נייר עמדה זה מפרט כיצד להשתמש רציפה הזרימה לתאי חוסר חמצן כדי ליצור אווירה עם ריכוזים מוגדרים של O<sub> 2</sub> להבין תגובות ביולוגיות לירידה O<sub> 2</sub>. מערכת זו קל להתקנה ולתחזוקה, גמישים מספיק כדי להתאים מגוון רחב של O<sub> 2</sub> ריכוז ומערכות מודל
חמצן חיוני metazoans כל לשרוד, עם חריג אחד ידוע 1. ירידה O 2 זמינות (היפוקסיה) יכולים להיווצר במהלך מצבים של התפתחות המחלה, רגיל או שינויים בתנאי הסביבה 2-5. הבנת מסלולי איתות תאיים המעורבים בתגובה ל היפוקסיה יכול לספק תובנה חדשה אסטרטגיות טיפול של מחלות אנושיות שונות, משבץ לסרטן. מטרה זו כבר הקשתה, לפחות בחלקה, בשל קשיים טכניים הקשורים עם חשיפה מבוקרת hypoxic באורגניזמים מודל מקובל מבחינה גנטית.
Caenorhabditis elegans את נמטודות הוא אידיאלי כאורגניזם מודל לחקר בתגובה חוסר חמצן, כפי שהוא קל תרבות גנטית לתפעל. יתר על כן, ניתן ללמוד התגובות הסלולר ספציפיים חוסר חמצן O 2 בריכוזים ללא תופעות מבלבלים מאז ג elegans להשיג O 2 (ו גזים אחרים) על ידי דיפוזיה, בניגוד למערכת הנשימה הקל 6. גורמים הידועים כמעורבים בתגובה ל היפוקסיה שמורים ב C. elegans. תגובה ממשית היפוקסיה תלויה בריכוז מסוים של O 2 הזמין. ב C. elegans, חשיפה מתונה היפוקסיה מעורר תגובה תעתיק מתווכת במידה רבה על ידי HIF-1, את הפערים המשתמרים היפוקסיה, גורם שעתוק מושרה 6-9. ג. עוברים elegans דורשים HIF-1 לשרוד עמודים לדקה 5,000-20,000 O 2 7,10 . היפוקסיה היא מונח כללי של "פחות מ רגיל 2". Normoxia (רגיל O 2) יכול להיות גם קשה להגדיר. בדרך כלל אנחנו רואים האוויר בחדר, שהיא 210,000 עמודים לדקה O 2 להיות normoxia. עם זאת, הוכח כי ג elegans יש העדפה התנהגותי עבור O 2 בריכוזים של 5-12% (50,000-120,000 עמודים לדקה O 2) 11. ב Larvae ומבוגרים, HIF-1 פעולות כדי למנוע היפוקסיה-Induced diapause בשנת 5000 ppm O 2 12. עם זאת, HIF-1 אינו משחק תפקיד בתגובה לריכוזים נמוכים יותר של O 2 (anoxia, הגדרה תפעולית <10 עמודים לדקה O 2) 13. ב anoxia, C. elegans נכנס למצב של חיות מושהית הפיך שבו כל פעילות הנצפה במיקרוסקופ מפסיק 10. העובדה כי התגובות הפיזיולוגיות השונות להתרחש בתנאים שונים מדגיש את החשיבות של בעל השליטה ניסיוני על ריכוז של חוסר חמצן O 2.
כאן, אנו מציגים שיטה לבנייה ויישום של תאים המייצרים תנאים סביבתיים hypoxic אמין לשחזור עם ריכוזים מוגדרים של O 2. שיטת הזרימה המתמשכת מבטיחה איזון מהיר של החדר ומגביר את היציבות של המערכת. בנוסף, שקיפותהנגישות של החדרים לאפשר ראיה ישירה של בעלי חיים שנחשפו היפוקסיה. בנוסף, אנו מדגימים שיטה יעילה של קצירת ג elegans דגימות במהירות לאחר חשיפה היפוקסיה, אשר יש צורך לבחון רבים במהירות, מהופכים השינויים המתרחשים 10,14 היפוקסיה. שיטה זו מספקת תשתית בסיסית כי ניתן לשנות בקלות עבור הצרכים מעבדה נפרדים, כולל מערכות מודל שונות ועוד מגוון של גזים.
שיטה זו מהווה אסטרטגיה לבניית סביבה hypoxic המאפשר לסביבות עם ריכוזים מדויקים של חמצן להישמר במעבדה. לשכות אלה מספקים שיטה פשוטה חשיפת אורגניזמים בריכוזים נמוכים ספציפיים של O 2 וניטור התפוקות מולקולריות ופיזיולוגיות. החדר הסביבה תיאר מורכב על ידי המעבדה במקום לר…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברי המעבדה מילר לדיון קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי בפרס החוקר חדש מהמרכז הלם נתן למצוינות הביולוגיה הבסיסית של הזדקנות ל DLM לבין המכון הלאומי לבריאות הפרס R00 AG030550 כדי DLM.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon |
YO-95821-00 (1/8″ FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8″ PTFE)’ R-3603 |
Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16″) 06363-62 (F. coupler 1/16″) 06363-60 (M. coupler 1/8″) 06363-61 (F. coupler 1/8″) |
Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) |
Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) |
Compressed gas tank | AirGas | Made to order |
Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16″) |
Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order |
Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4″ nut) B-200-3 (1/8″ union tee) B-400-set (1/4″ ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8″ male conn) |
Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) |
Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) |
Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 |
Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 |
SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 |
100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |