Protein misfoldning cyklisk amplifikation (PMCA) er et in vitro assay til undersøgelse af prion konvertering og stamme og artsbarrierer. Den kan også anvendes som et prion påvisningsassay.
Prioner er infektiøse stoffer, der medfører uundgåeligt fatal transmissible spongiforme encephalopatier (TSE) hos dyr og mennesker 9,18. Prionproteinet har to forskellige isoformer, de ikke-infektiøse host-kodede protein (PrP C) og smitsomt protein (PrP Sc), et unormalt-foldet isoform af PrP C 8.
En af udfordringerne ved at arbejde med prion midler er den lange inkubationstid før udviklingen af kliniske symptomer efter vært podning 13. Dette traditionelt pålagt lange og dyre dyr bioassay undersøgelser. Endvidere er de biokemiske og biofysiske egenskaber af PrPsc dårligt karakteriseret på grund af deres usædvanlige konformation og aggregering tilstande.
PrPsc kan frø omdannelsen af PrP C til PrP Sc in vitro 14. PMCA er en in vitro-teknik, der tager advantage af denne evne ved hjælp af sonikering og inkubering cyklusser for at producere store mængder af PrP Sc, med en accelereret hastighed, fra et system indeholdende overskydende mængder af PrP ° og små mængder af PrP Sc frø 19. Denne teknik har vist sig effektivt at rekapitulere arten og stammen specificiteten af PrPsc konvertering fra PrP C, for at emulere prion stamme indgreb, og til amplifikation af meget lave niveauer af PrP Sc fra inficerede væv, væsker, og miljøprøver 6,7,16, 23.
Dette papir beskriver den PMCA protokol, herunder anbefalinger til minimering af forurening, genererer ensartede resultater, og kvantificere disse resultater. Vi diskuterer også adskillige PMCA applikationer, herunder generering og karakterisering af smittebærere prion stammer, prion stamme indgreb og påvisning af prioner i miljøet.
Udfordringer for uddybende smitsomme prionproteiner er de lange inkubationstid og udgifter i in vivo forsøg. Det PMCA teknik er en omkostningseffektiv måde at amplificere smitsomme prion agenter. Adskillige laboratorier har bekræftet evne PMCA til præcist at amplificere prion-stammer in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24.
Prionsygdomme kan overføres mellem arter. Bessen og Marsh har faktisk inokuleret hamstere med transmissibel minkencephalopati, der producerede to f…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. Vesper Fe Marie Ramos for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af National Center for Forskning Ressourcer (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 og G20RR024001) og Statens Institut for Neurologiske Lidelser (2R01 NS052609).
Reagent / Equipment | Manufacturer | Cat. Number |
Misonix 3000 | Misonix | S-3000 |
Misonix 4000 | Misonix | S-4000 |
Tenbroeck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 |
Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 |
0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML |
Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 |
EDTA | J.T. Baker | 4040-00 |
DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV |
Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 |
Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |