppendorfrör. Upprepa detta steg två gånger. Efter torkning av de eluerade proverna i hastighet vakuum, kan proverna analyseras omedelbart genom masspektrometri eller lagras vid -80 ° C före användning.

6. Protein Identifiering av LTQ Orbitrap Velos masspektrometer

The polypeptid komponenter i isolerade komplexen identifieras med hjälp av en LTQ Orbitrap Velos hybrid tandem masspektrometer. Det Orbitrap har exceptionell upplösning (> 60.000 full bredd Halv Maximalt eller FWHM) och massa noggrannhet (<2 ppm) som minimerar MS / MS-provtagning av irrelevanta icke-specifika bakgrunden föroreningar upptäckts i kontroll reningar, medan den höga hastigheten Velos jonfälla komponent kan upptäcka och fragment låg förekomst peptider med både elektronöverföring dissociation och kollision-dissociation lägen. Högt förtroende matcher bland följd MS / MS spektra mappas till referens E. coli proteinsekvenser med algoritm databassökning som SEQUEST och varje matchande sekvens utvärderas under en sannolikhet algoritm som STATQUEST 11. Det totala antalet spektra, peptidsekvens unika och vanliga föroreningar bakgrund detekteras i negativ kontroll (dvs.. Mock) reningar anses uppnå en låg empirisk falskt disåterhämtning takt. Följande steg utförs för identifiering av proteiner:

  1. De mikro-kolonner packade med ~ 10 cm av 3 um Luna-C 18 harts och är kopplad till en Proxeon nanoelectrospray jonkälla som är placerad i linje med Orbitrap instrumentet.
  2. En Proxeon nano flöde binär HPLC-pump används för att leverera en stabil spets flöde av ~ 300 nl min -1 under peptid separationerna.
  3. För att uppnå peptid eluering är en organisk buffert lutning inrättats enligt provet komplexitet. Till exempel är följande gradient vanligtvis in för E. coli SPA prover: lösningsmedel B ökade från 2% till 6% 1 min, till 24% 38 minuter, till 100% i nästa 4 minuter, hölls vid 100% i 1 min, sedan minskade till 2% 1 min, och slutlig håll vid 2% under 15 min. Den mobila fasen lösningsmedel A har 95% HPLC-gradienten vatten och 5% ACN med 0,1% myrsyra, medan lösningsmedel B har 5% HPLC-gradienten vatten och 95% ACN med 0,1% myrsyra acid.. Flödeshastigheten vid spetsen av nålen sätts till 300 nl min -1 under 60 min.
  4. Eftersom masspektrometern cykler körs genom en helt massa skanning vid 60.000 upplösningar är 10 åtföljande tandem fragmentering massa skanningar samlas in för de mest intensiva föregångare joner. Dynamisk utestängning, monoisotopisk massa val och realtidsdata beroende förvärv funktioner instrument är aktiverade.
  5. Spektra söks med användning av en algoritm databassökning såsom SEQUEST mot en databas av E. coli proteinsekvenser, och resultatet är statistiskt filtreras med en sannolikhet algoritm som STAQUEST 11 för att säkerställa en låg falsk upptäckt takt. Endast stort förtroende (99% sannolikhet) kandidater väljs medan matcher visar mer än 10 fel ppm massa jämfört med den teoretiska peptidmassan elimineras från vidare behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En viktig aspekt av SPA-baserade truppminor tillvägagångssätt som beskrivs här är att märkning utförs inom den naturliga kromosomala sammanhang och därigenom säkerställa normal genreglering bibehålls (dvs.. Infödda bete promotor bevaras, därför uttrycksnivåer inte störs) och infödda stabilt-associerade proteinkomplex återvinns vid nära-endogena nivåer. Operon polaritet frågor undviks också genom att inkludera en utåt orienterad promotor i den selekterbara markören. Denna SPA-märkning tillvägagångssätt är tillräckligt effektiv för att rena komponenterna i låg-abundans komplex till nära homogenitet, inklusive membran-associerade sammansättningar, även om subenheter uttrycks till endast ett fåtal molekyler per bakteriecell. Sammantaget kan detta protokoll enkelt skalas upp för rening stora uppsättningar av märkta lösliga proteiner i E. coli eller i princip alla andra bakteriearter som taggning via recombineering är möjligt, eller de som besitter naturligt hög omvandlingning kapacitet, såsom Acinetobacter, en framväxande arbetshäst bakteriella genetik, som har använts, exempelvis för att bygga en stam bibliotek av målgenen knockouts 13.

