Summary
Microglia मैक्रोफेज है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की रक्षा और प्रतिरक्षा निगरानी की पहली पंक्ति प्रदान निवास कर रहे हैं. MicroRNAs विनियामक अणुओं है कि सक्रियण और मैक्रोफेज के भेदभाव सहित कई शारीरिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहे हैं. इस अनुच्छेद में, हम microglia में microRNAs की माप के लिए विधि का वर्णन करता है.
Protocol
1. Microglia की सामान्य सीएनएस से अलगाव
Microglia के अलगाव के रूप में 3 संशोधनों के साथ पहले से वर्णित किया जाता है.
- कैंची, संदंश, 27g सुई, 15 मिलीलीटर Dounce homogenizer (Teflon / कांच), 40 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी, 40% और 70% समाधान Percoll, 1X पीबीएस के साथ 10 मिलीलीटर सिरिंज: विच्छेदन और छिड़काव के लिए उपकरणों तैयार.
- सीओ 2 कैमरा ऑक्सीजन के अभाव में त्वरित asphyxiation द्वारा चूहों Euthanize और तुरंत शल्य जोड़तोड़ और छिड़काव के लिए प्रयोगशाला बेंच के लिए उन्हें स्थानांतरित.
- प्रदर्शन शल्य जोड़तोड़ (उपयोग कैंची और संदंश और एक एंटीसेप्टिक के रूप में 70% इथेनॉल): खुला peritoneal गुहा, डायाफ्राम, खुले सीने गह्वर में कटौती और कैंची के साथ सही atrium कटाव.
- बाएं वेंट्रिकल में 10 मिलीलीटर सिरिंज इंजेक्शन और दबाव लागू करने से पूरे शरीर intracardial छिड़काव प्रदर्शन करते हैं. देहात में धीमी और स्थिर रक्त परिसंचरण के माध्यम से 1X पीबीएस 8-10 मिलीग्राम दर्राCE.
- दोहराएँ (आमतौर पर 5-10 चूहों) समूह में सभी चूहों के लिए 1.2-1.4 कदम. छिड़काव के बाद बर्फ पर माउस रखने के लिए जब तक सभी चूहों perfused हैं.
- सभी चूहों के छिड़काव के बाद, दिमाग और रीढ़ की हड्डी डोरियों काटना. (वैकल्पिक: करने के लिए मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में miRNAs की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए, सेरिबैलम, 5-10 चूहों और homogenization के लिए उन्हें एक साथ पूल के समूह के लिए हिप्पोकैम्पस आदि के रूप में इन विशिष्ट क्षेत्रों काटना).
- दिमाग और रीढ़ की हड्डी डोरियों 15 मिलीलीटर Dounce homogenizer का उपयोग Homogenize. जगह एक मस्तिष्क और homogenizer में एक रीढ़ की हड्डी और 1X पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें. 10-20 कोमल हमलों प्रदर्शन, सेल झरनी के माध्यम से 50 मिलीलीटर शंक्वाकार और एक बड़ा अपकेंद्रित्र 5-7 मिनट पर 2000 rpm पर ट्यूब प्रमाणपत्र में homogenate पारित.
- सतह पर तैरनेवाला, resuspend / 70% Percoll और उपरिशायी 40% Percoll के 7 मिलीग्राम 5-7 मिलीलीटर में 2-3 चूहों से रीढ़ की हड्डी homogenate मस्तिष्क त्यागें. 2000 आरपीएम (कोई ब्रेक नहीं!) पर 30 मिनट के लिए स्पिन.
- क्षतिग्रस्त / माइलिन मलबे की कोशिकाओं के 70% के एक शीर्ष पर त्यागें और मोनो इकट्ठा40% / 70% इंटरफ़ेस में परमाणु कोशिकाओं. कम से कम 5-7 मिनट के लिए 2000 rpm पर एक 1X पीबीएस और स्पिन के साथ 1:01 पर एकत्र की कोशिकाओं पतला. पीबीएस की 0.5 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend के और उन्हें 1.7 मिलीलीटर ependorf है ट्यूब में स्थानांतरित. ठेठ उपज ~ 500 x 10 3 माउस प्रति mononuclear कोशिकाओं है, जो 2-3 चूहों के दिमाग और रीढ़ की हड्डी डोरियों से कोशिकाओं की तैयारी के लिए microglial कोशिकाओं की संख्या ~ 0.5 मिलीलीटर में 6 1x10 देना होगा.
2. Microglia की पवित्रता का प्रवाह cytometry द्वारा नियंत्रण
एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना के रूप में पहले 7,8 संशोधनों के साथ वर्णित है.
- पीई, विरोधी CD45-APC Cy7 एंटीबॉडी, पीबीएस में 1% paraformaldehyde के FACS (2% FBS साथ 1X पीबीएस) बफर, FCR अवरुद्ध एंटीबॉडी, विरोधी CD11b तैयार करते हैं.
- 1.9 कदम से कोशिकाओं के 50 μl ले लो और उन्हें नई 1.7 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब हस्तांतरण और FACS बफर के 350 μl जोड़ें.
- विरोधी FCR एंटीबॉडी के 5-10 μl जोड़ें और 10-15 सेते हैंबर्फ पर पहले.
- दो Eppendorf ट्यूब में कोशिकाओं को विभाजित. एक ट्यूब के लिए विरोधी CD11b 1 μl जोड़ें - पीई और 2 μl विरोधी CD45-APC-Cy7 एंटीबॉडी और बर्फ पर 10-15 मिनट सेते हैं. दूसरी ट्यूब को प्रतिरक्षी धुंधला के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद दोनों 5400 rpm पर 5 मिनट के लिए छोटे से अपकेंद्रित्र में स्पिन और ट्यूबों FACS बफर के 1 मिलीग्राम जोड़ने. कताई के बाद उन्हें 1% paraformaldehyde पीबीएस और vortexing में 400 μl में resuspending द्वारा कोशिकाओं तय कर लो.
- प्रवाह (एलएसआर द्वितीय, बी.डी. बायोसाइंसेज) कोशिकामापी मुआवजा नियंत्रण के लिए बी.डी. compubeads (बी.डी. बायोसाइंसेज) का उपयोग कर के रूप में 8 में वर्णित किया गया है पर प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं. अच्छे और बुरे की तैयारी के उदाहरण छवि में दिखाया जाता है. 1a, ख.
3. Microglia और परिधीय मैक्रोफेज Neuroinflammation के माउस मॉडल में सूजन सीएनएस से अलगाव
प्रयोगात्मक autoimmune इन्सेफेलाइटिस (EAE) के रूप में पहले वर्णित किया गया है प्रेरितहमारे समाचार पत्र में 7, FACS छँटाई इसी तरह प्रकाशित 8 प्रोटोकॉल करने के लिए किया जाता है.
- चमड़े के नीचे प्रतिरक्षण द्वारा 150 मिलीग्राम 4 मिलीग्राम / 5-10 के समूह की मिलीलीटर पूरी Freund सहायक (CFA) में 8-12 सप्ताह पुराने C57BL / 6 चूहों 35-55 पेप्टाइड MOG साथ EAE प्रेरित. पर्टुसिस विष शून्य दिन और दो दिन, के बाद टीकाकरण पर आईपी (150 एनजी / माउस) दी जानी चाहिए. चूहों रोग के लक्षण के 10 - प्रतिरक्षण के बाद दिन पर शुरू करने के लिए मनाया जाता है, और रोग की गंभीरता 0-5 से एक संख्यात्मक पैमाने पर रन बनाए है निम्नानुसार है: 0) कोई बीमारी, 1) कमजोर पूंछ या wobbly की पैदल दूरी पर, 2) पिछले अंग केवल पेशियों का पक्षाघात 4) हिंद और forelimb पक्षाघात, 3) पिछले अंग पक्षाघात और 5) मानवीय कारणों की वजह से मृत्यु या इच्छामृत्यु. रोग के चरम पर चूहे (d21 के बाद टीकाकरण) से ठेठ रोग 1.5 से 2.5 से लेकर स्कोर के साथ प्रयोग के लिए किया जाता है.
- 1.1-1.4 कदम के रूप में 5-10 चूहों के समूह की सीएनएस से mononuclear कोशिकाओं को अलग और है 2.1-2.4 कदम के रूप में विरोधी CD11b और विरोधी CD45 एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं दाग.2.4 चरण में कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, बजाय उन्हें 1X के बजाय 1% paraformaldehyde के पीबीएस 400 μl में resuspend.
- सेल छँटाई FACSAria CD11b की आबादी + CD45 कम microglia और CD11b + CD45 हाय कोशिकाओं (~ उनमें से 80% परिधीय मैक्रोफेज हैं और ~ उनमें से 20% 3 microglia सक्रिय कर रहे हैं के लिए किया जाता है, भविष्य में हम इन कोशिकाओं के रूप में संदर्भित करेंगे " "मैक्रोफेज). नमूनों के संग्रह के लिए 1.7 मिलीलीटर ependorf ट्यूबों का प्रयोग करें. 10% FBS साथ 1X पीबीएस 300 μl संग्रह ट्यूबों के लिए जोड़ा जाना चाहिए करने के लिए हल कोशिकाओं के नुकसान को रोकने के. Microglia के तीन आबादी, मैक्रोफेज और लिम्फोसाइटों के उदाहरण छवि में दिखाया जाता है. 2 उचित छँटाई गेट छवि में दिखाया गया सेटिंग्स के साथ. 2b. ठेठ छँटाई purities 98-100% थे microglia का हल आबादी (छवि 2c) और मैक्रोफेज (छवि 2d) reanalyzing द्वारा निर्धारित रूप में. ठेठ उपज 20-50 microglia के लिए 3 x10 और50-100 x10 पांच चूहों के समूह से अलग मैक्रोफेज के लिए 3.
4. शाही सेना के अलगाव
शाही सेना में संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार mirVana किट का उपयोग कर अलग किया जाएगा.
- 1.9 कदम या microglia और 1.7 मिलीग्राम Eppendorf ट्यूबों में छोटे अपकेंद्रित्र में 5-7 मिनट के लिए 5400 rpm पर 3.3 कदम से मैक्रोफेज के हल सबसेट से सामान्य सीएनएस से microglia स्पिन के, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागने और सूखी बर्फ पर सेल छर्रों फ्रीज. 4.2 कदम आगे बढ़ना या सी -70, जहां यह 2-3 महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है जमे हुए सेल छर्रों हस्तांतरण.
- विगलन के लिए नियमित रूप से बर्फ के लिए स्थानांतरण जमे हुए सेल छर्रों. Lysis बफर के 300 μl mirVana किट से जोड़ें और धीरे 5-7 बार pipeting द्वारा मिश्रण.
- MirVana किट, भंवर 30 सेकंड से Homogenate Additive के 30 μl जोड़ें मिश्रण करने के लिए, 10 मिनट के लिए बर्फ पर रख
- 5 मीटर के लिए 30 सेकंड भंवर mirVana किट,, स्पिन से क्लोरोफॉर्म: एसिड Pehnol के 300 μl जोड़ेंमें छोटे अपकेंद्रित्र पर 10,000 rpm पर.
- ध्यान से ऊपरी जलीय चरण (300 μl) लेने के लिए और एक और 1.7 मिलीग्राम Eppendorf ट्यूब, इथेनॉल 100% 375 μl के साथ मिश्रण करने के लिए स्थानांतरण करने के लिए mirVana किट और स्पिन से 10,000 rpm पर 1 मिनट के लिए कारतूस फ़िल्टर हस्तांतरण.
- बफर के माध्यम से, धो समाधान से mirVana किट मैं, और 10,000 rpm पर 1 मिनट के लिए स्पिन के 700 μl जोड़ने त्यागें प्रवाह.
- MirVana किट से धो समाधान द्वितीय 500 μl के साथ दो बार धो और अंत में कारतूस से पूर्व गर्म पानी nuclease मुक्त 60 μl के साथ शाही सेना elute.
- और शाही सेना की राशि गुणवत्ता Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग मूल्यांकन किया है. शाही सेना की एकाग्रता 5 से 20 एनजी / एमएल और λ260 आयुध डिपो / 1.7-2.0 सीमा के भीतर λ280 अनुपात होना चाहिए. यदि शाही सेना की एकाग्रता 3 एनजी / एमएल और आयुध डिपो 260λ/280λ 1.6 से कम है की तुलना में कम है, नमूने खारिज कर रहे हैं. शाही सेना के नमूने 6-12 महीने के लिए -70 ° सी में संग्रहीत किया जा सकता है.
- शाही सेना की गुणवत्ता, नमूने ar आगे आकलन के लिएई 15% जेल tbe यूरिया (जीवन टेक्नोलॉजीज) में जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग का विश्लेषण किया. शाही सेना की तैयारी के अच्छे और बुरे गुणवत्ता के विशिष्ट उदाहरण छवि में दिखाया जाता है. 3a और Fig.3b क्रमशः.
5. MiRNA की microglia और मैक्रोफेज में जांच
MiRNA अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए, वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर (qRT पीसीआर) विश्लेषण किया जाता है प्राइमरों और ब्याज की विशेष microRNA के लिए फ्लोरोसेंट जांच और सर्वत्र व्यक्त छोटे RNAs के (जैसे snoRNA 55, snoRNA के साथ TaqMan assays का उपयोग -135 या U6 सामान्य के लिए). प्राइमर्स और मानव या माउस miRNA विशेष सेट के लिए फ्लोरोसेंट जांच के जीवन टेक्नोलॉजीज इंक से खरीदा जा सकता है यहाँ हम और सामान्य के लिए एक उदाहरण के रूप में ब्याज snoRNA-55 के miRNA के लिए एक उदाहरण के रूप में मीर 124 का उपयोग करें.
- रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस प्रतिक्रिया करने के लिए शाही सेना के नमूने TaqMan रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग कर से सीडीएनए का निष्पादन करें:
| मद | नमूना प्रति मात्रा μl |
| 5x आरटी प्राइमर | 1.00 |
| शाही सेना नमूना | 1.67 |
| आरटी एनजाइम मिक्स | |
| प्रत्येक 25 dNTPs मिमी (100 मिमी) | 0.050 |
| रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस MultiScribe) | 0.333 |
| 10X आरटी बफर | 0.500 |
| अटल बिहारी RNase अवरोध करनेवाला | 0.063 |
| Nuclease - मुक्त पानी | 1.388 |
| कुल | 5.00 |
पतला में एकाग्रता 3 एनजी / μl नमूने शाही सेना. आरटी एनजाइम मिक्स तैयार और पीसीआर नलियों के लिए 3.33 μL और आरएनए नमूना 1.67 μl जोड़ने. 16 डिग्री सेल्सियस पीसीआर साधन BioRad () में अंडों पर बैठना30 मिनट, 42 ° 5 मिनट और 4 साल में डिग्री सेल्सियस पकड़ पर सेट के लिए 30 मिनट, 85 डिग्री सेल्सियस के लिए सी के लिए.
- वास्तविक समय पीसीआर प्रतिक्रिया TaqMan पीसीआर मिश्रण का उपयोग करें:
| मद | नमूना प्रति मात्रा μl |
| RT उत्पाद | 1.0 |
| 2X TaqMan मास्टर मिक्स | 5.0 |
| 5X जांच | 2.0 |
| Nuclease - मुक्त पानी | 2.0 |
| कुल | 10.0 |
एक साथ 384 अच्छी तरह से स्पष्ट प्रत्येक प्रतिक्रिया और वास्तविक समय पीसीआर साधन अटल बिहारी 7900 हिंदुस्तान टाइम्स के लिए ऑप्टिकल प्रतिक्रिया प्लेट (जीवन टेक्नोलॉजीज) का प्रयोग करें. साइकिल चालन की स्थिति: 95 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए, [95 डिग्री सेल्सियस 5 सेकंड, 60 सेकंड के लिए 60 ° सी] एक्स 40 चक्र.
- Fluo की राशि के लिए ठेठ curvesrescently snoRNA-55 और मीर 124 के लिए विशिष्ट पीसीआर (y-अक्षों) शाही सेना (प्रत्येक नमूना डुप्लिकेट में है) नमूने से अलग microglia और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न (BMDMs) मैक्रोफेज बनाम चक्रों की संख्या (x-अक्षों) के लिए उत्पादों में चिह्नित कर रहे हैं छवि में दिखाया गया है. 4a, ख.
6. सामान्य है और डेटा विश्लेषण
ब्याज की miRNA (मीर 124) के लिए सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर को ΔΔCT विधि का उपयोग कर के रूप में पहले 7,9 वर्णित शाही सेना की प्रारंभिक राशि को सामान्य बनाने के लिए snoRNA-55 का उपयोग कर की गणना कर रहे हैं.
- मीर 124-microglia और BMDMs के लिए अभिव्यक्ति के रिश्तेदार स्तर की गणना के उदाहरण मैं तालिका में दिखाया गया है.
- एक पहला कदम के रूप में, सीटी snoRNA-55 और मीर 124 के लिए मूल्यों microglia और BMDMs के लिए qRT-पीसीआर घटता से निर्धारित कर रहे हैं (Fig.4, टेबल मैं, कॉलम: snoRNA-55 और मीर 124).
- एक दूसरे कदम के रूप में, ΔCt मूल्योंसीटी की घटाव द्वारा प्रत्येक नमूने के प्रत्येक डुप्लिकेट के लिए snoRNA 55 (सामान्य) के लिए (प्रयोग) मीर 124 (: सीटी नॉर्म (), (ऍक्स्प) सीटी, और ΔCt है मैं टेबल, स्तंभों) के लिए गणना की सीटी से.
- तीसरे कदम के रूप में. ΔΔCt मूल्यों संदर्भ नमूना के ΔCt की अन्य नमूने (: ΔΔCt टेबल मैं, स्तंभ) के ΔCt मूल्यों से घटाव (ΔCt (रेफरी)) द्वारा की गणना कर रहे हैं. एक नमूना एक संदर्भ के रूप में परिभाषित किया गया है, इस नमूने के लिए miRNA अभिव्यक्ति के रिश्तेदार स्तर 1.0 के रूप में परिभाषित किया जाएगा. अन्य सभी नमूनों को इस संदर्भ नमूना से तुलना की जाएगी. हमारे मामले में, हम microglia के लिए पहले नमूने में 1.0 के रूप में मीर 124 के स्तर को परिभाषित इसलिए ΔCt (रेफरी) = 0.49 (टेबल मैं, पहली पंक्ति, लाल रंग में चिह्नित).
- मीर 124 ई: अंत में, अभिव्यक्ति के रिश्तेदार स्तर 2 - ΔΔCt (मैं तालिका, स्तंभ के रूप में परिकलित किया जाता है) xpression.
- सभी qRT PCRs triplicates में या डुप्लिकेट में प्रदर्शन कर रहे हैं, और अभिव्यक्ति के रिश्तेदार स्तर मतलब के रूप में प्रस्तुत किया है ± triplicates (छवि 5a, ख) के लिए या पक्ष द्वारा दोनों डुप्लिकेट पक्ष के रूप में छवि में दिखाया के रूप में मानक विचलन (एसडी). 5c.
7. प्रतिनिधि परिणाम
वास्तविक समय पीसीआर और सीटी मूल्यों मीर 124 के लिए ब्याज की microRNA और snoRNA-55 (सामान्य) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मीर 124 अभिव्यक्ति के रिश्तेदार स्तरों के लिए ठेठ घटता छवि में दिखाया गया हैं. 4 और तालिका-I हम हमारे प्रयोगों में सामान्य के लिए एक नियंत्रण के रूप में snoRNA-55 का इस्तेमाल किया. जैसा कि हम ऊपर उल्लेख किया है, अन्य सर्वव्यापक RNAs के भी जैसे snoRNA-135 और U6 सामान्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
वयस्क microglia बनाम बोन मैरो व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDMs) के मीर 124 अभिव्यक्ति के उदाहरण छवि में दिखाया जाता है. 5a (BMDMs presenc में बड़े हो रहे थेएम-CSF ई के रूप में 7 वर्णित). छवि में. 5b, हम मीर CD45 कम microglia बनाम CD45 हाय मैक्रोफेज हल आबादी में 124 की अभिव्यक्ति की तुलना में. इन प्रयोगों के दोनों में हम दिखा दिया कि microglia मीर 124 के उच्च स्तर व्यक्त की अन्य मैक्रोफेज से अलग हैं. इसी तरह के प्रयोगों vivo में इन विट्रो में microglia सक्रियण के कैनेटीक्स के लिए भविष्य में किया जा सकता है.
Microglia में मीर 124 अभिव्यक्ति C57BL के विकास के विभिन्न चरणों में / CNS से 6 चूहों से अलग छवि में दिखाया गया है. 5c. इस डेटा कि microglia विकास कम व्यक्त मीर 124 के स्तर है, जो उनके सक्रिय 7 phenotype के साथ सहसंबद्ध की प्रारंभिक अवस्था में प्रदर्शित करता है. सेरिबैलम, इसी तरह के विश्लेषण के लिए microglia में विशेष रूप से miRNAs सीएनएस के विभिन्न क्षेत्रों से अलग - थलग की अभिव्यक्ति की तुलना के रूप में सामान्य CNS में microglia के कार्यों का अध्ययन किया जा सकता हैPinal कॉर्ड, हिप्पोकैम्पस आदि
आकृति 1. उदाहरण microglia के अच्छे और बुरे की तैयारी के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित की. सामान्य सीएनएस से "अच्छा" microglia के अलगाव के मामले में, कोशिकाओं के 95-98% CD11b के 2-5% के साथ CD11b + में CD45 कम microgla का प्रतिनिधित्व करते हैं + CD45 हाय perivascular मैक्रोफेज. CD11b की 1% से कम - हाय CD45 लिम्फोसाइटों या CD11b - CD45 - astroglial या oligodendroglial कोशिकाओं या सेल टुकड़े मौजूद होना चाहिए (एक). "बुरा" तैयार करने के मामले में यहाँ दिखाया गया है (ख) जहां CD11b contaminating के 18% CD45 कोशिकाओं मौजूद है (ख, निचले बाएँ वृत्त का चतुर्थ भाग) अपर्याप्त Percoll ढाल जुदाई सुझाव. अच्छी तैयारी के मामले में, कोशिकाओं के 95-98% का प्रतिनिधित्व करना चाहिए CD11b + CD45कम microglia (एक ऊपरी बाएँ वृत्त का चतुर्थ भाग), सभी कोशिकाओं की 2-5% CD11b + CD45 हाय perivascular मैक्रोफेज (एक ऊपरी दाएँ वृत्त का चतुर्थ भाग) का प्रतिनिधित्व करते हैं, और सभी कोशिकाओं की कम से कम 1% CD11b नकारात्मक contaminating के कोशिकाओं (एक का प्रतिनिधित्व करना चाहिए, कम छोड़ दिया वृत्त का चतुर्थ भाग). "बुरा तैयारी के मामले में, CD11b की महत्वपूर्ण संदूषण - CD45 - कोशिकाओं या सेल टुकड़े (अस्थिकणिका, माइलिन कणों आदि) मौजूद हैं (ख, निचले बाएँ वृत्त का चतुर्थ भाग), जो शाही सेना अलगाव और आगे के लिए अनुपयुक्त कोशिकाओं की तैयारी करता है विश्लेषण. इसके अलावा, CD11b CD45 हाय कोशिकाओं भी "बुरा तैयारी" के मामले में वर्तमान (ख, निचले सही वृत्त का चतुर्थ भाग) अपर्याप्त छिड़काव के कारण रक्त लिम्फोसाइटों द्वारा संक्रमण का संकेत है.
चित्रा 2. प्रवाह cytometry विश्लेषणऔर रोगग्रस्त सीएनएस से microglia और परिधीय मैक्रोफेज की आबादी की छँटाई neuroinflammation के दौरान (एक) कोशिकाओं के तीन आबादी CNS में मौजूद हैं: CD11b + CD45 (microglia) कम है, CD11b + CD45 हाय के (मैक्रोफेज), और CD11b - CD45. (लिम्फोसाइटों) हाय, के रूप में ऊपरी बाएँ, ऊपरी सही और निचले सही quadrants में दिखाया, क्रमशः. CD11b + CD45 कम microglia और CD11b की आबादी छँटाई करने के लिए गेट्स + CD45 हाय मैक्रोफेज (ख) और reanalyzed हल आबादी की purities में दिखाए जाते हैं (ग, घ) में दिखाया जाता है. व्यवहार्य कोशिकाओं पर प्रारंभिक gating के FSC / एसएससी मापदंडों के आधार पर लागू किया गया था.
चित्रा 3. "अच्छा" और "बुरा" qualit का उदाहरणसे microglia से अलग है और जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण RNAs के एँ. अच्छी गुणवत्ता के मामले में, शाही सेना सीढ़ी और ribosomal शाही सेना स्पष्ट है (एक). खराब गुणवत्ता, धब्बा, और कम आणविक भार गिरावट उत्पादों के मामले में स्पष्ट (ख) कर रहे हैं.
चित्रा 4. वास्तविक समय के लिए qRT-पीसीआर घटता fluorescently मीर 124 और पीसीआर snoRNA-55 उत्पादों लेबल (क) snoRNA-55 और मीर 124 (ख) के लिए घटता microglia और बोन मैरो व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDMs) के लिए दिखाए जाते हैं. प्रयोग डुप्लिकेट में प्रदर्शन किया गया था. सीटी मूल्यों qRT पीसीआर रैखिक श्रृंखला के निचले हिस्से के साथ आधारभूत का प्रतिच्छेदन द्वारा निर्धारित किया गया है (ख) में दिखाया के रूप में घटता. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
| snoRNA - -55 | मीर - 124 | डीसीटी = सीटी (ऍक्स्प) - सीटी (आदर्श) | DDCt = डीसीटी - डीसीटी (रेफरी) | अभिव्यक्ति की सापेक्ष स्तर = 2 - DDCt | |
| सीटी (आदर्श) | सीटी (ऍक्स्प) | डीसीटी | DDCt | मीर 124 अभिव्यक्ति | |
| सामान्य सीएनएस से microglia | 24.082 | 24.572 | 0.49 (रेफरी) | 0 | 1.0 |
| 23.766 | 24.291 | 0.525 | 0.035 | 1.02 | |
| बोन मैरो व्युत्पन्न (BMDMs) मैक्रोफेज | 26.879 | 32.231 | 5.352 | 5.317 | 0.025 |
| 26.526 | 32.078 | 5.552 | 5.517 | 0.022 |
टेबल microglia बनाम अस्थि मज्जा व्युत्पन्न ब्याज की microRNA मीर 124 और snoRNA 55 (सामान्य नियंत्रण के लिए) के लिए सी टी मूल्यों के आधार मैक्रोफेज में मीर 124 अभिव्यक्ति के रिश्तेदार स्तरों के मैं गणना.
चित्रा 5. मीर 124 microglia और मैक्रोफेज में अभिव्यक्ति का विश्लेषण microglia में मीर 124 अभिव्यक्ति की सामान्य सीएनएस बनाम अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDMs) के से तुलना (क) में दिखाया गया है. Microglia बनाम परिधीय की neuroinflammation साथ चूहों में सीएनएस से अलग मैक्रोफेज में मीर 124 की तुलना में (ख) में दिखाया गया है. में परिवर्तनmicroglia में मीर 124 की 1, 2, और 4 सप्ताह पुराने के चूहों में विकास के दौरान जब वयस्क चूहों (8 सप्ताह की उम्र में) की तुलना में अभिव्यक्ति के स्तर (ग) में दिखाया गया है. (क, ख) प्रयोग तीन प्रतियों में मतलब के साथ किया गया था ± तीन अलग पीसीआर प्रतिक्रियाओं के एसडी दिखाया. (ग) प्रयोग डुप्लिकेट में प्रदर्शन किया गया था के रूप में संकेत दिया.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हाल ही में महत्वपूर्ण ब्याज microglia और इन कोशिकाओं के neuroinflammation और neurodegeneration के साथ जुड़े कई विकृतियों में भागीदारी के लिए दिया गया था. इसके अलावा, प्रतिरक्षा और कैंसर कोशिकाओं के भेदभाव में microRNAs की भूमिका में नाटकीय रूप से पिछले कई वर्षों 5,10 से अधिक हो गया है. हम पहले से microglia सामान्य 7 CNS में गैर सक्रिय या आराम phenotype की रखरखाव में मीर 124 की भूमिका की सूचना दी है, लेकिन microglia phenotype और सक्रियण राज्य में microRNAs के अन्य प्रकार की भूमिका के लिए खोज जाना बना रहता है. यह miRNA अभिव्यक्ति microglia में विशेष रूप से मापने के लिए नए तरीकों के विकास की आवश्यकता होगी.
Microglia मुश्किल कोशिकाओं के प्रयोगों में संभाल के बाद से वे सक्रिय और सीएनएस से उनके अलगाव के बाद काफी बदल हो रहे हैं. microglia की सामान्य सीएनएस से अलगाव के लिए प्रोटोकॉल पहले 11,12 प्रकाशित किए गए थे. हालांकि इन प्रोटोकॉल coulशाही सेना के अलगाव के लिए उपयोगी होना चाहते, हम मानते हैं कि इन प्रोटोकॉल बजाय microRNA अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए mRNA अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त हैं. सबसे पहले, कई जांचकर्ताओं homogenized ऊतक या चुंबकीय मनका शुद्धि है कि microRNA अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन में microglia और परिणाम को सक्रिय करने के enzymatic पाचन (प्रकाशित प्रेक्षण नहीं) का उपयोग करें. दूसरा, लेखकों आरएनए 11 अलगाव जो कि FACS द्वारा सीएनएस से हल किया गया है उन आबादी के लिए विशेष रूप से microglial कोशिकाओं की एक छोटी संख्या में microRNA विश्लेषण के लिए इष्टतम नहीं है लिए Trizol आधारित विधियों का उपयोग करें. यहाँ, हम microglia की CNS से अलगाव के दौरान कम से कम जोड़तोड़ के साथ एक त्वरित और सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. Microglia की शुद्ध आबादी के इस विधि सहज कक्षों की एक छोटी संख्या से शाही सेना के अलगाव के लिए प्रभावी तकनीक के साथ संयुक्त सक्रियण के न्यूनतम स्तर के साथ प्राप्त करने की अनुमति देता है. इसके अलावा, हम जो विशेष रूप से समृद्ध होगा शाही सेना के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का इस्तेमाल कियाकम गैर कोडन RNAs और microRNA के साथ.
अलग microglia की पवित्रता के अलावा, यह भी महत्वपूर्ण है लगता है कि शाही सेना की गुणवत्ता उपयुक्त है. , Microglia का Percoll ढाल पर उचित जुदाई के बिना परिणाम माइलिन मलबे के साथ शाही सेना के नमूने के संदूषण, microglia में miRNA रूपरेखा बनाने के लिए न केवल मुश्किल व्याख्या करने के लिए होगा, लेकिन यह भी शाही सेना की गुणवत्ता के बजाय काफी घट जाती है के एक उच्च एकाग्रता की वजह से है nucleic एसिड, प्रोटीन, और माइलिन कणों में lipids.
जैसा कि हम ऊपर उल्लेख किया है, microglia में miRNA अभिव्यक्ति को मापने में एक काफी कठिनाई कोशिकाओं और चूहों (10 या अधिक) के एक बड़े समूह से भी प्राप्त की शाही सेना के कम राशि की छोटी संख्या है. इसलिए हम 10-30 microRNAs की एक छोटी सूची बनाने की सिफारिश और कम संवेदनशील मल्टीप्लेक्स पीसीआर assays के या arrays कि का उपयोग कर से qRT - पीसीआर बल्कि singleplex का उपयोग कर के प्रत्येक की अभिव्यक्ति के स्तर पर अलग से देखोशाही सेना के एक नहीं बल्कि उच्च राशि की आवश्यकता है. कई qRT पीसीआर singleplex द्वारा microRNAs के रूप में हम वर्णित की अभिव्यक्ति का आकलन करने के बाद, अन्य बड़े पैमाने पर miRNA रूपरेखा तरीकों उनके सावधान मान्यता के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है. हाल ही में, वहाँ मल्टीप्लेक्स microfluidics के 13 प्लेटफार्मों, जो संभवतः microglia में बड़े पैमाने पर microRNA अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए अपनाया जा सकता है पर microRNAs के विश्लेषण के लिए एक और अधिक संवेदनशील विधि के बारे में एक रिपोर्ट था.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
काम NIH NS071039-01A1 अनुसंधान अनुदान R01 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b-PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L.
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P.
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
