Summary
小胶质细胞的居住提供第一线的防御和免疫监视中枢神经系统的巨噬细胞。 microRNA是调节分子，包括巨噬细胞的激活和分化的许多生理过程中发挥了重要作用。在这篇文章中，我们描述了在小胶质细胞的小分子RNA的测量方法。
Abstract
小胶质细胞是驻留在中枢神经系统（CNS）的髓系细胞。这些细胞中发挥了重要作用，在许多疾病的病理与神经发炎，如多发性硬化症（MS）2。在一个正常的中枢神经系统胶质细胞表达巨噬细胞标记CD11b和休息型，如活化标志CD45的表达水平低的表现。在中枢神经系统的病理事件中，成为激活小胶质细胞所确定的上调CD45和其他标记3。在中枢神经系统的小胶质细胞的表型和功能的影响因素没有得到很好的研究。小分子RNA（miRNAs）是一个保守分子（〜22个核苷酸长），在许多正常的生理过程，如细 胞生长和分化的4和5炎症等病症的越来越多的家庭。 miRNA的某些靶基因的表达下调的结合互补序列IR基因和发挥了重要作用，在激活先天免疫细胞，包括巨噬细胞和小胶质细胞7。为了调查定义的小胶质细胞的表型，生物功能，以区别于其他类型的巨噬细胞的小胶质细胞的miRNA介导的途径，它是重要的，特别是在居民中枢神经系统的胶质细胞不同亚群的microRNA表达定量评估。测量在中枢神经系统表达的miRNA的常用方法包括定量PCR技术，从整个神经组织和原位杂交。然而，从整个组织匀浆PCR定量不允许在小胶质细胞的miRNA表达的评估，这代表只有5-15％的神经组织的细胞。 原位杂交允许评估组织切片中的特定类型的细胞的microRNA表达，但这种方法是不完全定量。在这份报告中，我们描述了定量和SENSitive实时PCR检测中的小胶质细胞在正常的中枢神经系统或神经发炎使用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型，为MS分离miRNA的方法。所描述的方法将是有益的，在正常的中枢神经系统，或在与各种病症，包括MS，中风，跌打损伤，阿尔茨海默氏症和脑肿瘤相关的神经发炎的小胶质细胞的microRNA表达水平来衡量的。
Protocol
1。从正常中枢神经系统小胶质细胞的分离
小胶质细胞的分离以前修改3。
- 解剖和血流准备工具：剪刀，镊子，10毫升注射器27克针，15毫升Dounce匀浆（铁氟龙/玻璃），40微米尼龙细胞过滤器，40％和70％的Percoll方案，1×PBS。
- 安乐死小鼠CO 2的相机快窒息（缺氧），并立即转移，手术操作和灌注的实验台。
- 执行手术操作（用剪刀，镊子，70％的乙醇作为防腐剂）：打开腹腔，切开膈肌，打开胸腔，并用剪刀剪断右心房。
- 左心室注入10毫升的注射器和施加压力，进行心内灌注全身。通过血液循环，在缓慢而稳定的PA 8-10毫升的1X PBSCE。
- 组中的所有小鼠（通常5-10小鼠）重复步骤1.2-1.4。灌注后继续，直到所有的老鼠都灌注冰鼠标。
- 所有小鼠灌注后，解剖大脑和脊髓。 （可选：研究在大脑的不同区域的miRNA的表达，如小脑，海马等为5-10小鼠的同质化和池一起剖析这些具体领域）。
- 使用15毫升Dounce均质均质的大脑和脊髓。放置一个大脑和一个脊髓匀浆和添加5毫升的1X PBS。执行10-20温柔的罢工; 50 ML-锥形管和证书在2000年上一个大的离心5-7分钟的转速通过细胞过滤成匀浆。
- 弃上清，重悬2-3 5-7毫升70％的Percoll和覆盖7毫升40％的Percoll小鼠脑/脊髓匀浆。 30分钟旋转2000转（无刹车）。
- 放弃70％的顶部受损细胞/髓鞘碎片，并收集单核细胞在40％/ 70％的界面。至少在2000年5-7分钟转速1:1 1X PBS和自旋稀释收集细胞。在0.5毫升的PBS重悬细胞和转移到1.7毫升ependorf管。典型的产量是500×10单核细胞每鼠标，这将使准备从2-3小鼠的大脑和脊髓的细胞小胶质细胞的数量〜1×10 6 0.5毫升3。