En viktig fråga inneboende storskaliga proteomik metoder är att identifiera promiskuösa ospecifika interactmedlemmar och oäkta spårförorening. Trots två omgångar av anrikning, vår rutin SPA reningar upptäcka regelbundet återkommande föroreningar som vanligtvis hög överflöd hushållning proteiner, såsom ribosomala proteiner och chaperones, som binder ospecifikt till den kromatografiska harts och / eller bete proteiner. Detta problem kan mildras på två sätt. Först det totala spektrala antalet och unika i varje protein identifieras med en särskild bete anses i förhållande till en bredare uppsättning reningar av flera orelaterade protein beten och från otaggade (dvs.. Vildtyp) negativ kontroll stammar (dvs.. Mock affinitetsrening kompetensiments) för att minimera falska positiva associationer. Andra bör alla kandidatländer proteininteraktioner valideras med hjälp ömsesidig märkning och rening av den förmodade bindande partner med målet att självständigt bekräftar individuella protein-protein interaktioner för att undvika sällsynta fall där förekomsten av SPA-taggen stör införlivandet av naturliga proteiner till det endogena proteinet aggregatet.

Truppminor-baserade proteomik undersökningar begränsas av brist på känslighet i termer av att identifiera övergående eller sub-stökiometriska interaktioner. I sådana fall kan ett steg reningsförfaranden användas för att förbättra detektion av svagare interaktion partner. Under vår pågående, decennium lång studie av E. E. coli interactome har vi sett detekteringskapaciteten nya spektrometrar generationens massa stadigt förbättras. Äldre instrumentering är förspänd till återkommande identifiering av mycket rikliga proteiner, ofta hindrar detektering av mindre abundant men potentiellt mycket viktig samverkande proteiner. Omvänt Velos den Orbitrap hybrid masspektrometern vi idag använder har förbättrats markant upplösning, massa noggrannhet och känslighet vilket möjliggör mycket effektivare, hög genomströmning detektering av låga överflöd proteiner, inklusive övergående interaktioner. Slutligen, om vilken typ av interaktion är helt okänt föreslår vi forskare att: (i) tillämpa stränga kriterier för att tilldela förtroende poäng till alla förmodade matcher databassökning. Proteiner med två eller flera unika peptider brukar anses positivt, förutsatt varje match går med ett minimum sannolikhet tröskel cut-off 99% eller högre sannolikhet, (ii) se till att undersöka specificitet interactmedlemmar kandidat protein som spelats in med den märkta bete i jämförelse med resultat erhållna med negativa otaggade kontroll stammar (mock experiment) eller orelaterade beten protein, (iii) ömsesidigt bekräfta potentiella interaktioner innehållande ett okänt protein av interest genom att skapa motsvarande SPA fusion tag bete för storskalig rening eller validera parvisa interaktioner med traditionella sam-immunoutfällning med protein specifik eller tagg specifika antikroppar.

