Formuleringar för frystorkning av bakterier och deras inverkan på cellöverlevnad

Summary

Frystorkning är ofta ett enkelt och bekvämt sätt för att erhålla torra produkter av viabla bakterieceller. En fråga av processen är cellöverlevnad. Vi detalj här ett förfarande för att undersöka hur cellens överlevnad under frystorkning påverkas av egenskaperna hos den använda formuleringen.

Abstract

Cellulär vatten kan tas bort för att reversibelt inaktivera mikroorganismer för att underlätta lagring. Ett sådant förfarande för avlägsnande är frystorkning, vilket anses vara en mild uttorkning metod. För att underlätta cellöverlevnad under torkning, cellerna formuleras ofta förväg. Formuleringen bildar en matris som bäddar in cellerna och skyddar dem från olika skadliga påkänningar på cellerna under frysning och torkning. Vi presenterar här en generell metod för att utvärdera överlevnaden av celler efter frystorkning och vi illustrera det genom att jämföra resultaten med fyra olika formuleringar: disackariden sackaros av sackaros härledda polymeren Ficoll PM400, och respektive polysackarider hydroxietylcellulosa (HEC ) och hydroxipropylmetylcellulosa (HPMC), på två stammar av bakterier, P. putida KT2440 och A. chlorophenolicus A6. I detta arbete har vi illustrera hur man förbereder formuleringar för frystorkning och hur man kan undersöka mekaismer av cellens överlevnad efter rehydrering genom att karaktärisera formuleringen hjälp av differentialscanningkalorimetri (DSC), ytmätningar spänning, röntgen analys och elektronmikroskopi och relatera dessa data till överlevnad. Polymererna valdes för att få en monomer struktur av respektive polysackarid liknar sackaros till en varierande grad. Med denna metod inställning visade vi att polymerer kan stödja cellöverlevnad så effektivt som disackarider om vissa fysikaliska egenskaper hos formuleringen styrs ^1.

Protocol

Ett. Odling och skörd av P. putida

1. Förbered en startkultur av Pseudomonas putida genom att ympa 100 ml tryptisk sojabuljong (TSB) med en koloni av P. putida-celler odlas på agar kompletterad med tryptisk sojabuljong (TSA). Förvara odlingen vid 30 ° C på en skakande ombord inställd på 130 rpm.
2. Efter 7 h överföra en alikvot från startkulturen ekvivalent med 1/10 av den slutliga volymen av den huvudsakliga kulturen till färskt TSB-medium. Hålla cellerna vid 30 ° C på en skakande ombord vid 130 rpm under 16 timmar.
3. Efter 16 h av tillväxt skördas cellerna genom spinning cellkulturen vid 1500 xg under 20 min vid rumstemperatur. Dekantera supernatanten och tvätta cellerna genom att åter suspendera cellpelleten är i en NaCl-lösning som är isoton till tillväxtmediet. I detta fall en 150 mM NaCl-lösning användes. Cellerna centrifugeras sedan en gång till och supernatanten dekanteras före återsuspendering av cellerna i formuleringen mediet,se steg 3.2.

2. Odling av andra arter

1. För att anpassa protokollet till andra bakteriearter Odling och skörd förfaranden bör ändras i enlighet med kraven i denna art. För att undvika osmotisk chock vid hantering av cellerna under skörd och tvättning steget (s), måste osmolalitet av de lösningar som matchar tillväxt medium vid skörd.

Tre. Formulering av celler

1. Framställa formuleringen lösningar genom att väga upp de respektive matriskomponenter och lös dem i vatten. För att uppnå isotona förhållanden, antingen justera mängden hjälpämne eller lägg NaCl eller någon annan cell kompatibla lösta för att nå önskad osmolalitet. För ämnen med låg molekylvikt såsom disackarider beloppen kan enkelt justeras för att nå isotona förhållanden. För ämnen som polymerer som är av hög molekylvikt har tonicitet justeras med cell-kompatibel sålutor, t.ex. NaCl eller disackarider. Notera att varje tillägg av ett ämne kommer att påverka de fysikaliska egenskaperna hos formuleringen, vilket i sin tur kan påverka frystorkning beteende och cellöverlevnad.
2. Dekantera den tvättlösning (i detta fall NaCl) och slamma cellerna i respektive formulering media.
3. Se till att cellerna är homogent dispergerade. Formuleringar av låg viskositet virvlas medan formuleringar av högre viskositet blandas med genom att lägga till, t ex., En omrörare och skaka behållaren tills homogen blandning uppnås.
4. Dela upp formuleringarna i frystork flaskor. Flaskorna bör vägas tomma, med provet före och efter frystorkning för att beräkna den mängd vatten som avlägsnas under frystorkning.
5. Lägg gummiproppar till rören Om injektionsflaskorna tätas inuti frystork, se steg 4.3.
6. Räkna cellerna i varje formulering innan frystorkning, se steg 6.
</ Ol>

4. Frystorkning

1. Frystorkning villkor måste anpassas till de fysiska egenskaperna hos formuleringen. Den viktigaste parametern är i detta fall glasövergångstemperaturen, Tg, av formuleringen, betecknad Tg "för frys-koncentrerade provet för att indikera att vattnet fortfarande är närvarande. Tg 'hos frys-koncentrerade beredningen lätt mäts med användning av differentialsvepkalorimetri (DSC), se steg 7.
2. Justera parametrarna för frystorkningsprocessen så att temperaturen hos provet är alltid under Tg av provet och att kammartrycket möjliggör en snabb sublimering av is, det vill säga primär torkning, och kvarvarande vatten i formuleringen, dvs sekundär torkning. Om provets temperatur är över Tg 'under torkningsprocessen finns det en stor risk för att konstruktionen kollapsar av provet som avsevärt kan minska den cellulära överlevnad.
3. För att skydda de torra produkterna efter freeze-torkning av provet atmosfären måste kontrolleras. Om möjligt, täta prover i frystork innan vakuumet släpps i slutet av frystorkning cykeln. Alternativt injektionsflaskorna kan fyllas med en föredragen atmosfär. Det är viktigt att undvika att utsätta proverna för omgivningsförhållanden som all fukt eller syre på lagringsplatsen atmosfären kommer att påverka överlevnaden av cellerna.
4. Väg flaskorna.

Fem. Rehydratisering

1. Rehydrera proverna med avjoniserat och sterilt vatten. Den mängd vatten som skall tillsättas bör vara samma som den mängd som avlägsnats under frystorkning och beräknas från vikten av den tomma flaskan, samma flaska med provet före och efter frystorkning. Vortex proverna då och då sedan dess lösningarna förefaller homogen.

6. Räkning

1. Rita 100 | il från varje prov och göra 10-faldiga seriespädningar. Från spädningarna av integrevila 100 pl stryks ut på TSA-plattor. Plattorna inkuberas vid den temperatur och tid som krävs.

7. Karakterisering av formulering av Frysning Behavior

1. Ta en liten mängd, 5 - 10 mg, av provet och bifoga den i ett DSC-aluminiumpanna med lock. Förbered en tom kastrull som referens.
2. Ställ DSC-programmet temperaturen scan. Kylningen programmet är inställt att efterlikna frysningssteget i frystorkning programmet. Detta görs som kylning kinetik kan påverka Tg "av de hydratiserade formuleringar. Innan uppvärmningen skanningen börjar få ner temperaturen till långt under det förväntade Tg 'av de undersökta formuleringarna, normalt -100 ° C.
3. Välj en lämplig upphettningshastighet, normalt en upphettningshastighet av 5 - 40 ° C / min användes. Det inspelade värmeflödet signalen uttrycks i watt och kommer att påverkas av den uppvärmningshastighet. En högre upphettningshastighet kommer att ge en större signal om Tg '.
4. Ställ temperaturområdet så att jagt täcker både Tg 'och smältningen av formuleringen.

8. Ytspänningsmätningar för de hydratiserade Formuleringar

1. Den experimentella uppställningen som används i detta experiment är enligt du Nouy metod för att mäta ytan.
2. Rengör platina ringen och mätkärlet noggrant. Kärlet sköljs med aceton, torkas av med en luddfri trasa, och sedan brände på insidan med en färglös låga. Ringen lyser rött i en färglös låga.
3. Fylla kärlet med lösningen och låt ytan sedimentera före mätning. För lösningar där jämviktstillstånd nås först efter en lång tid, t.ex. polymerer, kommer den enkla installationen som används här ger kvalitativa data.
4. För formuleringar med höga viskositeter, t ex lösningar av 2% (vikt / vikt) HEC eller HPMC, har ytspänningen som skall mätas på lösningar med lägre koncentrationer och extrapoleras. Detta kan göras genom att dra fördel av det faktum attden minskade nivåer ytspänning off vid koncentrationer under 0,5% (vikt / vikt).

9. Röntgen Analys av torra formuleringar

1. Ta en liten mängd matris / bakterier och ladda den på ett prov hållare.
2. Montera provhållaren i röntgen-diffraktometer.
3. Att analysera kristallin fas i provet EVA programpaket från Bruker kan användas.

10. Elektronmikroskopi

1. Ta en liten mängd av matrix / bakterier ur flaskorna och fixa det på en SEM stöta.
2. Ladda SEM hållaren i sputter-coater (Thermo VGScientific Polaron SC7640 används i föreliggande arbete) och päls provet med ett fåtal nm av Au / Pd eller Pt. I dessa experiment förstoftningsytor parametrar var: 1,900 V, 20 mA, och 20 sek, för en ~ 5 - 10 nm Au / Pd beläggning. Beläggningen minskar elektriska laddning under bildtagning. Det rekommenderas att börja med en tunn beläggning och, om laddningen kvarstår och orsakar imageartefakter, bör provet beläggas igen.
3. Ladda SEM hållaren i SEM kammaren. Välj lämpliga imaging parametrar. För instrument som används i figur 2 (FEI Strata DB235) vi använt 5 kV accelererande spänning, 3 spotsize, en arbetsgrupp avstånd av 5 mm och den sekundära elektrondetektor.
4. Eventuellt är det möjligt att använda den fokuserad jonstråle för att skära tvärsnitt av bakterierna inbäddade i polymeren för att avslöja ytterligare detaljer.

Representative Results

Tabell 1 visar data om formulering komposition, termiska händelser registrerats av DSC under upphettning av de frusna formuleringarna, struktur av de torra proven och ytspänningen av formuleringen lösningar. Den _Tg sackaros har bestämts till -40 ° C ^{2, 3} och kan vara svåra att upptäcka för sackaros koncentrationer under 20% vikt / vikt. Den termiska händelsen vid -35 ° C troligen relaterad till uppkomsten av is upplösning ^2. Den kristallina strukturen detekteras med röntgen i HEC och HPMC sampel och även ses i SEM (se fig. 2b och 2c) överlappar med den normala kristallformen av NaCl.

Figur 1A visar överlevnadsdata för Gram-negativa P. putida och Gram-positiva A. chlorophenolicus formulerades i de olika sackarid baserade formuleringar. Observera att trenden i hur väl formuleringarna stödjer cell överlevnad är samma för Both bakterieart. Kurvan som visas i figur 1B illustrerar korrelationen mellan frystorkning överlevnad och spänningarna ytan hos formuleringarna.

Figur 2 visar SEM-bilder av torra beredningar. För de fyra polymerer som visas här, har matrisen bildade utseendet av "skarpa papper": sammankopplade släta ark där bakterierna är inbäddade och visa upp som korrugeringar. För Ficoll och Sackaros, bladen är ca 1 ^ m tjock och 10 - 20 ^ m bred, med Ficoll med en slätare yta. HPMC och HEC bildar mycket tunnare plåtar, möjligen på grund av det faktum att mängden polymer är mindre i dessa cellulosa-baserade formuleringar än i de andra (Tabell 1). Dessutom var saltkristaller observerades för HEC och HPMC, med den senare visar en större mängd av fällningar på ytan av polymer-ark. Bakterier är lättare ses i cellulosabaserade formuleringar eftersom bladen är thinner. I sackaros och Ficoll, är de oftast observeras som korrugering av de annars släta ytor.

Formulering komposition	Temperaturhändelser upptäckts i frysta beredningar	Struktur för torr beredning	Ytspänning av otorkade formuleringar (mN m -1)
10% Sackaros	uppkomsten av is upplösning, -35 ° C	amorf sackaros	72 ± 0,1
10% Ficoll, 150 mM NaCl	Tg ', -22 ° C	amorf Ficoll	68 ± 0,3
2% HEC, 150 mM NaCl	eutektiska issmältning och NaCl, -28 ° C	amorf HEC, kristallint NaCl	64 ± 0,6
2% HPMC, 150 mM NaCl	eutektiska issmältning och NaCl, -27 ° C	52 ± 0,8

Tabell 1. Sammansättningen av olika formuleringar och egenskaper hos de vattenhaltiga eller torra formuleringar. Polymerkompositionerna koncentrationer av HEC och HPMC var maximerat för att uppnå en tillräckligt tjock matris täcka av bakterierna men har fortfarande en fungerande lösning när det gäller att viskositeten.

Figur 1. A) Överlevnaden av frystorkade P. putida (vit) och A. chlorophenolicus (grå) när de formuleras i lösningar baserade på disackarid sackaros eller polymererna Ficoll, HEC och HPMC, B) Samband mellan cell överlevnad efter frystorkning och ytspänningen av FN-torkade formuleringar.

Figure 2. SEM-bilder av P. putida i fyra olika formuleringar: a) sackaros, b) Ficoll, c) HEC, d) HPMC. Bakterierna är svåra att se i a) och b) eftersom polymeren arket är ganska tjock och kan omsluta bakterierna helt, i c) och d) bakterierna visar upp mer framträdande plats på ytan. I d), kan de särskiljas från den stora mängden av saltet faller på grund av sin form och kontrast, så som de visas som avlånga, mörka blodkroppar.

Discussion

Motivet för denna studie var att undersöka några formuleringsegenskaper som kan vara av betydelse för cellens överlevnad under frystorkning. Även om den inneboende torkning toleransen varierar mellan olika arter, såsom illustreras i figur 1A, trenden på hur väl de olika formuleringar stödcellen överlevnad är likartad. Det är upplysande att börja med en jämförelse av sackaros och Ficoll. Man tror att en viktig faktor för en formulering för att stödja cellöverlevnad är förmågan av formuleringen ingrediens (er) för att ersätta vatten under uttorkning och upprätthåller därmed strukturen av proteinerna och membran i cellen också i torrt tillstånd. Disackarider såsom sackaros, men trehalos också visa den här egenskapen, medan polymerer såsom polysackarid stärkelsen inte ^5,11. Polymerer bedöms vara alltför stor för att interagera med membranlipider i på samma sätt som disackarider. En annan egenskap viktiga för en framgångsrik frystorkading av mikroorganismer är förmågan hos den stödjande matrisen att förglasa (dvs. blir amorfa fasta ämnen) under frystorkning. Den amorfa strukturen är fördelaktigt för skärmning och hålla separerade celler. Intressant, både disackarider och polymerer förglasa lätt om frystorkning är korrekt utförda. Våra resultat visar att både sackaros och Ficoll baserade formuleringar blir amorfa efter frystorkning, se tabell 1, och stödcell överlevnad lika bra. Det finns dock betydande skillnader mellan de två sackarider. I motsats till sackaros, är Ficoll-molekylen, med en molekylvikt av 400 kDa, för stor för att fylla på vatten i växelverkan med lipidmembran under frystorkning ^{4, 5.} Vidare är såsom Ficoll molekyler avstängda från det periplasmiska utrymmet av gramnegativa bakterier, återigen på grund av deras storlek ^6, är cellulärt upptag av Ficoll osannolikt. Utifrån detta föreslår vi att den skyddande effekten bestämrat med sackaros formulering är inte i första hand beror på cellulärt upptag av disackarid, viktigt för vatten ersätter kapacitet av intracellulära strukturerna ^{7, 8.} Snarare har förmågan att Ficoll att stödja cellöverlevnad att göra med egenskaper gemensamma för det Ficoll och sackaros formulering, t ex den amorfa strukturen.

Med fokus på polymererna, är det framgår av figur 1A att förmågan för polymerpartiklarna formuleringar för att stödja cellöverlevnad varierar. Den röntgenanalys visade att NaCl kristalliserade under frystorkning och samexisterade med den annars amorfa strukturen av HEC och HPMC formuleringar. Inget kristallint material detekterades i Ficoll beredning. NaCl kan bilda komplex med hydroxyldelar i kolhydrater ^{9, 10.} I Ficoll och HEC-baserade formuleringar NaCl till hydroxyldelen molförhållandet var 1:11 och 1:01, respektive, förklarar varför ingen kristallisation upptäcktesi Ficoll-beredning. Den fasseparation mellan NaCl och polymererna cellulosa observerades också i DSC-undersökningar. En eutektisk smältning registrerades under uppvärmning av den frusna HEC och HPMC-formuleringar indikerar att fasseparation sker i fruset tillstånd. Morfologi och mikrostruktur av formuleringen avslöjas av SEM imaging (figur 2) och bekräftar DSC och X-ray-data. Bakterieceller ses utskjutande från arken med avsatta NaCl kristaller syns tydligt på ytan av HEC-ark. Baserat på likheten mellan överlevnaden för bakterier formulerade i HEC-lösning och Ficoll lösningar jämfört med HPMC vi konstatera att tillståndet i salt, oavsett spridda som kristaller eller löst i polymeren, inte korrelerar med cellens överlevnad. Istället cellöverlevnad visar ett förhållande med ytspänningen hos formuleringarna, se figur 1B. För lägre ytspänningar, lorn överlevnad registreras för bakterierna. Observera dock att den uppmätta ytspänningen visar interaktionen mellan de lösta ämnena, dvs sackaros och polymererna och lösningsmedlet molekyl. Fortfarande den möjliggör en indirekt spekulationer om att ytaktiviteten hos polymerer kan relateras till deras tendens att interagera också med cellytorna i en destabiliserande sätt. Eftersom koncentrationen av lösta ämnen ökar under frysning, kan de negativa effekterna förstärkas förklarar varför den negativa effekten av de ytaktiva polymerer som inte sågs när enbart lagra bakterier i fullt återfuktande formuleringar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.