Summary
Microglia zijn gevestigd macrofagen dat de eerste lijn van verdediging en het immuunsysteem de bewaking van het centrale zenuwstelsel te bieden. MicroRNA zijn moleculen die een belangrijke rol spelen in tal van fysiologische processen, zoals activatie en differentiatie van macrofagen. In dit artikel beschrijven we de methode voor het meten van microRNA's in de microglia.
Abstract
Microglia cellen van de myeloïde afstamming die zich in het centrale zenuwstelsel (CNS) 1. Deze cellen spelen een belangrijke rol in de pathologie van de vele ziekten die samenhangen met neuroinflammatie zoals multiple sclerose (MS) 2. Microglia in een normale CNS te uiten macrofaag marker CD11b en vertonen een rust-fenotype met het uitspreken van een laag niveau van activatie markers zoals CD45. Tijdens de pathologische gebeurtenissen in het CZS, microglia geactiveerd zoals bepaald worden door verhoogde expressie van CD45 en andere markers 3. De factoren die microglia fenotype en functies in het centraal zenuwstelsel aantasten zijn niet goed onderzocht. MicroRNA (miRNAs) zijn een groeiende familie van geconserveerde moleculen (~ 22 nucleotiden lang) die betrokken zijn bij veel normale fysiologische processen, zoals celgroei en-differentiatie 4 en aandoeningen zoals ontsteking 5. MiRNAs downregulate de expressie van bepaalde genen door binding complementaire sequenties van deir. mRNA's en spelen een belangrijke rol in de activering van aangeboren immuunsysteem cellen waaronder macrofagen 6 en microglia 7. Om te onderzoeken miRNA gemedieerde paden die de microgliale fenotype, biologische functie te definiëren, en om microglia te onderscheiden van andere vormen van macrofagen, is het belangrijk om kwantitatief beoordelen van de expressie van bepaalde microRNA's in verschillende subsets van CNS-ingezeten microglia. Gemeenschappelijke methoden voor het meten van de expressie van miRNAs in het centraal zenuwstelsel zijn onder andere kwantitatieve PCR uit hele neuronaal weefsel en in situ hybridisatie. Echter, kwantitatieve PCR van hele weefsel homogenaat niet wordt het mogelijk de expressie van miRNA in microglia die slechts 5-15% van de cellen van neuronale weefsel vormen. Hybridisatie in situ laat de evaluatie van de expressie van microRNA in specifieke celtypen in weefselcoupes, maar deze methode is niet geheel kwantitatief. In dit rapport beschrijven we een kwantitatieve en senstieve methode voor de detectie van miRNA door real-time PCR in microglia geïsoleerd van normale CNS of tijdens neuroinflammatie met behulp van experimentele auto-immune encephalomyelitis (EAE), een muismodel voor MS. De beschreven methode zal nuttig zijn om het niveau van expressie van microRNA's in microglia in normale CNS of tijdens neuroinflammatie in verband met diverse aandoeningen zoals MS, beroerte, traumatisch letsel, de ziekte van Alzheimer en hersentumoren te meten.
Protocol
1. Isolatie van Microglia van Normaal CNS
Isolatie van microglia uitgevoerd zoals eerder beschreven wijzigingen 3.
- Bereid instrumenten voor dissectie en perfusie: schaar, pincet, 10 ml spuit met 27g naald, 15 ml Dounce homogenisator (Teflon / glas), 40 micrometer nylon cel zeef, 40% en 70% Percoll oplossingen, 1X PBS.
- Euthanaseren muizen door middel van snelle stikken (ontheffing van zuurstof) de CO 2-camera en direct overbrengen naar laboratoriumtafel voor chirurgische manipulaties en perfusie.
- Voer chirurgische manipulaties (scharen en pincetten en 70% ethanol als ontsmettingsmiddel): open buikholte, snij het middenrif, open borstholte en knippen het rechter atrium met een schaar.
- Voer het hele lichaam intracardiale perfusie door het injecteren van 10 ml spuit in de linker hartkamer en druk uit te oefenen. Pass 8-10 ml 1X PBS via de bloedsomloop bij langzaam en regelmatig pace.
- Herhaal de stappen 1.2-1.4 voor alle muizen in de groep (typisch 5-10 muizen). Na perfusie te houden muis op ijs totdat alle muizen worden doorbloed.
- Na perfusie van alle muizen, ontleden hersenen en ruggenmerg. (Optioneel: de expressie van miRNAs in verschillende gebieden van de hersenen te bestuderen, ontleden deze specifieke gebieden, zoals de kleine hersenen, de hippocampus, etc. voor de groep van 5-10 muizen en het zwembad ze samen voor het homogeniseren).
- Meng hersenen en het ruggenmerg met behulp van 15-ml Dounce homogenisator. Plaats een hersenen en het ruggenmerg in een homogenisator en voeg 5 ml 1X PBS. Voer 10-20 zachte stakingen; passeren homogenaat via mobiele zeef in 50 ml-conische buis en een certificaat bij 2000 toeren per minuut op een grote centrifuge 5-7 minuten.
- Gooi supernatant hersuspenderen hersenen / ruggenmerg homogenaat 2-3 muizen 5-7 ml 70% Percoll en overlay 7 ml 40% Percoll. Spin bij 2000 toeren per minuut (geen rem!) Gedurende 30 minuten.
- Gooi beschadigde cellen / myeline puin op een top van 70% en het verzamelen van mononucleaire cellen bij 40% / 70% interface. Verdun verzamelde cellen ten minste 1:1 met 1X PBS en draaien bij 2000 rpm 5-7 minuten. Resuspenderen cellen in 0,5 ml PBS en overbrengen in 1,7 ml ependorf buis. Typische opbrengst ~ 500 x 10 3 van mononucleaire cellen per muis, die het aantal microgliale cellen ~ 1x10 6 in 0,5 ml zou voor de bereiding van de cellen van hersenen en ruggenmerg 2-3 muizen.
2. Controle van Zuiverheid van microglia door middel van flowcytometrie
Kleuring met antilichamen wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven modificaties 7,8.
- Bereid FACS-buffer (PBS 1X met 2% FBS), FcR blokkerende antilichamen, anti-CD11b - PE, anti-CD45-APC-Cy7 antilichamen, 1% paraformaldehyde in PBS.
- Neem 50 pi cellen in stap 1.9 en overbrengen naar nieuwe 1,7 ml eppendorfbuisje en voeg 350 ul FACS-buffer.
- Voeg 5-10 ul van anti-FcR antilichamen en incubeer 10-15minuten op ijs.
- Splitsing cellen in twee eppendorfbuisjes. Voeg een buis 1 pi anti-CD11b - PE en 2 pi anti-CD45-APC-Cy7 antilichamen en 10-15 minuten incuberen op ijs. Tweede buis wordt gebruikt als negatieve controle voor antilichaam kleuring. Na incubatie met antilichamen 1 ml FACS-buffer aan beide buizen en draaien in kleine centrifuge bij 5400 rpm gedurende 5 minuten. Na het spinnen stellen de cellen te resuspenderen in 400 pi 1% paraformaldehyde in PBS en vortexen.
- Voer flowcytometrie analyse van flowcytometer (LSR II, BD Biosciences) met behulp van BD compubeads (BD Biosciences) tot schadevergoeding controles zoals beschreven 8. Voorbeelden van goede en slechte voorbereidingen worden getoond in Fig. 1a, b.
3. Isolatie van microglia en perifere Macrofagen uit Ontstoken CNS in muismodel van ontstekingsprocessen
Experimentele auto-immune encefalitis (EAE) wordt veroorzaakt zoals eerder werd beschrevenin onze papieren 7; FACS sortering is op dezelfde uitgevoerd om gepubliceerd protocol 8.
