Summary
Mikroglia sind Makrophagen, die die erste Linie der Verteidigung und Immunüberwachung des zentralen Nervensystems liefern. MicroRNAs sind regulatorische Moleküle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen Prozessen einschließlich Aktivierung und Differenzierung von Makrophagen. In diesem Artikel beschreiben wir die Methode zur Messung von Mikro-RNAs in Mikroglia.
Abstract
Mikroglia sind Zellen der myeloischen Linie, die im zentralen Nervensystem (ZNS) 1 befinden. Diese Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Pathologie vieler Krankheiten, die mit Neuroinflammation wie Multiple Sklerose (MS) 2 verbunden ist. Mikroglia bei einem normalen ZNS auszudrücken Makrophagen-CD11b und weisen eine Ruhestätte Phänotyp durch die Expression niedrigen Aktivierungsmarker wie CD45. Während pathologischen Prozessen im ZNS, werden Mikroglia aktiviert, bestimmt durch Hochregulation von CD45 und andere Marker 3. Die Faktoren, die Mikroglia-Phänotyp und Funktionen im ZNS betreffen sind nicht gut untersucht. MicroRNAs (miRNAs) sind eine wachsende Familie von konservierten Molekülen (~ 22 Nukleotide lang), die in vielen normalen physiologischen Prozesse wie Zellwachstum und Differenzierung 4 und Krankheiten wie Entzündungen 5 beteiligt sind. MiRNAs herunterregulieren die Expression bestimmter Zielgenen durch Binden komplementärer Sequenzen derir mRNAs und spielen eine wichtige Rolle bei der Aktivierung des angeborenen Immunsystems Zellen, einschließlich Makrophagen 6 und Mikroglia 7. Um miRNA-vermittelten Pfade, die Mikroglia-Phänotyp, biologische Funktion zu definieren, und Mikroglia von anderen Arten von Makrophagen zu unterscheiden zu untersuchen, ist es wichtig, quantitative Erfassung der Expression bestimmter microRNAs in verschiedenen Teilmengen von CNS-ansässigen Mikroglia. Gängige Methoden zur Messung der Expression von miRNAs im ZNS gehören quantitative PCR aus ganzen neuronalen Gewebe und in situ Hybridisierung. Allerdings ist die quantitative PCR aus ganzen Gewebehomogenat nicht zulassen, die Bewertung der Expression von miRNA in Mikroglia, die nur 5-15% der Zellen des neuronalen Gewebes darstellen. In-situ-Hybridisierung erlaubt die Beurteilung der Expression von microRNA in spezifischen Zelltypen in den Gewebeschnitten, aber diese Methode ist nicht ganz quantitativ. In diesem Bericht beschreiben wir eine quantitative und Sensitive Methode zum Nachweis von miRNA durch real-time PCR in Mikroglia von normalen ZNS oder während Neuroinflammation mit experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), ein Mausmodell für MS isoliert. Das beschriebene Verfahren wird nützlich sein, um die Höhe der Expression von microRNAs in Mikroglia im normalen ZNS oder während Neuroinflammation mit verschiedenen Pathologien wie MS, Schlaganfall, traumatische Verletzungen, die Alzheimer-Krankheit und Hirntumoren zu messen.
Protocol
1. Isolierung der Mikroglia von normalen ZNS
Isolierung von Mikroglia wird wie zuvor mit Modifikationen 3 beschrieben durchgeführt.
- Bereiten Sie Instrumente zur Präparation und Perfusion: Scheren, Pinzetten, 10 ml Spritze mit Nadel 27g, 15 ml Dounce Homogenisator (Teflon / Glas), 40 mu m Nylon Zellsieb, 40% und 70% Percoll-Lösungen, 1X PBS.
- Einschläfern Mäusen durch schnelles Ersticken (Entzug von Sauerstoff) in CO 2-Kamera und sofort übertragen Sie sie auf Labortisch für chirurgische Manipulationen und Perfusion.
- Führen chirurgische Manipulationen (mit einer Schere und Pinzette und 70% Ethanol als Antiseptikum): offene Bauchhöhle, schneiden Sie die Blende, offene Brusthöhle und schnippeln den rechten Vorhof mit einer Schere.
- Führen Sie die Ganzkörper-intrakardiale Perfusion durch Injektion von 10-ml-Spritze in die linke Herzkammer und Ausüben von Druck. Pass 8-10 ml 1X PBS durch den Blutkreislauf auf langsame und stetige pace.
- Wiederholen Sie die Schritte von 1,2 bis 1,4 für alle Mäuse in der Gruppe (typischerweise 5-10 Mäuse). Nach Perfusion halten Maus auf Eis, bis alle Mäuse perfundiert werden.
- Nach Perfusion von allen Mäusen, sezieren Gehirn und Rückenmark. (Optional: um die Expression von miRNAs in verschiedenen Bereichen des Gehirns zu studieren, sezieren diese spezifischen Bereichen wie Kleinhirn, Hippocampus etc. für die Gruppe von 5-10 Mäusen und Pool ihnen zusammen zur Homogenisierung).
- Homogenisieren Gehirn und Rückenmark mit 15-ml Dounce Homogenisator. Platzieren Sie ein Gehirn und Rückenmark in ein Homogenisator und 5 ml 1X PBS. Führen 10-20 sanfte Streiks; passieren Homogenat durch Zell-Sieb in 50 ml konischen Rohr-und Zertifikats bei 2000 UpM auf einer großen Zentrifuge 5-7 Minuten.
- Überstand verwerfen, resuspendieren Gehirn / Rückenmark-Homogenat 2-3 Mäuse in 5-7 ml 70% Percoll-und Overlay-7 ml 40% Percoll. Zentrifugieren bei 2000 Umdrehungen pro Minute (keine Bremse!) Für 30 Minuten.
- Entsorgen Sie beschädigte Zellen / Myelin Schutt auf einem Top von 70% und sammeln Mononukleäre Zellen bei 40% / 70%-Schnittstelle. Verdünnte gesammelten Zellen mindestens in einem 1:1 mit 1 × PBS und drehen sich mit 2000 UpM für 5-7 Minuten. Die Zellen in 0,5 ml PBS und überführen sie in 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen. Typische Ausbeute ~ 500 x 10 3 von mononukleären Zellen pro Maus, die die Anzahl der Mikrogliazellen ~ 1x10 6 in 0,5 ml für die Herstellung der Zellen aus Gehirn und Rückenmark von 2-3 Mäusen würde.
2. Kontrolle der Reinheit von Mikroglia durch Durchflusszytometrie
Die Färbung mit Antikörpern wird wie zuvor mit 7,8 Modifikationen beschrieben.
- Planen FACS-Puffer (1 × PBS mit 2% FBS), FcR-blockierende Antikörper, anti-CD11b - PE, anti-CD45-Antikörper APC-Cy7, 1% Paraformaldehyd in PBS.
- Nehmen Sie 50 ul der Zellen aus Schritt 1.9 und übertragen Sie sie auf neue 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen, und fügen Sie 350 ul FACS-Puffer.
- In 5-10 ul Anti-FcR Antikörper und inkubieren 10-15Minuten auf Eis.
- Zellen teilen sich in zwei Eppendorf-Tubes. In einem Rohr 1 ul anti-CD11b - PE und 2 ul anti-CD45-APC-Cy7 Antikörper und inkubieren 10-15 Minuten auf dem Eis. Das zweite Rohr wird als eine negative Kontrolle für die Antikörper-Färbung verwendet werden. Nach der Inkubation mit Antikörpern mit 1 ml FACS-Puffer Beide Röhren und Spin in kleinen Zentrifuge bei 5400 UpM für 5 min. Nach dem Spinnen fixieren die Zellen durch Resuspendieren sie in 400 ul 1% Paraformaldehyd in PBS und Vortex.
- Führen Durchflusszytometrie-Analyse im Durchflusszytometer (LSR II, BD Biosciences) mit dem BD compubeads (BD Biosciences) zur Kompensation Kontrollen 8 beschrieben wurde. Beispiele für gute und schlechte Vorbereitungen sind in Abb. 1a, b.
3. Isolierung von Mikroglia und Makrophagen aus Peripheral entzündeten ZNS im Maus-Modell der Neuroinflammation
Experimentelle Autoimmun-Enzephalitis (EAE) induziert wird, wie zuvor beschrieben wurdein unserem Papier 7; FACS-Sortierung wird ähnlich veröffentlichten Protokoll 8 durchgeführt.
- Induzieren EAE durch subkutane Immunisierung mit MOG 35-55 150 mg Peptid in 4 mg / ml komplettem Freund-Adjuvans (CFA) der Gruppe von 5-10 bei 8-12-Wochen alten C57BL / 6 Mäusen. Pertussis-Toxin sollte ip (150 ng / Maus) an den Tagen Null und dem zweiten Tag nach der Immunisierung gegeben werden. Die Mäuse sind auf Anzeichen von Krankheit, beginnend am Tag 10 nach der Immunisierung beobachtet, und der Schwere der Erkrankung beruht auf einer numerischen Skala von 0 bis 5 wie folgt bewertet: 0) keine Krankheit; 1) schwach Schwanz oder wackeligen Spaziergang; 2) Hinterbein Parese; 3) Hinterbein Lähmung; 4) Hinterbeine und Vordergliedmaße Lähmung, und 5) Tod oder Euthanasie wegen humanen Gründen. Mäuse auf dem Höhepunkt der Krankheit (d21 post-Immunisierung) werden für Experiment mit typischen Krankheit Punktzahl reicht von 1,5 bis 2,5 eingesetzt.
- Mononukleäre Zellen aus der Gruppe von CNS 5-10 Mäusen wie in den Schritten von 1,1 bis 1,4 und Färbung der Zellen mit anti-CD11b und anti-CD45 Antikörper, wie in Schritten von 2,1 bis 2,4.In Schritt 2.4 nicht reparieren Zellen, anstatt sie zu resuspendieren in 400 ul 1X PBS anstelle von 1% Paraformaldehyd.
- Zellsortierung wird durch FACSAria für Populationen von CD11b + CD45 niedrigen Mikroglia und CD11b + CD45 hallo Zellen (~ 80% von ihnen sind periphere Makrophagen und ~ 20% von ihnen sind aktivierte Mikroglia 3 durchgeführt; in Zukunft werden wir diese Zellen als verweisen " Makrophagen "). Verwenden Sie 1,7-ml Eppendorf-Röhrchen für die Sammlung der Proben. 300 mu l 1X PBS mit 10% FBS sollte zur Erhebung Röhrchen gegeben werden, um Beschädigungen der sortierten Zellen zu verhindern. Beispiele für drei Populationen von Mikroglia, Makrophagen und Lymphozyten sind in Abb. 2a mit der richtigen Sortierung Gate-Einstellungen in Abb. 2b. Typische Sortierung Reinheit wurden bei 98-100%, wie durch erneute Analyse sortiert Populationen von Mikroglia (2c) und Makrophagen (2d) bestimmt. Typische Ausbeute beträgt 20-50 x10 3 für Mikroglia und50-100 x 10 3 für Makrophagen aus der Gruppe von fünf Mäusen isoliert.
4. Isolierung von RNA
RNA wird isoliert unter Verwendung des Mirvana Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Modifikationen werden.
- Spin Mikroglia von normalen ZNS von Stufe 1,9 oder sortierten Untergruppen von Mikroglia und Makrophagen aus Schritt 3.3 in 1,7-ml-Eppendorf-Röhrchen bei 5400 rpm für 5-7 Minuten in kleinen Zentrifuge, sorgfältig Überstand verwerfen und das Einfrieren der Zellpellets auf Trockeneis. Fahren Sie mit Schritt 4,2 oder übertragen gefrorenen Zellpellets bis -70 C, wo es für 2-3 Monate gespeichert werden können.
- Übertragen gefrorenen Zellpellets regelmäßig Eis zum Auftauen. Dann werden 300 ul Lysispuffer aus Mirvana Kit und sanft durch Pipettieren 5-7 mal zu mischen.
- In 30 ul Homogenat Additiv aus Mirvana Kit, Vortex 30 Sekunden zu mischen, halten auf Eis für 10 Minuten
- Fügen Sie 300 ul Acid-Pehnol: Chloroform aus Mirvana Kit, Vortex 30 Sekunden, für Spin 5 min bei 10.000 rpm auf kleinen Zentrifuge.
- Entfernen Sie vorsichtig obere wässrige Phase (300 ul) und Transfer zu einem anderen 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen, mischen sich mit 375 ul 100% Ethanol, Transfer zum Patrone aus Mirvana Kit und Spin Filter für 1 min bei 10.000 Umdrehungen pro Minute.
- Durchfluss abschütten Puffer, fügen Sie 700 ul Waschlösung ich aus Mirvana Kit und Spin für 1 min bei 10.000 Umdrehungen pro Minute.
- Waschen Sie zwei weitere Male mit 500 ul Waschlösung II aus Mirvana Kit und schließlich zu eluieren RNA aus Kartusche mit 60 ul vorgewärmte Nuklease-freies Wasser.
- Die Menge und Qualität der RNA wird anhand Nanodrop Spektralphotometer. Die RNA-Konzentration sollte 5 bis 20 ng / ml und OD λ260 / λ280 Verhältnis im Bereich von 1,7 bis 2,0 sein. Wenn RNA-Konzentration von weniger als 3 ng / ml und OD 260λ/280λ weniger als 1,6 beträgt, werden die Proben verworfen. RNA-Proben können bei -70 ° C für 6-12 Monate gelagert werden.
- Für weitere Abschätzung der Qualität der RNA, die Proben arE unter Verwendung Gelelektrophorese in TBE 15% Harnstoff-Gel (Life Technologies). Typische Beispiele für gute und schlechte Qualität der RNA-Präparationen sind in Abb. 3a und 3B, jeweils.
5. Nachweis von miRNA in Mikroglia und Makrophagen
Für die Analyse von miRNA-Expression, real-time quantitative reverse Transkriptase-PCR (qRT-PCR)-Analysen erfolgt mit TaqMan-Assays mit Primer und fluoreszierende Sonden für microRNA insbesondere von Interesse und eine der ubiquitär exprimiert kurzen RNAs (zB snoRNA-55, snoRNA durchgeführt -135 oder U6) für die Normalisierung. Grundierungen und fluoreszierenden Sonden für bestimmte Gruppen von Menschen oder der Maus kann miRNA von Life Technologies Inc. gekauft werden Hier werden wir miR-124 als Beispiel für die miRNA von Interesse und snoRNA-55 als Beispiel für die Normalisierung verwenden.
- Perform Reverse Transkriptase-Reaktion, um aus RNA-Proben unter Verwendung von TaqMan Reverse Transkription-Kit cDNA:
| Artikel | Volume (ul) pro Probe |
| 5x RT-Primer | 1,00 |
| RNA-Probe | 1,67 |
| RT-Enzym-Mix | |
| Je 25 mm (100 mm Gesamtlänge) dNTPs | 0,050 |
| MultiScribe Reverse Transkriptase) | 0,333 |
| 10X RT-Puffer | 0,500 |
| AB RNase Inhibitor | 0,063 |
| Nuklease-freies Wasser | 1,388 |
| Gesamt | 5,00 |
RNA-Proben zu verdünnen Konzentration 3 ng / ul. Bereiten RT-Enzym-Mix und setzte 3,33 ul an PCR-Röhrchen und fügen 1,67 ul RNA-Probe. Inkubieren in PCR-Instrument (BioRad) bei 16 ° C30 min, 42 ° C für 30 min, 85 ° C für 5 min, und setzen bei 4 ° C gehalten.
- Führen Sie Echtzeit-PCR-Reaktion unter Verwendung von TaqMan-PCR-Mix:
| Artikel | Volume (ul) pro Probe |
| RT Produkt | 1,0 |
| 2X TaqMan Master Mix | 5,0 |
| 5fach-Sonde | 2,0 |
| Nuklease-freies Wasser | 2,0 |
| Gesamt | 10,0 |
Verwenden Sie eine 384-Well-Platte klare optische Reaktion (Life Technologies) für jede Reaktion und Echtzeit-PCR-Instrument AB 7900 HT. Zyklusbedingungen: 95 ° C für 10 min, [95 ° C für 5 s, 60 ° C für 60 sec] x 40 Zyklen.
- Typische Kurven für die Menge an Fluoreszenzrescently markierten spezifischen PCR-Produkte (y-Achse) für snoRNA-55 und miR-124-RNA-Proben (jede Probe ist in Duplikaten) aus Mikroglia und Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) im Vergleich zur Anzahl von Zyklen (x-Achse) isoliert gezeigt in. 4a, b.
6. Normalisierung und Datenanalyse
Relative Expressionslevel für miRNA von Interesse (miR-124) werden nach der Methode ΔΔCT wie zuvor beschrieben mit 7,9 snoRNA-55 für die Normalisierung der ursprünglichen Menge an RNA.
- Das Beispiel der Berechnung der relativen Höhe der miR-124 Ausdruck für Mikroglia und BMDMs ist in Tabelle I gezeigt.
- In einem ersten Schritt werden Ct-Werte für snoRNA-55 und miR-124 für Mikroglia und BMDMs von qRT-PCR-Kurven bestimmt (Abb. 4, Tabelle I, Spalten: snoRNA-55 und miR-124).
- In einem zweiten Schritt, Werte ΔCtwerden für jedes Duplikat jeder Probe durch Subtraktion der Ct für snoRNA-55 (Normalisierung), berechnet aus Ct für miR-124 (Experiment) (Tabelle I, Spalten: Ct (Norm), CT (Exp) und ΔCt).
- In einem dritten Schritt. ΔΔCt Werte werden durch Subtraktion der ΔCt der Referenzprobe (ΔCt (Ref)) aus ΔCt Werte der anderen Proben (: ΔΔCt Tabelle I, Spalte) berechnet. Eine Probe wird als Referenz definiert, die relative Höhe der miRNA-Expression für dieses Beispiel wird als 1,0 definiert werden. Alle anderen Proben wird dieser Referenzprobe verglichen werden. In unserem Fall definieren wir das Niveau von miR-124 in der ersten Probe für die Mikroglia als 1,0, also ΔCt (Ref) = 0,49 (Tabelle I, erste Reihe, rot markiert).
- MiR-124 E: Schließlich wird das relative Niveau der Ausdruck als 2-ΔΔCt (Tabelle I, Spalte berechnetXpression).
- Alle qRT-PCRs sind in dreifacher Ausführung oder in Duplikaten durchgeführt, und die relative Höhe der Expression wird als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) für Triplikate (Abb. 5a, b) oder sowohl als Duplikate nebeneinander, wie in Abb. 5c.
7. Repräsentative Ergebnisse
Typische Kurven für real-time PCR-und CT-Werte für miR-124 (microRNA of Interest) und snoRNA-55 (Normalisierung) sowie das relative Niveau der Expression von miR-124 sind in Abb. 4 und Tabelle I. In unseren Experimenten verwendeten wir snoRNA-55 als Kontrolle für Normalisierung. Wie oben erwähnt, können auch andere allgegenwärtigen RNAs auch für die Normalisierung wie snoRNA-135 und U6 eingesetzt werden.
Die Beispiele der Expression von miR-124 bei erwachsenen Mikroglia vs Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) sind in Abb. 5a (BMDMs wurden in der presenc gezüchtete von M-CSF, wie beschrieben 7). In Abb. 5b, verglichen wir die Expression von miR-124 in sortierten Populationen von CD45 niedrigen Mikroglia CD45 vs hallo Makrophagen. In beiden Experimenten haben wir gezeigt, dass Mikroglia von anderen Makrophagen exprimiert höheren miR-124 sind. Ähnliche Experimente können in der Zukunft für die Kinetik von Mikroglia-Aktivierung in vivo oder in vitro durchgeführt werden.
Die Expression von miR-124 in Mikroglia von ZNS von C57BL / 6 Mäusen in verschiedenen Stadien der Entwicklung isoliert ist in Abb. 5c. Diese Daten zeigen, dass die Mikroglia in frühen Phasen der Entwicklung Express unteren Ebenen der miR-124, die mit ihren aktivierten Phänotyp 7 korreliert. Ähnliche Analysen können durchgeführt werden, um die Funktionen der Mikroglia im normalen ZNS wie den Vergleich der Expression von miRNAs in bestimmten Mikroglia aus verschiedenen Bereichen des ZNS isoliert zu studieren: das Kleinhirn, sPinal Schnur, Hippocampus usw.
Abbildung 1. Die Beispiele für gute und schlechte Vorbereitung von Mikroglia als mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Im Fall von "gut" Isolierung der Mikroglia von normalen ZNS, repräsentieren 95-98% der Zellen CD45 + CD11b niedrigen microgla mit 2-5% der CD11b + CD45 Hallo perivaskuläre Makrophagen. Weniger als 1% der CD11b - hallo CD45-Lymphozyten oder CD11b - CD45 - astroglialen oder oligodendroglialen Zellen oder Zellfragmente vorhanden sein sollten (a). CD45 - - Zellen vorhanden ist (b, unteren linken Quadranten) die auf ein unzureichendes Percoll-Gradienten Trennung Der Fall des "schlechten" Vorbereitung ist hier (b), wo 18% der verunreinigenden CD11b gezeigt. Im Falle der guten Vorbereitung, sollten 95-98% der Zellen darstellen CD11b + CD45niedrigen Mikroglia (a, obere linke Quadrant), sollte 2-5% aller Zellen stellen CD11b + CD45 Hallo perivaskuläre Makrophagen (a, oberen rechten Quadranten), und weniger als 1% aller Zellen sollten CD11b negativen kontaminierenden Zellen (a darstellen, unteren linken Quadranten). Im Fall der "schlechten Vorbereitung" oder erheblicher Verunreinigung von CD11b - sind Zellen oder Zellfragmente (Astroglia, Myelin-Partikel etc.) vorhanden (b, unteren linken Quadranten), was Vorbereitung der Zellen ungeeignet für die RNA-Isolierung und weitere - CD45 Analyse. Darüber hinaus CD11b - könnte CD45 hallo Zellen auch in dem Fall von "schlechten Herstellung" (b, unteren rechten Quadranten) auf eine Kontamination durch Blut-Lymphozyten aufgrund unzureichender Perfusion.
Abbildung 2. Die Durchflusszytometrie analysis und Sortierung von Populationen von Mikroglia und Makrophagen aus peripheren erkrankten ZNS (a) Während Neuroinflammation drei Populationen der Zellen im ZNS sind: CD11b + CD45 niedrig (Mikroglia), CD11b + CD45 hallo (Makrophagen) und CD11b - CD45. Hallo (Lymphozyten), wie in der oberen linken, oberen rechten und unteren rechten Quadranten gezeigt. Tore für die Sortierung von Populationen von CD11b + CD45 niedrigen Mikroglia und CD11b + CD45 Hallo Makrophagen sind in (b) und die Reinheit der neu analysiert sortiert Populationen sind in (c, d) gezeigt. Vorläufige Gating auf lebensfähige Zellen auf FSC / SSC Parametern umgesetzt wurde.
Abbildung 3. Beispiele für "gute" und "schlechte" qualities von RNAs aus Mikroglia isoliert und mittels Gelelektrophorese analysiert. Im Falle von guter Qualität, ist die RNA-Leiter und ribosomalen RNA deutlich (a). Im Falle von schlechter Qualität, verschmieren, und niedermolekularen Abbauprodukte sind evident (b).
Abbildung 4. Echtzeit-PCR qRT-Kurven für fluoreszenzmarkierten miR-124 und snoRNA-55 PCR-Produkte. Kurven für snoRNA-55 (a) und miR-124 (b) für Mikroglia und Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) dargestellt. Das Experiment wurde in Duplikaten durchgeführt. Ct-Werte wurden durch den Schnittpunkt der Grundlinie mit dem unteren Teil des linearen Bereich der qRT-PCR ermittelten Kurven wie in (b) gezeigt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
| snoRNA-55 | miR-124 | DCT = Ct (Exp)-Ct (Norm) | DDCt = DCT-DCT (Ref) | Relative Höhe der Expression = 2-DDCt | |
| Ct (Norm) | Ct (Exp) | DCT | DDCt | miR-124 Expression | |
| Mikroglia von normalen ZNS | 24,082 | 24,572 | 0,49 (Referenz) | 0 | 1,0 |
| 23,766 | 24,291 | 0,525 | 0,035 | 1,02 | |
| Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) | 26,879 | 320,231 | 5,352 | 5,317 | 0,025 |
| 26,526 | 32,078 | 5,552 | 5,517 | 0,022 |
Tabelle I. Berechnung der relativen Pegel der miR-124 Expression in Mikroglia vs Knochenmark abgeleiteten Makrophagen von C t-Werte für miR-124 (microRNA of Interest) und snoRNA-55 (Kontrolle für Normalisierung) basiert.
Abbildung 5. Analyse von miR-124 Expression in Mikroglia und Makrophagen. Vergleich der miR-124 Expression in Mikroglia von normalen CNS vs Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) in (a) gezeigt. Vergleich der miR-124 in Mikroglia vs peripheren Makrophagen von ZNS in Mäusen mit Neuroinflammation isoliert ist in (b) gezeigt. Änderungen in derNiveau der Expression von miR-124 in Mikroglia während der Entwicklung in Mäusen, 1, 2 und 4 Wochen alt, wenn sie erwachsenen Mäusen (8 Wochen alt) verglichen wird, (c) gezeigt. In (a, b) das Experiment wurde in dreifacher Ausführung mit dem Mittelwert durchgeführt ± SD von drei getrennten PCR-Reaktionen gezeigt. In (c) Experiment wurde in Duplikaten durchgeführt, wie angegeben.
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Discussion
Kürzlich wurde großes Interesse an Mikroglia und Beteiligung dieser Zellen bei vielen Erkrankungen, die mit Neuroinflammation und Neurodegeneration verbunden gegeben. Darüber hinaus wurde die Rolle von microRNAs bei der Differenzierung von Immun-und Krebszellen sich in den letzten Jahren gewachsen 5,10. Wir haben zuvor die Rolle der miR-124 in der Wartung von nicht-aktivierten oder ruhenden Phänotyp der Mikroglia im normalen ZNS-7 berichtet, aber die Rolle der anderen Arten von Mikro-RNAs in Mikroglia-Phänotyp und Aktivierung Zustand bleibt, entdeckt zu werden. Dies erfordert die Entwicklung neuer Methoden zur Messung der miRNA-Expression spezifisch in Mikroglia.
Mikroglia-Zellen sind schwer zu handhaben, da in Versuchen sie aktiviert und wesentlich verändert nach ihrer Isolierung aus CNS geworden. Die Protokolle für die Isolierung der Mikroglia von normalen ZNS wurden bisher 11,12 veröffentlicht. Obwohl diese Protokolle coulbesorgen es für RNA-Isolierung sinnvoll, glauben wir, dass diese Protokolle besser geeignet für mRNA-Expression, anstatt für die Beurteilung der microRNA Expression sind. Erstens haben viele Forscher verwenden enzymatische Verdauung des homogenisierten Gewebe-oder Magnetic-Bead-Aufreinigung, die Mikroglia und aktivieren Ergebnis zu erheblichen Änderungen microRNA Expression (nicht veröffentlichte Beobachtung). Zweitens verwenden die Autoren Trizol-basierte Methoden zur RNA-Isolierung 11, die nicht optimal ist für microRNA-Analyse in einer kleinen Anzahl von Mikroglia-Zellen, besonders für jene Bevölkerungsgruppen, die von ZNS mittels FACS sortiert wurden. Hier stellen wir eine schnelle und einfache Protokoll mit minimalen Manipulationen bei der Isolierung von Mikroglia aus CNS. Dieses Verfahren ermöglicht die Aufnahme der reine Populationen der Mikroglia mit einem minimalen spontane Aktivierung mit einer Technik für eine wirksame Isolierung von RNA aus einer kleinen Anzahl von Zellen kombiniert. Darüber hinaus haben wir das Protokoll für die Isolierung von RNA, die besonders angereichert werdenmit kurzen nicht-kodierende RNAs und microRNA.
Neben der Reinheit der isolierten Mikroglia, ist es auch wichtig, um sicherzustellen, dass die Qualität der RNA geeignet ist. Ohne klare Trennung von Mikroglia auf der Percoll-Gradienten das Ergebnis ist die Kontamination der RNA-Proben mit Myelin Trümmer, die miRNA-Profiling in Mikroglia würde nicht nur schwer zu interpretieren, sondern vermindert auch die Qualität der RNA ziemlich drastisch aufgrund einer hohen Konzentration von Nukleinsäuren, Proteinen und Lipiden in Myelin Teilchen.
Wie oben erwähnt, ein erheblicher Schwierigkeiten bei der Messung miRNA Expression in Mikroglia ist die geringe Anzahl der Zellen und geringe Höhe der RNA selbst aus einer großen Gruppe von Mäusen (10 oder mehr) erhalten. Daher würden wir empfehlen, dass eine kurze Liste von 30.10 microRNAs und freuen separat auf der Ebene der Expression jedes der ein mit Singleplex qRT-PCR, anstatt weniger empfindlich Multiplex-PCR-Assays oder Arrays, dieerfordern eine große Menge an RNA. Nach Einschätzung der Expression verschiedener microRNAs durch Singleplex qRT-PCR, wie wir beschrieben, konnten andere in großem Maßstab miRNA Profiling-Methoden nach dessen sorgfältiger Validierung verwendet werden. Kürzlich gab es einen Bericht über eine weitere empfindliche Methode zur Multiplex-Analyse von microRNAs auf Mikrofluidik-Plattformen 13, die potenziell für große microRNA Expression Profiling in Mikroglia verabschiedet werden konnte.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde durch die NIH R01 NS071039-01A1 Forschungsstipendium unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b-PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
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- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
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