Summary
Este documento detalla cómo usar cámaras de flujo continuo de hipoxia para generar atmósferas con concentraciones definidas de O
Abstract
El oxígeno es esencial para todos los metazoos para sobrevivir, con una sola excepción conocida 1. Disminución de la disponibilidad de O 2 (hipoxia) pueden surgir durante los estados de la enfermedad, el desarrollo normal o cambios en las condiciones ambientales 2-5. La comprensión de las vías de señalización celular que están implicadas en la respuesta a la hipoxia podría proporcionar una nueva visión de las estrategias de tratamiento para diversas patologías humanas, los accidentes cerebrovasculares hasta el cáncer. Este objetivo se ha visto obstaculizada, al menos en parte, por las dificultades técnicas asociadas a la exposición controlada de hipoxia en los organismos genéticamente susceptibles modelo.
Los nematodo Caenorhabditis elegans es ideal como un organismo modelo para el estudio de respuesta hipóxica, ya que es fácil de manipular genéticamente y la cultura. Además, es posible estudiar la respuesta celular a hipoxia específicas de O 2 concentraciones sin efectos de confusión desde C. elegans obtención de O 2 (y otros gases) por difusión, en oposición a un sistema respiratorio facilitado 6. Factores que se sabe están implicados en la respuesta a la hipoxia se conservan en C. elegans. La respuesta real a la hipoxia depende de la concentración específica de O 2 que está disponible. En C. elegans, la exposición a la hipoxia moderada provoca una respuesta transcripcional mediada en gran parte por HIF-1, los altamente conservadas por la hipoxia-inducible factor de transcripción 6-9. C. elegans embriones requieren HIF-1 para sobrevivir en 5,000-20,000 ppm de O 2 7,10 . La hipoxia es un término general para "menos de lo normal de O 2". Normoxia (normal O 2) también puede ser difícil de definir. En general, consideramos aire de la habitación, que es 210.000 ppm de O 2 para ser normoxia. Sin embargo, se ha demostrado que C. elegans tiene una preferencia conductual para el O 2 concentraciones de 5.12% (50.000-120.000 ppm O 2) 11. En larvae y adultos, HIF-1 actúa para prevenir la hipoxia inducida por la diapausa en 5000 ppm de O 2 12. Sin embargo, HIF-1 no juega un papel en la respuesta a bajas concentraciones de O 2 (anoxia, la definición operativa <10 ppm de O 2) 13. En la anoxia, C. elegans entra en un estado de animación suspendida reversible en el que toda la actividad observable al microscopio deja 10. El hecho de que diferentes respuestas fisiológicas se producen en diferentes condiciones destaca la importancia de tener control experimental sobre la concentración de O 2 hipóxico.
A continuación, presentamos un método para la construcción e implementación de cámaras ambientales que producen condiciones de hipoxia confiables y reproducibles, con concentraciones definidas de O 2. El método de flujo continuo asegura un rápido equilibrio de la cámara y aumenta la estabilidad del sistema. Además, la transparencia yaccesibilidad de las cámaras permiten la visualización directa de los animales estén expuestos a la hipoxia. Además, demuestran un método eficaz de recolección C. elegans muestras rápidamente después de la exposición a la hipoxia, que es necesario observar muchos de los cambios rápidamente-invertidos que se producen en la hipoxia 10,14. Este método proporciona un fundamento básico que puede ser fácilmente modificado para las necesidades de cada laboratorio, incluidos los sistemas de modelos diferentes y una variedad de gases.
Protocol
1. Construcción de cámaras de medio ambiente
- Seleccione el tamaño de volumen razonable de la cámara necesarios para el alcance de su proyecto. Cámara debe estar hecha de gas (O 2) material impermeable. Platos Pyrex cristalización, cajas Anaeropack o grandes acrílico fundido cajas (Ellard Instrumentación), se pueden utilizar. Hemos encontrado que 9 mm placas 50 puede encajar en un 100 x 50 placa de cristalización Kimex. Las placas de vidrio se puede utilizar como tapas para platos de cristalización Pyrex.