- Induceren EAE via subcutane immunisatie met 150 mg MOG 35-55 peptide in 4 mg / ml compleet Freund's adjuvans (CFA) van groep 5-10 van 8-12 weken oude C57BL / 6 muizen. Pertussistoxine worden gegeven ip (150 ng / muis) op dag nul en de tweede dag na de immunisatie. Muizen worden geobserveerd op tekenen van de ziekte te beginnen op dag 10 na immunisatie, en ernst van de ziekte wordt gescoord op een numerieke schaal van 0-5 als volgt: 0) geen ziekte; 1) zwakke staart of wankel lopen, 2) achterpoot parese; 3) achterpoot verlamming; 4) Hind en voorpoot verlamming, en 5) dood of euthanasie te wijten aan humane redenen. Muizen op het hoogtepunt van de ziekte (D21 post-immunisatie) worden gebruikt voor het experimenteren met typische ziekte score van 1,5 tot 2,5.
- Isoleer mononucleaire cellen van het CZS van de groep van 5-10 muizen als in de stappen 1.1-1.4 en vlekken op de cellen met anti-CD11b en anti-CD45 antilichamen zoals aangegeven in de stappen 2.1-2.4.In stap 2.4 niet oplossen cellen te resuspenderen in plaats ze in 400 ul PBS 1X plaats van 1% paraformaldehyde.
- Cel sorteren wordt uitgevoerd door FACSAria voor de populaties van CD11b + CD45 lage microglia en CD11b + CD45 hi cellen (~ 80% van hen zijn perifere macrofagen en ~ 20% van hen geactiveerde microglia 3; in de toekomst zullen we deze cellen verwijzen als " macrofagen "). Gebruik 1,7-ml ependorf buizen voor verzamelen van de monsters. 300 pi PBS 1X met 10% FBS worden toegevoegd aan de verzameling buizen beschadiging van de gesorteerde cellen te voorkomen. Voorbeelden van drie populaties van microglia, macrofagen en lymfocyten zijn in Fig. 2a met de juiste sortering poort instellingen die in Fig. 2b. Typische zuiverheid sorteren waren 98-100% zoals bepaald door reanalyzing gesorteerd populaties microglia (Fig. 2c) en macrofagen (Fig. 2d). Typische opbrengst 20-50 x10 3 voor microglia en50-100 x10 3 voor macrofagen geïsoleerd uit de groep van vijf muizen.
4. Isolatie van RNA
RNA wordt geïsoleerd met behulp van de Mirvana kit volgens de fabrikant met wijzigingen.
- Spin microglia van de normale CNS vanaf stap 1.9 of gesorteerd subsets van microglia en macrofagen vanaf stap 3,3 bij 1,7 ml Eppendorf-buisjes bij 5400 omwentelingen per minuut gedurende 5-7 minuten in kleine centrifuge, zorgvuldig weggooien supernatant en vries de cel pellets op droog ijs. Ga verder met stap 4.2 of bevroren celpellets te dragen tot -70 C, waar het kan worden opgeslagen voor 2-3 maanden.
- Overdracht bevroren celpellets regelmatig ijs ontdooien. Voeg 300 ul Lysis Buffer van Mirvana kit en meng door het pipetteren van 5-7 keer.
- Voeg 30 ul van homogenaat Additief uit Mirvana kit, vortex 30 seconden om te mixen, op ijs te houden gedurende 10 minuten
- Voeg 300 ul Zuur-Pehnol: Chloroform van Mirvana kit, vortex 30 seconden, spin voor 5 min bij 10.000 tpm kleine centrifuge.
- Voorzichtig te bovenstaande waterige fase (300 pi) en naar een andere 1,7 ml eppendorfbuisje mengen met 375 pi van 100% ethanol en transfer naar patroon filteren Mirvana kit en 1 min centrifugeren bij 10.000 tpm.
- Gooi doorstroom buffer toevoegen 700 pi wasoplossing I uit Mirvana kit en 1 min centrifugeren bij 10.000 tpm.
- Was twee keer met 500 pi wasoplossing II uit Mirvana kit en tenslotte RNA elueren van de cartridge met 60 pi voorverwarmde nuclease-vrij water.
- De hoeveelheid en de kwaliteit van het RNA wordt beoordeeld op basis NanoDrop spectrofotometer. De concentratie van RNA dient 5-20 ng / ml en OD λ260 / λ280 verhouding binnen het bereik 1,7-2,0. Wanneer de concentratie van RNA lager is dan 3 ng / ml en OD 260λ/280λ lager dan 1,6 worden de monsters verwijderd. RNA monsters worden opgeslagen bij -70 ° C gedurende 6-12 maanden.
- Voor verdere schatting van de kwaliteit van RNA, de monsters are geanalyseerd met gelelektroforese in 15% TBE-ureumgel (Life Technologies). Typische voorbeelden van goede en slechte kwaliteit van RNA preparaten in Fig. 3a en Afb.3b respectievelijk.
5. Detectie van miRNA in microglia en macrofagen
Voor de analyse van miRNA expressie, real-time kwantitatieve reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) analyses wordt uitgevoerd met behulp van TaqMan testen met primers en fluorescerende probes voor bepaalde microRNA van belang en een van de alomtegenwoordig uitgedrukt korte RNA's (bijv. snoRNA-55, snoRNA -135 of U6) voor normalisatie. Primers en fluorescerende probes voor bepaalde reeksen van menselijke of muis miRNA kunnen worden gekocht bij Life Technologies Inc Hier zullen we miR-124 gebruiken als een voorbeeld voor miRNA van rente en snoRNA-55 als voorbeeld voor normalisatie.
- Voer reverse transcriptase reactie om cDNA te maken van RNA-monsters met behulp van TaqMan reverse transcriptie kit:
| Item | Volume (pi) per monster |
| 5x RT Primer | 1,00 |
| RNA-monster | 1,67 |
| RT enzymmengsel | |
| 25 mM elk (100 mm totaal) dNTPs | 0,050 |
| MultiScribe reverse transcriptase) | 0,333 |
| 10X RT Buffer | 0,500 |
| AB RNase-remmer | 0,063 |
| Nuclease-vrij water | 1,388 |
| Totaal | 5,00 |
Verdun RNA monsters concentratie 3 ng / pl. Bereid RT enzymmengsel en zet 3,33 il van de PCR buizen en voeg 1,67 pl RNA monster. Incubeer in PCR Instrument (BioRad) bij 16 ° C30 min, 42 ° C gedurende 30 min, 85 ° C gedurende 5 minuten, en op 4 ° C wacht.
- Voer real-time PCR-reactie met behulp van TaqMan PCR-mix:
| Item | Volume (pi) per monster |
| RT product | 1,0 |
| 2X TaqMan Master Mix | 5,0 |
| 5X Probe | 2,0 |
| Nuclease-vrij water | 2,0 |
| Totaal | 10,0 |
Gebruik een 384-wells duidelijke optische reactie plaat (Life Technologies) voor elke reactie en real-time PCR-instrument AB 7900 HT. Fiets voorwaarden: 95 ° C gedurende 10 min [95 ° C gedurende 5 sec, 60 ° C gedurende 60 sec] x 40 cycli.
- Typische curves voor een bedrag van fluorescently label specifieke PCR-producten (y-as) voor snoRNA-55 en miR-124 RNA monsters (per monster in duplo) geïsoleerd uit microglia en beenmerg macrofagen (BMDMs) versus aantal cycli (x-as) worden Fig. 4a, b.
6. Normalisatie en data-analyse
Relatieve expressie voor miRNA van belang (miR-124) worden berekend volgens de methode ΔΔCT zoals eerder beschreven met behulp van 7,9 snoRNA-55 voor een normalisering van het oorspronkelijke bedrag van RNA.
- Het voorbeeld van berekening van de relatieve niveau van miR-124 uitdrukking voor microglia en BMDMs is weergegeven in tabel I.
- Als eerste stap worden de Ct-waarden voor snoRNA-55 en miR-124 bepaald voor microglia en BMDMs van qRT-PCR-curven (figuur 4, tabel I, kolommen: snoRNA-55 en miR-124).
- In een tweede fase, ΔCt waardenworden berekend voor elk duplicaat van elk monster door aftrekking van CT voor snoRNA-55 (normalisatie) van de CT voor miR-124 (experiment) (tabel I, kolommen: Ct (Norm), Ct (Exp) en ΔCt).
- Als derde stap. ΔΔCt waarden worden berekend door aftrek van ΔCt van de referentie-monster (ΔCt (Ref)) van ΔCt waarden van andere monsters (tabel I, kolom: ΔΔCt). Een monster wordt gedefinieerd als een referentie; het relatieve niveau van miRNAs voor dit monster worden gedefinieerd als 1.0. Alle andere monsters zullen worden vergeleken met deze referentie monster. In ons geval, bepalen we het niveau van miR-124 in de eerste steekproef voor microglia als 1.0, dus ΔCt (Ref) = 0,49 (tabel I, eerste rij, rood gemarkeerd).
- Tenslotte wordt het relatieve niveau van expressie berekend als 2-ΔΔCt (Tabel I, kolom: miR-124 eXpression).
- Alle qRT-PCR uitgevoerd in triplo of in duplo, de relatieve niveau van expressie wordt als gemiddelde ± standaardafwijking (SD) van triplo (Fig. 5a, b) of beide exemplaren met elkaar als getoond in Fig. 5c.
7. Representatieve resultaten
Typische curves voor real-time PCR en CT waarden miR-124 (microRNA of interest) en snoRNA-55 (normalisatie) en relatieve expressieniveaus van miR-124 in Fig. 4 en Tabel I. In onze experimenten gebruikt snoRNA-55 als controle voor normalisatie. Zoals hierboven vermeld, kunnen andere alomtegenwoordige RNA worden gebruikt voor de normalisering zoals snoRNA-135 en U6.
De voorbeelden van de expressie van miR-124 volwassen microglia tegen beenmerg verkregen macrofagen (BMDMs) worden getoond in Fig. 5a (BMDMs werden gekweekt in de presencinge M-CSF beschreven 7). In Fig. 5b, vergeleken we de uitdrukking van miR-124 in gesorteerde populaties van CD45 lage microglia ten opzichte van CD45 hi macrofagen. In beide experimenten hebben we aangetoond dat microglia anders zijn dan andere macrofagen met het uitspreken van een hoger niveau van miR-124. Soortgelijke experimenten worden uitgevoerd in de toekomst kinetiek van microglia activering in vivo of in vitro.
Expressie van miR-124 microglia geïsoleerd uit CNS van C57BL / 6 muizen in verschillende stadia van ontwikkeling in Fig. 5c. Deze gegevens tonen aan dat microglia in de vroege stadia van ontwikkeling uitdrukkelijke lagere niveaus van miR-124, die correleerden met hun geactiveerde fenotype 7. Vergelijkbare analyse kan worden uitgevoerd om de functies van de microglia in normale CZS zoals de vergelijking van de expressie van bepaalde miRNAs in microglia geïsoleerd uit verschillende gebieden van het CZS te bestuderen: het cerebellum, sPinal koord, hippocampus, etc.
Figuur 1. De voorbeelden van goede en slechte voorbereiding van microglia, zoals bepaald door flowcytometrie. In het geval van "goed" isolatie van microglia van normale CNS, 95-98% van de cellen vormen CD11b + CD45 lage microgla met 2-5% van CD11b + CD45 hi perivasculaire macrofagen. Minder dan 1% van CD11b - CD45 hi lymfocyten of CD11b - CD45 - astroglia of oligodendrogliale cellen of fragmenten aanwezig dient te zijn (a). Het geval van 'slechte' voorbereiding is hier te zien (b) waar 18% van besmetting van CD11b - CD45 - cellen aanwezig is (b, linksonder kwadrant) suggereert onvoldoende Percoll gradiënt scheiding. Bij goede bereiding te 95-98% van de cellen vertegenwoordigen CD11b + CD45lage microglia (a, linksboven kwadrant), moet 2-5% van alle cellen vertegenwoordigen CD11b + CD45 hi perivasculaire macrofagen (a, rechtsboven kwadrant), en minder dan 1% van alle cellen moet vertegenwoordigen CD11b negatieve contaminerende cellen (a, linksonder kwadrant). In het geval van "slecht preparaat" aanzienlijke verontreiniging van CD11b - CD45 - cellen of fragmenten (astroglia, myeline deeltjes enz.) aanwezig zijn (b, linker kwadrant), waardoor de bereiding van de cellen ongeschikt voor RNA-isolatie en verdere analyse. Bovendien CD11b - kan CD45 hi cellen ook in het geval van "slecht preparaat" (b, rechts kwadrant) waarin besmetting met lymfocyten door onvoldoende perfusie.
Figuur 2. Flowcytometrie analysis en sorteren van de bevolking van microglia en perifere macrofagen van zieke CNS (a) Tijdens neuroinflammatie drie populaties van de cellen aanwezig zijn in het centraal zenuwstelsel: CD11b + CD45 laag (microglia), CD11b + CD45 hi (macrofagen), en CD11b - CD45. hi (lymfocyten), zoals in de linker, rechtsboven en rechtsonder kwadranten respectievelijk. Poorten voor het sorteren populaties CD11b + CD45 laag microglia + CD45 en CD11b hi macrofagen getoond in (b) en opnieuw geanalyseerd zuiverheden van gesorteerde populaties wordt in (c, d). Voorlopige gating op levensvatbare cellen op basis van FSC / SSC parameters geïmplementeerd.
Figuur 3. Voorbeelden van "goede" en "slechte" qualits van RNA geïsoleerd uit microglia en geanalyseerd door gelelektroforese. Bij goede kwaliteit, RNA ladder ribosomaal RNA blijkt (a). Bij slechte kwaliteit, smeren, en laagmoleculaire afbraakproducten evident (b).
Figuur 4. Real-time qRT-PCR curves voor fluorescent gelabelde miR-124 en snoRNA-55 PCR-producten. Curves snoRNA-55 (a) en miR-124 (b) getoond microglia en beenmerg verkregen macrofagen (BMDMs). Het experiment werd uitgevoerd in duplo. Ct-waarden werden bepaald door het snijpunt van de basislijn van het onderste deel van lineaire bereik van qRT-PCR curven zoals weergegeven in (b). klik hier grotere figuur zien .
| snoRNA-55 | miR-124 | DCT = Ct (Exp)-Ct (Norm) | DDCT = DCT-DCT (Ref) | Relatieve niveau van expressie = 2-DDCT | |
| Ct (Norm) | Ct (Exp) | DCT | DDCT | miR-124 Expression | |
| Microglia van de normale CNS | 24.082 | 24.572 | 0,49 (Ref) | 0 | 1,0 |
| 23.766 | 24.291 | 0,525 | 0,035 | 1,02 | |
| Het beenmerg afgeleid macrofagen (BMDMs) | 26.879 | 320.231 | 5,352 | 5,317 | 0,025 |
| 26.526 | 32.078 | 5,552 | 5,517 | 0,022 |
Tabel I. Berekening van de relatieve niveaus van miR-124 expressie in microglia ten opzichte van beenmerg afgeleide macrofagen op basis van C t-waarden voor miR-124 (microRNA van belang) en snoRNA-55 (controle voor normalisatie).
Figuur 5. Analyse van miR-124 expressie in microglia en macrofagen. Vergelijking van miR-124 expressie in microglia van normale CNS tegen beenmerg macrofagen (BMDMs) wordt in (a). Vergelijking van miR-124 microglia tegen perifere macrofagen geïsoleerd uit CNS van muizen met neuroinflammatie wordt in (b). Veranderingen in deniveau van expressie van miR-124 microglia tijdens de ontwikkeling in muizen van 1, 2 en 4 weken oud opzichte van volwassen muizen (8 weken) wordt in (c). In (a, b) het experiment werd in drievoud uitgevoerd met een gemiddelde ± SD van drie afzonderlijke PCR-reacties weergegeven. In (c) uitgevoerd in duplo aangegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onlangs grote belangstelling werd gegeven aan microglia en de betrokkenheid van deze cellen in een groot aantal pathologieën geassocieerd met neuroinflammatie en neurodegeneratie. Daarnaast is de rol van microRNA's in de differentiatie van immuun-en kankercellen sterk gegroeid de afgelopen jaren 5,10. We hebben recent de rol van miR-124 in het onderhoud van niet-geactiveerde of rust-fenotype van microglia in normale CNS 7, maar de rol van de andere soorten van microRNA's in de microglia fenotype en activering staat nog ontdekt moet worden. Dit vereist de ontwikkeling van nieuwe methoden voor het meten van miRNA expressie in het bijzonder in microglia.
Microglia moeilijk cellen behandelen experimenten omdat zij geactiveerd en significant veranderd na de isolatie van CNS. De protocollen voor isolatie van microglia van de normale CNS werden eerder gepubliceerd 11,12. Hoewel deze protocollen Coulzou nuttig zijn voor RNA-isolatie, geloven we dat deze protocollen zijn meer geschikt voor mRNA-expressie in plaats van voor de beoordeling van microRNA expressie. Ten eerste, veel onderzoekers gebruik maken van enzymatische vertering van gehomogeniseerde weefsel of magnetische kraal zuivering dat microglia en resultaat te activeren in significante veranderingen in microRNA expressie (niet gepubliceerd observatie). Ten tweede, de auteurs gebruiken Trizol gebaseerde methoden voor RNA-isolatie 11 die niet optimaal is voor microRNA analyse in een klein aantal microgliale cellen, met name voor de populaties die werden gesorteerd uit CNS door FACS. Hier presenteren we een snelle en eenvoudig protocol met een minimum aan manipulaties tijdens de isolatie van microglia van het CZS. Deze methode maakt het ontvangen van zuivere populaties microglia met minimale hoeveelheden spontane activering gecombineerd met een techniek voor effectieve isolatie van RNA uit een klein aantal cellen. Daarnaast hebben we het gebruikte protocol voor de isolatie van RNA die met name zal worden verrijktmet korte niet-coderende RNA's en microRNA.
Naast de zuiverheid van geïsoleerde microglia is belangrijk ervoor te zorgen dat de kwaliteit van RNA geschikt is. Zonder goede scheiding van microglia de Percoll gradiënt het resultaat is de vervuiling van RNA monsters myeline vuil wat miRNA profilering zou in microglia niet alleen moeilijk te interpreteren, maar vermindert ook de kwaliteit van het RNA niet drastisch door een hoge concentratie van nucleïnezuren, eiwitten, lipiden in myeline deeltjes.
Zoals hierboven vermeld is een grote problemen meten miRNAs in microglia is het beperkte aantal cellen en kleine hoeveelheid RNA ook verkregen uit een grote groep muizen (10 of meer). Daarom zouden we raden het maken van een korte lijst van 10-30 microRNA's en kijk afzonderlijk op het niveau van expressie van elk van een met behulp van singleplex qRT-PCR in plaats van minder gevoelig multiplex-PCR-testen of arrays dievereisen een vrij grote hoeveelheid RNA. Na beoordeling van de expressie van verschillende microRNA's door singleplex qRT-PCR zoals we beschreven, konden andere grootschalige miRNA profilering methoden worden gebruikt na grondig validatie. Onlangs was er een rapport over een meer gevoelige methode voor multiplex analyse van microRNA's op microfluidics platforms 13, die zouden kunnen worden aangenomen voor grootschalige microRNA expressie profilering in de microglia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door de NIH R01 NS071039-01A1 onderzoek te verlenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b-PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
