Protein misfoldning Cyklisk Amplifikation af Prioner

Summary

Protein misfoldning cyklisk amplifikation (PMCA) er et in vitro assay til undersøgelse af prion konvertering og stamme og artsbarrierer. Den kan også anvendes som et prion påvisningsassay.

Abstract

Prioner er infektiøse stoffer, der medfører uundgåeligt fatal transmissible spongiforme encephalopatier (TSE) hos dyr og mennesker ^9,18. Prionproteinet har to forskellige isoformer, de ikke-infektiøse host-kodede protein (PrP ^C) og smitsomt protein (PrP ^Sc), et unormalt-foldet isoform af PrP ^{C 8.}

En af udfordringerne ved at arbejde med prion midler er den lange inkubationstid før udviklingen af kliniske symptomer efter vært podning ^13. Dette traditionelt pålagt lange og dyre dyr bioassay undersøgelser. Endvidere er de biokemiske og biofysiske egenskaber af ^PrPsc dårligt karakteriseret på grund af deres usædvanlige konformation og aggregering tilstande.

^PrPsc kan frø omdannelsen af PrP ^C til PrP ^Sc in vitro ^14. PMCA er en in vitro-teknik, der tager advantage af denne evne ved hjælp af sonikering og inkubering cyklusser for at producere store mængder af PrP ^Sc, med en accelereret hastighed, fra et system indeholdende overskydende mængder af ^PrP ° og små mængder af PrP ^Sc frø ^19. Denne teknik har vist sig effektivt at rekapitulere arten og stammen specificiteten af ^PrPsc konvertering fra PrP ^C, for at emulere prion stamme indgreb, og til amplifikation af meget lave niveauer af PrP ^Sc fra inficerede væv, væsker, og miljøprøver ^{6,7,16, 23.}

Dette papir beskriver den PMCA protokol, herunder anbefalinger til minimering af forurening, genererer ensartede resultater, og kvantificere disse resultater. Vi diskuterer også adskillige PMCA applikationer, herunder generering og karakterisering af smittebærere prion stammer, prion stamme indgreb og påvisning af prioner i miljøet.

Protocol

1. Klargøring af udstyr Brug en Misonix 3000 eller Misonix 4000 sonikator (Farmingdale, NY) forbundet med en Thermo Electron Neslab EX-7 vandbad (Newington, NH) for at holde en konstant temperatur på 37 ° C. Soniker prøverne i 200 ul tyndvæggede PCR-rør strips med hvælvede låg opnået fra Thermo Scientific (Waltham, MA). En helt ny sonikator kræver et "break-in" periode med kontinuerlig drift 9. En to-måneders pause-periode består af en 40-sec sonication burst og 10-m…

Representative Results

Protein misfoldning cyklisk amplifikation (PMCA) anvendes til at amplificere PrP Sc in vitro 7, 12, 14, 19, 24. En vellykket PrPsc amplifikation er vist med en stigning i båndintensitet på Western blots af PK-resistent prionprotein (migrerer mellem 19 og 30 kDa for hamster-afledte prion-stammer) som vist i fig. 3. Stigningen i sin båndintensitet efter PMCA indikerer amplificering af PK-resistent PrPsc materiale. Vellykkede amplifikation af hamster-…

Discussion

Udfordringer for uddybende smitsomme prionproteiner er de lange inkubationstid og udgifter i in vivo forsøg. Det PMCA teknik er en omkostningseffektiv måde at amplificere smitsomme prion agenter. Adskillige laboratorier har bekræftet evne PMCA til præcist at amplificere prion-stammer in vitro ^{7, 9, 12, 14, 19,24.}

Prionsygdomme kan overføres mellem arter. Bessen og Marsh har faktisk inokuleret hamstere med transmissibel minkencephalopati, der producerede to f…

Materials

Reagent / Equipment	Manufacturer	Cat. Number
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Tenbroeck Tissue Grinder	Kontes	885000-0007
Neslab EX-7 Water Bath	Thermo Electron	Neslab EX-7
0.2 ml PCR Tube Strips	Thermo Scientific	AB-0451
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-100ML
Complete Protease Inhibitor	Roche	11 697 498 001
EDTA	J.T. Baker	4040-00
DPBS	Mallinckrodt Baker Mediatech	21-031-CV
Versi-Dry Lab Soakers	Fisher Scientific	14 206 28
Repti Therm Heater	Zoo Med Laboratories, Inc.	RH-4