- Haga un agujero en la cámara seleccionada y se ajustan con un macho de plástico Luer de conexión de la manguera púa (Cole Parmer). Accesorios, puede obtenerse mediante instalación de tuberías o con epoxi. Instalar un accesorio similar en el lado opuesto del recipiente para permitir que el gas fluya dentro y fuera de la cámara. Si es posible, compensar los agujeros para incrementar la mezcla turbulenta.
- Obtener los tanques de gas comprimido, con definidas concentraciones de O2 (en equilibrio con N 2) que están certificados estándar de O 2 COntent o, en condiciones de anoxia, puro N 2 (<10 ppm de O 2). Utilice conmutación automática reguladores de estudios a largo plazo para evitar la interrupción de los niveles de oxígeno en las cámaras.
- Organismos respuesta a la hipoxia se ha demostrado que es dependiente de la temperatura 15. Al colocar la cámara en una incubadora, diferentes temperaturas puede ser mantenida. Las temperaturas dentro de una incubadora puede ser desigual y, como tal, es prudente hacer uso de un registrador de datos de temperatura para medir continuamente la temperatura dentro de la cámara.
2. Conexión del gas a la Cámara del Medio Ambiente
- Para todas las conexiones, utilice un octavo de pulgada de diámetro exterior de un tubo conectado a través de conectores rápidos, ya sea o accesorios de compresión. Tubería debe ser impermeable y no reactivo con O 2, tales como etileno propileno fluorado (FEP) o nylon (Cole Parmer). Para una vista esquemática de la instalación completa, véase la Figura 1.
- Conecte el comprensadas tanques de gas a un dispositivo de control de flujo, tales como un controlador de flujo másico (Sierra Instruments) o rotámetro (Aalborg). Asegurarse de que la presión aguas arriba del tanque está dentro del alcance del dispositivo de flujo y los accesorios de la manguera lengüeta. Dos etapas reguladores se utilizan generalmente, con la segunda etapa establece en la presión deseada [Véase la sección tres para seleccionar la velocidad de flujo apropiado]
- Hidrato del gas por burbujeo a través del agua destilada utilizando una botella de lavado de gas con el cilindro poroso, a continuación, directamente en uno de los accesorios en la cámara ambiental, dejando el accesorio segunda abierto para gases de escape (ver Figura 1). Para estudios a corto plazo, la hidratación de gas protege contra la desecación plato, pero el monitoreo de humedad puede ser necesario para estudios a largo plazo.
- Dow Corning grasa de vacío se puede utilizar para sellar la cámara. Coloque pesos en la tapa de la cámara para asegurar un sello hermético. Para confirmar un cierre hermético y un flujo adecuado, mantener una pequeña piscina de agua en la palma de la mano de ynuestra mano enguantada a la conexión a cabo en la cámara y compruebe si hay burbujas.
3. Selección de velocidad de flujo
- Suponiendo una mezcla perfecta, existe un 90% el intercambio de gases de la atmósfera gaseosa cada vez que se sustituye el volumen de la cámara (Ley de Fick). Por ejemplo, en una cámara de 100 cc con un caudal de 100 cc / min, la casa original de aire en la cámara será reemplazado con un 90% de su gas deseado después de 1 minuto, y se aproximará asintóticamente intercambio completo en un 90% cada minuto posteriormente.
- Las mayores tasas de flujo y pequeños contenedores llegarán a su concentración deseada de oxígeno con mayor rapidez. Para 100 x 50 Kimex contenedores (400 cc), un caudal de 120 cc / min llegará a 99,9% de cambio en 10 minutos (3 intercambios). Este caudal es adecuado para la mayoría de condiciones de oxígeno. Para nuestro conocimiento no ha habido una investigación sistemática de cómo la tasa de cambio de concentración de O 2 influye en la respuesta en C. elegans.
- Los gusanos expuestos a condiciones hipóxicas comúnmente escapar de la superficie de placas de agar. Para evitar esto, colocar un anillo de ácido palmítico (10 mg / ml en etanol) alrededor del borde de las placas. El ácido palmítico se salgan de la solución como se evapora el etanol, formando una barrera física. Las barreras de ácido palmítico no afectar la tasa de puesta de huevos, la fecundidad o la esperanza de vida en C. elegans 16,17. Madriguera no se produce con más frecuencia en condiciones de hipoxia, las medidas preventivas adicionales que no lo son por lo general requiere.
- Generar las poblaciones sincronizadas por el blanqueo adultas grávidas en una pequeña gota de solución de lejía alcalina de cabezas de serie de nematodos de crecimiento de los medios (NGM) placas 18. En contraste con los protocolos estándar de hipoclorito de gran lote de blanqueo, recoger 1-100 animales en una gota de solución de cloro en la superficie de una placa de NGM, a continuación, permitir que la solución de cloro para absorber en la placa
- Evite la exposición de embriones blanqueados a la hipoxia, ya que esto puede reducir la viabilidad 13. Para recoger los embriones jóvenes (2-4 células), los adultos grávidas puede ser cortada en un pequeño volumen de agua con una hoja de afeitar y los embriones se trasladó a las placas por pipeta boca para la posterior exposición a la hipoxia.
- Generar las poblaciones sincronizadas por el blanqueo adultas grávidas en una pequeña gota de solución de lejía alcalina de cabezas de serie de nematodos de crecimiento de los medios (NGM) placas 18. En contraste con los protocolos estándar de hipoclorito de gran lote de blanqueo, recoger 1-100 animales en una gota de solución de cloro en la superficie de una placa de NGM, a continuación, permitir que la solución de cloro para absorber en la placa
- Sellar las placas en la cámara ambiental. Los animales de control deben mantenerse en normoxia (casa aire) a la misma temperatura que los gusanos tratados. No hay diferencia observable entre las muestras que quedan en casa aire y los mantienen en una cámara idéntica a casa aire que fluye sobre ellos. Iniciar el flujo de gas y mantener la exposición durante el tiempo deseado. Para garantizar la uniformidad en la rampa, asegúrese dereemplazar el agua de la botella de lavado de gas antes de la exposición.
- Para la supervivencia de embriones ensayo, permita que los gusanos a desarrollar durante 48 h después de la vuelta al aire ambiente, momento en el que debe ser la cuarta etapa larvas / día uno adultos. Goles para la supervivencia, la censura de los gusanos que no pueden tenerse en cuenta.
- Para visualizar los animales expuestos a la hipoxia, mover los gusanos a una gota de M9 en un 22 mm 2 cubreobjetos, y se invierte en una almohadilla de agarosa al 2% en M9 18. Si el levamisol es necesario, (25 mM) o azida de sodio (10 mM) se puede utilizar como anestésico. La azida de sodio y levamisol podría confundir a algunas observaciones debido a la toxicidad y debe ser utilizada con prudencia 19.
5. Cosecha rápida de hipoxia expuestos gusanos (por ejemplo: preparación de muestras para HIF-1 Análisis de Western)
Muchos la hipoxia inducida por los efectos se revirtieron rápidamente a su regreso al aire de la habitación, incluida la reanudación de la producción de huevos 12, la fosforilación de epítopos mitóticasen la embriogénesis 13 y la degradación de la proteína HIF-1 9,20. Aislamiento rápido de los animales expuestos a la hipoxia se requiere para obtener los efectos reproducibles en estas condiciones. Con esta configuración, los animales pueden ser cosechadas y se congelaron en nitrógeno líquido en menos de dos minutos. Mientras que las cámaras de hipoxia caja de guantes permiten la manipulación de las muestras en condiciones de anoxia, su costo y la practicidad para fines distintos a la anoxia limitar su utilidad.
- Crecer Bristol gusanos N2 en 4 de 10 cm de alto crecimiento (HG) las placas hasta que la mayoría de los gusanos son adultas grávidas de 18 años. Lavar gusanos a un tubo cónico de 15 ml que contiene una solución 01:05 lejía alcalina y se incuba con la rotación hasta que los gusanos empiezan a disolverse, no más de 5 minutos 9. Lave los gusanos tres veces con M9, desacelerándose a 1500 xg entre cada lavado sin frenos.
- Placa blanqueados embriones sobre 8 150 mm y placas de NGM permitan desarrollar larvas L4 (aproximadamente 48 horas de Bristol N2 a 22 ° C).Mueva placas de cámaras ambientales y exponer a hipóxica (1.000 ppm, 5.000 ppm) y anóxicas (N2) condiciones durante 4 horas. Los tiempos de exposición variará dependiendo del diseño experimental. Mientras que la exposición a la hipoxia tiene un efecto inmediato sobre la tasa de puesta de huevos, embriones de dos células mueren después de 16-18 horas de la exposición 12. Con esta configuración cámara hipoxia, el límite inferior de la exposición se ve limitada por el tipo de cambio atmósfera necesaria para alcanzar el equilibrio.
- Etiqueta de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y un tubo de 15 ml cónico para cada muestra experimental. Los gusanos expuestos a la hipoxia son más propensas a pegarse a las paredes del tubo durante la cosecha. Para evitar esto, el lugar 100 l de sulfato de sodio al 1% de dodecil (SDS) en cada tubo cónico de 15 ml. Si SDS inhibe aplicaciones posteriores, albúmina de suero bovino (BSA) se puede utilizar para evitar que se pegue. El uso rutinario de la SDS o BSA no parecen tener una diferencia evidente. Añadir 50 l de 2x proteína carga colorante (4% de SDS, 10% de 2-mercaptoetanol y unrastrear de azul de bromofenol en 30% de glicerol (w / v)) para el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tener un Dewar de nitrógeno líquido listo.
- El tiempo de los pasos después de la eliminación de los gusanos de la hipoxia y el registro. Retire la tapa de la cámara de hipoxia, tomar un plato de muestras, y cerrar la cámara. Use agua destilada para lavar los gusanos a un filtro de nylon y luego verter en el tubo cónico de 15 ml. Haga girar los gusanos en una centrífuga de sobremesa a 1500 xg durante 15-20 segundos con freno.
- Utilizar un vacío para eliminar la mayor parte del sobrenadante del tubo, dejando intacto el gusano de pellets.
- Con una pipeta, mover el gusano de pellet en 50 l del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Cierre el tubo y se sumergen en nitrógeno líquido.
- Repita hasta que todas las muestras han sido aislados. Siga estos procedimientos para las muestras de control de aire de la casa de la coherencia. Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C.
6. Los resultados representativos
Organismal efectos de la hipoxia puede versemediante el examen de la viabilidad a la edad adulta de C. elegans (Figura 2). Los embriones puestos por tipo salvaje Bristol (N2) y HIF-1 (ia04) mutantes de deleción son todos sobreviven en la casa de aire concentraciones de O2 (210.000 ppm de O 2). N 2 los gusanos son capaces de adaptarse y sobrevivir a la edad adulta en ppm S 5000 2, mientras que HIF-1 embriones no son viables. Esto demuestra que HIF-1 es esencial para la adaptación a los niveles cambiantes de oxígeno disponible en el entorno 10. Ni N2, ni animales de HIF-1 puede sobrevivir a la exposición a 1.000 ppm de O 2.
Visualización de gusano directamente en la hipoxia es factible con el uso de un microscopio de disección y recipiente transparente (Figura 3). Al colocar directamente la cámara de hipoxia en el microscopio de disección, no hay necesidad de eliminar los gusanos de la hipoxia para observar las reacciones de organismos. El ámbito puede estar equipado con illumation fluorescencia (como en la Figura 3
Figura 1. Ejemplo de hipoxia cámara. La dirección del flujo de gas se indica por las flechas. El gas se almacena en los tanques de gas comprimido con definidos O 2 concentraciones (1) y un regulador de dos etapas se adjunta (2). El gas entra la parte inferior del tubo de flujo (3), que sale de la parte superior a la tasa de flujo correcto. El gas fluye en el matraz de burbuja (4), la hidratación del gas (asegurar la correcta conexión de burbuja matraz mediante la observación de burbujas). Gas hidratado luego pasa a la cámara de hipoxia en la válvula de entrada (5), exponiendo las muestras a la hipoxia. El gas, finalmente, los respiraderos en la habitación a través de un orificio de escape perforado en la cámara.
Figura 2. La viabilidad de los embriones expuestos a 1000 ppm de O 2, 5000 ppm de O
Figura 3. Visualización de C. elegans en la hipoxia con el microscopio. Los gusanos están expuestos a la hipoxia utilizando los métodos descritos. La cámara transparente ambiental (construido con una placa de cristalización Pyrex y la placa de vidrio) se coloca directamente en la etapa de un microscopio de disección. Dos puntos de vista se muestran, uno que incluye el flujo de gas de todo el conjunto, los otros sólo con la cámara sobre la platina del microscopio.
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Discussion
Este método presenta una estrategia para construir un entorno hipóxico que permite ambientes con concentraciones exactas de oxígeno para ser mantenidas en el laboratorio. Estas cámaras proporcionan un método sencillo para exponer a los organismos específicos bajas concentraciones de O 2 y el seguimiento de las salidas moleculares y fisiológicas. La cámara ambiental descrito es montado por el laboratorio en lugar de comercialmente adquirida y por lo tanto puede ser modificado para adaptarse a las necesidades del experimento.
Una ventaja de este método es el diseño de flujo continuo. Esto elimina las dificultades que normalmente se encuentran con el mantenimiento de bajas concentraciones de O 2 en las cámaras cuando la externa concentración de O 2 es mucho mayor (210.000 ppm de O 2 en aire ambiente). La alternativa es un método de flujo detenido, en el cual se mantiene un entorno hipóxico en una cámara sellada. Incluso pequeñas fugas, que pueden ser difíciles de detectar, preventilar el mantenimiento de condiciones de hipoxia que utilizan métodos de flujo detenido. El método de flujo continuo intercambio continuamente el aire en la cámara con la concentración de oxígeno se define en el tanque de aire comprimido y mantiene una presión positiva que evita las fugas de perturbar las condiciones de hipoxia.
La obtención de exactas, pre-mezcladas las concentraciones de oxígeno desde el proveedor de gas soluciona otro problema difícil con la hipoxia. Es muy difícil de medir concentraciones extremadamente bajas de O 2. La mayoría de los sensores de O2 son de difusión limitada y bastante caro. Debido a O 2 se difunde poco a poco, que miden las concentraciones bajas de O 2 puede ser lenta o imprecisa 21. En contraste, es muy fácil de generar mezclas de gases mediante la medición del peso de los gases. Las mezclas que regularmente compran están certificados estándar para estar dentro de un 2% de O 2 contenido de la mezcla deseada.
Este método puede usarse para producir observable hypoxia cambios inducidos tanto a nivel de organismos y molecular. Si bien este método se describen ensayos de supervivencia y el aislamiento rápido gusano conjunto de experimentos moleculares, hay una miríada de lecturas intermedios que podrían ser utilizados. Por ejemplo, este diseño permite la visualización dirección de gusanos en hipoxia para el estudio del comportamiento de tiempo real y los cambios en las construcciones reportero. Para visualizar los gusanos con un microscopio de disección, montar la cámara con cajas transparentes con el pequeño volumen y la altura mínima. La cámara se puede colocar todo en el microscopio de disección y es fácilmente manejable para la visualización óptima (ver Figura 3). También sería posible observar las muestras a mayor aumento mediante el uso de cámaras de perfusión con un microscopio invertido. Esto requiere cierta adaptación de las cámaras para interconectar con un tubo que se utiliza normalmente para el flujo de gas, y determinar un caudal apropiado. Los resultados representativos se muestran sólo arañan la superficie de la experimentación posibilidades, como la hipoxia se ha demostrado que afectan a los sistemas celulares de síntesis de ADN a la degradación de las proteínas 22,23.
La naturaleza práctica de este método no se limita a C. elegans. Mientras apropiada del tamaño de las cámaras se utilizan, este método es fácilmente adaptable a casi cualquier sistema modelo. Para la adaptación a los medios líquidos o en cultivo celular, las constantes de difusión de oxígeno en solución, la desgasificación de plástico y el tiempo que se equilibre en el cultivo deben tenerse en cuenta, y puede ser más apropiado utilizar O 2 placas de cultivo permeables 24,25.
Es posible modificar las cámaras que se presentan en este protocolo para el uso con otros gases. Por ejemplo, las cámaras pueden ser adaptado para proporcionar un ambiente anóxico simplemente omitiendo el O 2 en los tanques de gas comprimido se utilizan para crear una cámara de hipoxia (con el resto se llena con nitrógeno). Esto ha permitido para la observación de C. elegans en suspanimación terminó (datos no mostrados) 10,13,26. Ligeras modificaciones deben realizarse sobre la base de las propiedades de la mezcla de gas utilizado. La composición de la tubería de gas utilizado para la tubería de entrada y salida de la cámara puede tener que ser variado. Algunos plásticos son permeables al CO 2, mientras que otros no son compatibles con los gases corrosivos, tiene sulfuro de hidrógeno (H 2 S) 16,26. Una lista de materiales plásticos compatibles se pueden encontrar en el sitio web de Cole-Parmer.
Para gases tóxicos la salida de gas de la cámara debe ser ventilado en una campana de humos y certificado de protección personal apropiado, tal como detectores, se debe emplear. Además, los agentes de EH & S debe ser consultado antes de comenzar cualquier experimento con gases potencialmente peligrosos. Gases corrosivos también pueden requerir atención especial. Por ejemplo, H 2 S puede corroer muchos de los plásticos utilizados en el material de la tubería estándar, así como conexión de latón se corroen. Por lo general, asegurarse de que cualquier húmedaTed plástico es Kalrez o equivalente en los instrumentos utilizados con H 2 S. Ciertos gases pueden interactuar con las impurezas en el agua del grifo, por lo DIH 2 0 debe ser utilizado en el matraz de la burbuja. Consideraciones especiales sobre la cristalería también puede ser necesaria, por ejemplo, H 2 S requiere equipos con mojado las juntas tóricas.
Tanto los cambios de organismos y molecular se observó la utilización de los experimentos que se pueden completar en un día. Esta capacidad de introducir rápidamente las muestras a la hipoxia proporciona una valiosa herramienta en los campos del envejecimiento y el cáncer para el desarrollo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a los miembros del laboratorio de Miller para la discusión y lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un premio nuevo investigador del Centro de Choque Nathan de Excelencia en la biología básica de vejez para DLM y los Institutos Nacionales de Salud de adjudicación del R00 AG030550 de DLM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8" FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8" PTFE)’ R-3603 | |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16") 06363-62 (F. coupler 1/16") 06363-60 (M. coupler 1/8") 06363-61 (F. coupler 1/8") | |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) | |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order | |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16") | |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order | |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4" nut) B-200-3 (1/8" union tee) B-400-set (1/4" ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8" male conn) | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) | |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) | |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
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