Hittills använda denna systematiskt har vi lyckats att märka och rena cirka två tredjedelar av ~ 2.750 E. coli lösliga proteiner som detekterbart uttryckta i odling i rikt medium 1, 2. Vi har också anpassat samma grundläggande metod för att systematiskt isolera membran-associerade proteinkomplex, och nu försöker rena varje återstående ~ 1.000 E. coli-proteiner förväntas vara membranbunden. Även rening av membranproteiner ofta ställer unika utmaningar eftersom de ofta inte effektivt solubiliseras genom extraktion buffert som vi normalt använder för SPA metoden möjliggör tillägg av icke-joniska detergenter till våra buffertar solubilisering och rening av en majoritet av E. coli </ Em> membranproteiner Vi har försökt att datum (Babu et al. Opublicerade data).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av medel från den kanadensiska stiftelsen för innovation, Genome Canada, Ontario Genomics Institute, Ontario ministeriet för innovation, och den kanadensiska Institutes of Health Research bidrag till JG och AE Red uttrycker E. coli-stam DY330 var en vänlig gåva från Donald L. domstolen (National Cancer Institute, Frederick, MD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I. Antibiotics
Kanamycin Bioshop #KAN201
Ampicillin Bioshop #AMP201
2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone Bioshop #TRP 402
Yeast extract Bioshop #YEX 555
Glycerol Bioshop #GLY 002
K2HPO4 Bioshop #PPM 302
KH2PO4 Bioshop #PPM 303
3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330 Yu et al. (2000)10
pJL148 Zeghouf et al. (2004)7
4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase Fermentas # EP0281
10 X PCR buffer Fermentas # EP0281
10 mM dNTPs Fermentas # EP0281
25 mM MgCl2 Fermentas # EP0281
Agarose Bioshop # AGA002
Loading dye NEB #B7021S
Ethidium bromide Bioshop # ETB444
10X TBE buffer Thermo Scientific #28355
Tris Base Bioshop #TRS001
Boric acid Bioshop #BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0) Sigma # E6768
DNA ladder NEB #N3232L
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit Qiagen #12143
QIAquick PCR purification kit Qiagen #28104
6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler BioRad iCycler
Agarose gel electrophoresis BioRad
Electroporator Bio-Rad GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette Bio-Rad
42 °C water bath shaker Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge Beckman Coulter TS-5.1-500
32 °C Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator Fisher Scientific
7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide Bio-Rad #161-0125
Ammonium persulfate Bioshop # AMP001
n-butanol Sigma # B7906
TEMED Bioshop #TEM001
Whatman No. 1 filter paper Fischer Scientific #09-806A
Mini protean 3 cell Bio-Rad #165-3301
iBlot gel transfer device Invitrogen #IB1001
Nitrocellulose membranes Bio-Rad #162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody Sigma #F3165
Horseradish peroxidase Amersham #NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards Bio-Rad #161-0363
Chemiluminescence reagent PIERCE #1856136
Autoradiography film Clonex Corp #CLEC810
Quick Draw blotting paper Sigma #P7796
C2 platform rocking shaker New Brunswick Scientific, USA
8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator Branson Ultrasonic #23395
NaCl Bioshop #SOD001
Protease inhibitors Roche #800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl Thermo Scientific #20490
9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column Bio-Rad #732-6008
Benzonase nuclease Novagen #70746
Anti-FLAG M2 agarose beads Sigma #A2220
Calmodulin-sepharose beads GE Healthcare #17-0529-01
TEV protease Invitrogen #12575-015
Triton X-100 Sigma #T9284
CaCl2 Sigma #C2661
EGTA Sigma #E3889
LabQuake Shaker Thermolyne #59558
10. Silver Staining Reagents
Methanol Bioshop #MET302
Acetic acid Bioshop t#ACE222
Sodium-thiosulfate Sigma #S-7143
Silver nitrate Fischer Scientific #S181-100
Formaldehyde Bioshop #FOR201
Sodium carbonate Bioshop #SOC512
11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega # V5280
50 mM NH4HCO3 Bioshop #AMC555
1 mM CaCl2 Bioshop #CCL302
Acetonitrile Sigma #A998-4
Formic acid Sigma #F0507
HPLC grade water Sigma #95304
Iodoacetamide Sigma #16125
Millipore Zip-Tip Millipore # ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
12. Labware
4 liter conical flasks VWR #89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes Any Vendor
250 ml conical flaks VWR #29140-045
15 ml sterile culture tubes Thermo Scientific #366052
Cryogenic vials VWR #479-3221
-80 °C freezer Fisher Scientific #13-990-14
Speed vacuum system Thermo Scientific

Buffers and Solutions

1. 1 liter Terrific Broth (TB) media

11 g Bio-Tryptone
22 g Yeast Extract
2% Glycerol
50 ml potassium salt stock solution

2. Potassium Salt Stock Solution

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. Sonication Buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
10% Glycerol
Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

5. TEV cleavage buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

6. Calmodulin binding buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

7. Calmodulin wash buffer

30 mM Tris-HCl pH 7.9
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. Calmodulin elution buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
100 mM NaCl
10 mM EGTA
0.1-0.5 mM TCEP

9. Developing solution (1L)

37% Formaldehyde
30 g sodium carbonate
1000 ml distilled water

10. Digestion buffer

50 mM NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. Wetting and Equilibration solution

70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid

12. Washing solution

100% H2O in 0.1% formic acid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
  2. Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
  3. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  4. Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
  5. Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
  6. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
  7. Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
  8. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  9. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  10. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
  11. Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
  12. Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
  13. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
  14. Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
Identifiering av proteinkomplex i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).More

Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter