Identifiering av proteinkomplex i<em> Escherichia coli</em> Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Summary

Affinitetsrening av märkta proteiner i kombination med masspektrometri (truppminor) är en kraftfull metod för systematisk kartläggning av nätverk proteininteraktioner och för undersökning av mekanistiska grunden för biologiska processer. Här beskriver vi en optimerad sekventiell peptid affinitet (SPA) truppminor förfarande utvecklats för bakterien<em> Escherichia coli</em> Som kan användas för att isolera och karakterisera stabila flera proteinkomplex till nära homogenitet även från låga kopieantal per cell.

Abstract

Eftersom de flesta cellulära processer förmedlas av makromolekylära församlingar, systematisk identifiering av protein-protein interaktioner (PPI) och identifiering av subenheten sammansättning av flera proteinkomplex kan ge insikt i geners funktion och öka förståelsen av biologiska system ^{1, 2.} Fysiska samverkan kan mappas med hög tillförsikt vialarge skala isolering och karaktärisering av endogena protein komplexen med nära fysiologiska förhållanden baserade på affinitetsrening av kromosomalt-märkta proteiner i kombination med masspektrometri (truppminor). Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt tillämpats i evolutionärt olika organismer, inklusive jäst, flugor, maskar, däggdjursceller och bakterier ^1-6. I synnerhet, har vi genererat en karboxiterminal peptid sekventiell affinitet (SPA) dubbla märkning för affinitets-rening nativa proteinkomplex från odlade gramnegativa Escherichia coli, med användning av GEnetically-lätthanterlig värd laboratoriestammar som är väl lämpade för genomet hela undersökningar av den grundläggande biologi och bevarade processer prokaryoter ^{1, 2, 7.} Vår SPA-märkningssystem är analog med tandem affinitetsrening metod som ursprungligen utvecklades för jäst ^{8, 9,} och består av en calmodulin-bindande peptid (CBP) följt av klyvningsstället för den mycket specifika tobak etch virus (TEV) proteas och tre kopior av FLAG-epitopen (3X FLAG), vilket möjliggör två på varandra följande rundor av affinitetsanrikning. Efter kassett amplifiering sekvensspecifika linjära PCR-produkter som kodar för SPA-tagg och en selekterbar markör integrerad och uttryckt i ram som karboxiterminala fusioner i en DY330 bakgrund som induceras att transient uttrycka en högeffektiv heterolog bakteriofag lambda rekombinationssystem ^10. Efterföljande dubbla steg rening med kalmodulin och anti-FLAG pärlor affinitet möjliggör mycket selektivaoch effektiv indrivning av även låga komplex överflöd protein från storskaliga kulturer. Tandemmasspektrometri används sedan för att identifiera de stabilt sam-rening av proteiner med hög känslighet (låga nanogram detektionsgränser).

Här beskriver vi detaljerade steg-för-steg-anvisningar vi ofta använder för systematisk protein märkning, rening och masspektrometri-baserad analys av lösligt protein komplex från E. coli, som kan skalas upp och eventuellt anpassas till andra bakteriearter, inklusive vissa opportunistiska patogener som är mottagliga för recombineering. De resulterande fysiska interaktioner kan ofta avslöja intressanta oväntade komponenter och anslutningar tyder nya mekanistiska länkar. Integrering av PPI-data med alternativa molekylära föreningen data såsom genetiska (gen-gen) interaktioner och genomiska-sammanhang (GC) förutsägelser kan underlätta klargörande av den globala molekylära organisationen av multi-proteinkomplex inom bigiska vägar. Nätverken som genereras för E. E. coli kan användas för att få kunskap om den funktionella arkitektur ortologa genprodukter i andra mikrober som funktionella anteckningar närvarande saknas.

Protocol

1. Konstruktion av genspecifika SPA-märkning i E. E. coli DY330 stam Plasmiden pJL148 omfattar SPA-taggen DNA-sekvensen och kanamycin antibiotikaresistensmarkör kassett (Kan R) används som en mall i polymeraskedjereaktionen (PCR)-amplifiering 7. En 45 nt genspecifika framåtriktad primer, placerad omedelbart uppströms om målgenen stoppkodon i ram med en 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') tagg specifik framåtriktad primer, och en 45 nt genspecifik omvänd p…

Representative Results

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon…

Discussion

En viktig aspekt av SPA-baserade truppminor tillvägagångssätt som beskrivs här är att märkning utförs inom den naturliga kromosomala sammanhang och därigenom säkerställa normal genreglering bibehålls (dvs.. Infödda bete promotor bevaras, därför uttrycksnivåer inte störs) och infödda stabilt-associerade proteinkomplex återvinns vid nära-endogena nivåer. Operon polaritet frågor undviks också genom att inkludera en utåt orienterad promotor i den selekterbara markören. Denna SPA-märkning ti…

Materials

Materials	Vendor	and Catalog Numbers
			I. Antibiotics
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
			2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
Yeast extract	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
			3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
			4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase	Fermentas	# EP0281
10 X PCR buffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Loading dye	NEB	#B7021S
Ethidium bromide	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Boric acid	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# E6768
DNA ladder	NEB	#N3232L
			5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	#28104
			6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler	BioRad	iCycler
Agarose gel electrophoresis	BioRad
Electroporator	Bio-Rad	GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette	Bio-Rad
42 °C water bath shaker		Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 °C Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator	Fisher Scientific
			7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide	Bio-Rad	#161-0125
Ammonium persulfate	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 filter paper	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 cell	Bio-Rad	#165-3301
iBlot gel transfer device	Invitrogen	#IB1001
Nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody	Sigma	#F3165
Horseradish peroxidase	Amersham	#NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards	Bio-Rad	#161-0363
Chemiluminescence reagent	PIERCE	#1856136
Autoradiography film	Clonex Corp	#CLEC810
Quick Draw blotting paper	Sigma	#P7796
C2 platform rocking shaker	New Brunswick Scientific, USA
			8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Protease inhibitors	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
			9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column	Bio-Rad	#732-6008
Benzonase nuclease	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 agarose beads	Sigma	#A2220
Calmodulin-sepharose beads	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV protease	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558
			10. Silver Staining Reagents
Methanol	Bioshop	#MET302
Acetic acid	Bioshop	t#ACE222
Sodium-thiosulfate	Sigma	#S-7143
Silver nitrate	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldehyde	Bioshop	#FOR201
Sodium carbonate	Bioshop	#SOC512
			11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitrile	Sigma	#A998-4
Formic acid	Sigma	#F0507
HPLC grade water	Sigma	#95304
Iodoacetamide	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin	Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer		Thermo Fisher Scientific
			12. Labware
4 liter conical flasks	VWR	#89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes	Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Any Vendor
250 ml conical flaks	VWR	#29140-045
15 ml sterile culture tubes	Thermo Scientific	#366052
Cryogenic vials	VWR	#479-3221
-80 °C freezer	Fisher Scientific	#13-990-14
Speed vacuum system	Thermo Scientific
			Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g Yeast Extract 2% Glycerol 50 ml potassium salt stock solution 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10% Glycerol Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% detergent Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 30 g sodium carbonate 1000 ml distilled water 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid