Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na<em> C. elegans</em
Summary
Este artigo detalha como usar contínuo fluxo de câmaras de hipóxia para gerar atmosferas com concentrações definidas de O<sub> 2</sub> Para entender as respostas biológicas à diminuição da O<sub> 2</sub>. Este sistema é fácil de configurar e manter, e flexível o suficiente para atender uma ampla gama de O<sub> 2</sub> Concentrações e sistemas modelo
Abstract
O oxigênio é essencial para todos os metazoários para sobreviver, com uma exceção conhecida 1. Diminuição da disponibilidade de O 2 (hipóxia) podem surgir durante estados de desenvolvimento da doença, normal ou mudanças nas condições ambientais 2-5. Compreender as vias de sinalização celular que estão envolvidos na resposta à hipóxia poderia fornecer uma nova visão sobre estratégias de tratamento para diversas patologias humanas, por acidente vascular cerebral ao câncer. Este objectivo tem sido impedida, pelo menos em parte, por dificuldades técnicas associadas com a exposição hipóxico controlada em organismos modelo geneticamente passíveis.
Os Caenorhabditis elegans nematóide é idealmente adequada como organismo modelo para o estudo da resposta hipóxica, como é fácil de cultura e manipular geneticamente. Além disso, é possível estudar a resposta celular a específicos hipóxicas O 2 concentrações sem efeitos de confusão desde C. elegans obter O 2 (e outros gases) por difusão, em oposição a um sistema respiratório facilitada 6. Factores conhecidos para ser envolvido na resposta à hipoxia são conservados em C. elegans. A resposta à hipoxia real depende da concentração específica de O 2 que está disponível. Em C. elegans, a exposição a moderada hipóxia elicia uma resposta de transcrição mediada em grande parte por hif-1, os altamente conservadas hipóxia induzível-factor de transcrição 6-9. C embriões. elegans requerem hif-1 para sobreviver em 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . A hipóxia é um termo geral para "menos de O normal 2". Normóxia (normal O 2) pode também ser difícil de definir. Nós geralmente consideram ar ambiente, que é 210.000 ppm O 2 estar normóxia. No entanto, tem sido mostrado que a C. elegans tem uma preferência comportamental para O 2 concentrações de 5-12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. Em larvae e adultos, HIF-1 atua para evitar hipóxia induzida por diapausa em 5.000 ppm O 2 12. No entanto, hif-1 não desempenha um papel na resposta a concentrações mais baixas de O 2 (anoxia, definição operacional <10 ppm O 2) 13. Em anoxia, C. elegans entra em um estado reversível de animação suspensa em que toda a atividade microscopicamente observável deixa 10. O fato de que diferentes respostas fisiológicas ocorrem em diferentes condições ressalta a importância de ter o controle experimental sobre a concentração hipóxica de O 2.
Aqui, apresentamos um método para a construção e implementação de câmaras ambientais que produzem confiáveis e reprodutíveis condições de hipóxia, com concentrações definidas de O 2. O método de fluxo contínuo assegura equilíbrio rápido da câmara, e aumenta a estabilidade do sistema. Além disso, a transparência eaacessibilidade das câmaras permitem a visualização direta de animais expostos à hipóxia. Nós ainda demonstrar um método eficaz de colheita C. elegans amostras rapidamente após a exposição à hipoxia, o que é necessário observar que muitas das alterações rapidamente-invertidas que ocorrem em 10,14 hipóxia. Este método proporciona uma fundação de base que pode ser facilmente modificado para as necessidades individuais de cada laboratório, incluindo sistemas de modelos diferentes e uma variedade de gases.
Protocol
Discussion
Este método apresenta uma estratégia para a construção de um ambiente hipóxico que permite a ambientes com concentrações precisas de oxigénio possa ser mantida no laboratório. Estas câmaras fornecer um método simples para expor os organismos específicos para baixas concentrações de O 2 e monitorização das saídas moleculares e fisiológicas. A câmara ambiental descrito é montado pelo laboratório, em vez de adquirida comercialmente e podem assim ser alterado para se adequar às necessidades …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos os membros do laboratório de Miller para a discussão e leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um prêmio de novo investigador do Centro de Choque Nathan de Excelência em Biologia Básica do Envelhecimento a DLM e pelo National Institutes of Health prêmio R00 AG030550 a DLM.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon |
YO-95821-00 (1/8″ FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8″ PTFE)’ R-3603 |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16″) 06363-62 (F. coupler 1/16″) 06363-60 (M. coupler 1/8″) 06363-61 (F. coupler 1/8″) |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16″) |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4″ nut) B-200-3 (1/8″ union tee) B-400-set (1/4″ ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8″ male conn) |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
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