2。控制小胶质细胞的纯度流式细胞仪
抗体染色进行修改7,8与先前描述。
- 准备缓冲流式细胞仪（1X与2％FBS，PBS），FCR封闭抗体，抗CD11b -体育，抗CD45 - APC-Cy7抗体在PBS，1％多聚甲醛。
- 采取步骤1.9中的细胞从50μl和他们转移到新的1.7毫升的Eppendorf管中，并添加350流式细胞仪缓冲液。
- 加入5-10μl和抗Fc受体抗体孵育10-15分钟在冰上。
- 分裂成两个Eppendorf管细胞。一管加入1μl的抗CD11b - PE和2μl抗CD45-APC-Cy7抗体，并在冰上孵育10-15分钟。第二条管道将被用来作为阴性对照抗体染色。抗体孵化后添加1毫升流式细胞仪缓冲管和自旋为5400 rpm离心5分钟。经过纺纱，解决他们的细胞重新悬浮于400μL的1％多聚甲醛PBS和涡旋。
- 流式细胞仪使用补偿控制BD compubeads（BD Biosciences公司）是8（LSR的二，BD Biosciences公司）执行流仪分析。 如图好和坏的筹备工作的例子。 1A，B。
3。在小鼠模型的神经发炎红肿中枢神经系统小胶质细胞和外周血巨噬细胞的分离
正如先前所描述的实验性自身免疫性脑炎（EAE）的诱导在我们的文件第7;流式细胞仪分选进行类似出版协议8。
- 8-12周龄C57BL / 6小鼠在4毫克/毫升完全弗氏佐剂（CFA）5-10组150毫克MOG 35-55肽诱导皮下免疫脑脊髓炎。百日咳毒素应给予天零和免疫后第二天，IP（150毫微克/鼠标）。小鼠观察疾病的免疫后10天开始的迹象，并取得了疾病的严重程度从0-5的数字规模如下：0）无病; 1）弱尾或步行摇晃; 2）后肢麻痹; 3）后肢瘫痪; 4）后肢和前肢瘫痪; 5）因人道原因死亡或安乐死。用于疾病具有典型的得分从1.5到2.5不等的实验小鼠在疾病高峰期（D21后免疫）。
- 从步骤1.1-1.4 5-10小鼠中枢神经系统中分离单核细胞和染色步骤2.1-2.4抗CD11b和抗CD45抗体的细胞。在步骤2.4不修复细胞，而不是他们悬浮在400μl1X PBS代替1％多聚甲醛的。
- FACSAria人口的CD11b + CD45的低的小胶质细胞和CD11b + CD45的喜细胞（〜80％的人是周边的巨噬细胞和〜20％，其中被激活小胶质细胞3;在未来，我们将把这些细胞是通过细胞分选“巨噬细胞“）。用于样品收集1.7毫升ependorf管的。 300 1X与10％FBS的PBS液应加入到收集管，以防止排序的细胞损伤。 如图三个群体小胶质细胞，巨噬细胞和淋巴细胞的例子。与适当的排序门设置， 如图2A。 2B。典型的排序纯度均在98-100％，重新分析排序人口的小胶质细胞（ 图2c）和巨噬细胞（ 图2d）确定。典型的产量是3 X10的小胶质细胞和20-503 50-100 X10从五鼠组分离的巨噬细胞。
4。 RNA提取
RNA会被孤立使用mirVana试剂盒，根据制造商的指示修改。
- 旋转小胶质细胞从正常的中枢神经系统从1.9步排序的子集或小胶质细胞和巨噬细胞在小离心5-7分钟5400转3.3 1.7毫升的Eppendorf管中一步，小心弃上清和细胞颗粒干冰冻结。继续加强4.2或冷冻细胞颗粒转移到-70℃，它可以储存2-3个月。
- 转让定期冰解冻冷冻细胞颗粒。 mirVana套件新增300μl裂解液的轻轻混合pipeting 5-7倍。
- 添加mirVana套件，涡旋30秒30的μl匀浆添加剂的混合，保持10分钟冰
- 加入氯仿300μL酸Pehnol：从mirVana套件，涡旋30秒，自旋5米在小离心机上10000转。
- 仔细考虑上层水相（300μL），并转移到另一个1.7毫升的Eppendorf管中，用375μl100％乙醇的混合，转移到过滤从mirVana试剂盒和自旋为1分钟10,000转的墨盒。
- 丢弃流通过缓冲区，添加700μl洗涤液我从mirVana套件，并在10,000 rpm的自旋为1分钟的。
- 500洗涤液微升II从mirVana套件洗超过两次，终于洗脱RNA 60μL预热无核酸酶水从墨盒。
- 的RNA的数量和质量进行评估，使用的NanoDrop分光光度计。 RNA的浓度应为5至20毫微克/毫升和外径λ260/λ2801.7-2.0范围内的比例。如果RNA浓度低于3 ng / ml的和260λ/280λ外径大于1.6低，样品将被丢弃。 RNA样品可存放于-70℃为6-12个月。
- 为进一步估计RNA，样品AR质量é分析，15％，简称TBE-尿素凝胶（Life Technologies公司）使用凝胶电泳。 如图的RNA制剂质量好和坏的典型例子。 3a和图3b分别。
5。在小胶质细胞和巨噬细胞的miRNA检测
分析miRNA的表达，实时定量逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR）分析进行了引物和荧光探针，为特定的microRNA的兴趣和广泛表达的短的RNA（如的snoRNA-55，snoRNA的使用TaqMan分析-135或U6）正常化。特别是集人类或小鼠的miRNA的引物和荧光探针，可以购买生命科技公司，在这里我们将用miR-124的snoRNA的利益和正常化的一个例子-55的miRNA的一个例子。
- 进行逆转录反应，使从RNA样品使用TaqMan反转录试剂盒基因：
| 项目 | 每个样品量（μl） |
| 5X RT引物 | 1.00 |
| RNA样品 | 1.67 |
| RT酶混合物 | |
| 25毫米（100毫米总）dNTPs浓度 | 0.050 |
| MultiScribe逆转录） | 0.333 |
| 10X逆转录缓冲器 | 0.500 |
| AB酶抑制剂 | 0.063 |
| 无核酸酶水 | 1.388 |
| 总 | 5.00 |
稀释浓度为3 ng /μl的RNA样品。准备逆转录酶混合物和3.33μL的PCR管和添加1.67μLRNA样品。在16°C孵育PCR仪（BioRad公司）30分钟，42℃30分钟，85℃为5分钟，在4°C间搁置。
- 执行实时PCR反应使用TaqMan PCR混合物：
| 项目 | 每个样品量（μl） |
| RT产品 | 1.0 |
| 2X的TaqMan预混 | 5.0 |
| 5X探头 | 2.0 |
| 无核酸酶水 | 2.0 |
| 总 | 10.0 |
使用384以及清晰的光学反应，每个反应和实时PCR仪AB 7900羟色胺板（生命技术）。循环条件：95°C为10分钟，95℃，5秒，60°，60秒D]×40次。
- 氟量的典型曲线rescently标记的特异性PCR产物的snoRNA-55和miR-124（Y轴），小胶质细胞和骨髓巨噬细胞（BMDMs）与周期数（X轴）分离RNA样品（每个样品一式两份） 如图。 4A，B。
6。正常化和数据分析
如前所述7,9使用snoRNA的初始金额的RNA正常化55ΔΔCT法计算miRNA的利息（MIR-124）的相对表达水平。
- 计算的相对水平的miR-124表达对小胶质细胞和BMDMs例如表一所示。
- 作为第一步，Ct值的snoRNA-55和miR-124被确定为小胶质细胞和BMDMs QRT-PCR曲线（ 图4;表一 ，列的snoRNA-55和miR-124）。
- 作为第二步，ΔCT值每个样品重复Ct的减法计算的miR-124（实验）（ 表，列：CT（规范），CT（EXP），和ΔCT）从CT的snoRNA-55（正常化）。
- 作为第三步。 ΔΔCT值计算减法ΔCT的参考样本（ΔCT（价））从其他样本（ 表一栏：ΔΔCT）ΔCT值。定义一个样本作为参考，将被定义为1.0的这个样品的miRNA表达的相对水平。相比其他所有样品将这个参考样本。在我们的例子中，我们定义为小胶质细胞的第一个样本为1.0 miR-124的水平，因此ΔCT（REF）= 0.49（ 表一 ，第一行，用红色标出）。
- 最后，相对表达水平的计算公式为2-ΔΔCT（ 表一栏：MIR-124éxPression可）。
- 所有定量RT-PCR的进行，在一式三份或重复，相对表达水平为平均±标准差（SD）的一式三份（ 图5A，B）或两个边重复边图所示。 5C。
7。代表结果
实时PCR和miR-124的CT值（microRNA的利益）的snoRNA-55（正常化）以及相对的miR-124表达水平的典型曲线图所示。 4和表。在我们的实验中，我们作为一个正常化的控制snoRNA的55。正如我们上面提到的，无处不在的RNA，可也用于snoRNA的135和U6如正常化。
如图表达的miR-124的成人小胶质细胞与骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMs）的例子。 5A（BMDMs增长的presencE为M-CSF的描述7）。 图。 5B，我们比较在人口排序的CD45 低的小胶质细胞与CD45的喜巨噬细胞的miR-124的表达。我们在这两个实验证明，小胶质细胞是从其他的巨噬细胞表达的miR-124的更高水平的不同。在未来可以进行类似的实验，小胶质细胞在体内或体外激活动力学。
如图表达的miR-124的小胶质细胞的C57BL / 6小鼠在不同发展阶段的中枢神经系统中分离。 5C。这一数据表明，在发展快递低miR-124的水平，这与他们的活化型7相关的早期阶段，小胶质细胞。可以进行类似的分析，研究小胶质细胞分离的中枢神经系统的不同领域特别是在小胶质细胞miRNA的表达比较正常，如中枢神经系统的功能：小脑的皮纳尔线，海马等。
图1。好的和坏的小胶质细胞通过流式细胞仪检测的准备的例子。在“好”的小胶质细胞脱离正常的中枢神经系统的情况下，代表95-98％的细胞CD11b的2-5％的CD11b + CD45 低 microgla的+ CD45的喜血管周围巨噬细胞。应该小于1％的CD11b -您好 CD45的淋巴细胞或细胞CD11b - CD45的-星形胶质细胞，少突胶质细胞或细胞碎片（ 一 ）。 （b）在18％的污染细胞CD11b - CD45的-细胞是（B，左下象限），建议Percoll梯度分离不足，这里的“坏”的筹备情况。在做好准备的情况下，有95-98％的细胞应该代表细胞CD11b + CD45低，小胶质细胞（A，左上象限），应代表所有细胞的2-5％细胞CD11b + CD45的喜 （血管周围巨噬细胞，右上象限），并应代表所有细胞的不到1％CD11b的负面污染细胞（ 一 ，左下象限）。在“坏的准备”的情况下，重大污染的CD11b - CD45的-细胞或细胞碎片（星形胶质细胞，髓鞘颗粒等）（B，左下象限），这使得细胞RNA分离，并进一步不适宜做准备分析。此外，CD11b的- CD45的喜细胞可能在“坏的准备”的情况下也存在（B，右下象限），说明由于不足灌注血液淋巴细胞的污染。
图2。流量仪analysi和小胶质细胞和外周血巨噬细胞数量排序（ 一 ）在发炎反应的细胞群体是存在于中枢神经系统病变的中枢神经系统细胞CD11b + CD45 低 （ 小胶质细胞 ）， 细胞CD11b + CD45的喜 （ 巨噬细胞 ）， 和 CD11b - CD45; 您好 （ 淋巴细胞 ），分别显示在左上角，右上角和右下角的象限。 + CD45的喜巨噬细胞CD11b + CD45的低小胶质细胞和CD11b排序人口盖茨（b）和重新分析排序种群的纯度（C，D）所示。实现对活细胞的初步门，FSC / SSC参数。
图3。 “好”与“坏”qualit范例在质量良好的情况下，RNA的RNA分离和小胶质细胞凝胶电泳分析IES。梯子和核糖体RNA是显而易见的（ 一 ）。在质量差，涂抹，低分子量降解产物是显而易见的（B）。
图4。实时定量RT-PCR扩增曲线荧光标记的miR-124的snoRNA-55的PCR产物。的snoRNA-55（A）和miR-124（B）曲线显示小胶质细胞和骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMs）。实验是在重复。 Ct值由下部的线性范围QRT-PCR的基线的交点决定的曲线在（b）所示。 点击这里查看大图 。
| snoRNA的-55 | miR-124的 | DCT = CT（EXP）-CT（范） | DDCT = DCT-DCT（REF） | 表达的相对水平= 2-DDCT | |
| CT（范） | CT（EXP） | DCT | DDCT | 的miR-124表达 | |
| 小胶质细胞从正常的中枢神经系统 | 24.082 | 24.572 | 0.49（参考） | 0 | 1.0 |
| 23.766 | 24.291 | 0.525 | 0.035 | 1.02 | |
| 骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMs） | 26.879 | 320.231 | 5.352 | 5.317 | 0.025 |
| 26.526 | 32.078 | 5.552 | 5.517 | 0.022 |
相对水平的miR-124表达在小胶质细胞与骨髓巨噬细胞C T值的miR-124（microRNA的利益）和snoRNA的55（控制正常化）根据表一计算。
图5。分析的miR-124在小胶质细胞和巨噬细胞中的表达。比较小胶质细胞的miR-124表达从正常的中枢神经系统对骨髓巨噬细胞（BMDMs）在（a）所示。在小胶质细胞与神经发炎小鼠中枢神经系统分离外周血巨噬细胞中的miR-124的比较（b）中所示。在变化（c）中所示1，2和4周龄小鼠发育过程中表达在小胶质细胞中的miR-124相比，成年小鼠（8周龄）时的水平。 （A，B）实验进行一式三份平均±3个独立的PCR反应SD显示。 （三）在实验进行重复表示。
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Discussion
最近显着的利益，考虑到小胶质细胞，这些细胞参与神经发炎和神经退行性疾病相关的许多病症。此外，在免疫系统和癌细胞分化的microRNA的作用显着增长在过去几年5,10。在非激活或休息的小胶质细胞的表型，在7正常的中枢神经系统的维护，我们曾报道了miR-124的作用，但其他类型的小分子RNA在小胶质细胞的表型和激活状态的作用仍然被发现。这将需要开发专门测量中的小胶质细胞的miRNA表达的新方法。
小胶质细胞是很难的细胞在实验处理，因为它们成为激活后，他们从中枢神经系统的隔离显著改变。小胶质细胞脱离正常的中枢神经系统的协议原样11,12。虽然这些协议可以变成D是RNA提取有用的，我们认为，这些协议是更适合mRNA的表达，而不是评估microRNA表达。首先，许多研究者使用酶解均质组织或磁珠纯化microRNA表达显着变化，激活小胶质细胞和结果（未发表观察）。二，使用Trizol法为基础的方法，这不是最佳的microRNA分析中的小胶质细胞，尤其是对于那些人口排序由流式细胞仪的中枢神经系统，少数为RNA分离11。在这里，我们提出在隔离CNS小胶质细胞与最小操纵的快速和简单的协议。这种方法允许接受最低水平，从少数细胞的RNA有效隔离技术相结合的自发激活的小胶质细胞纯种群。此外，我们用于RNA分离的协议，将特别丰富短的非编码RNA和microRNA。
除了孤立的小胶质细胞的纯度，也很重要，以确保RNA的质量是合适的。没有适当的小胶质细胞Percoll梯度分离的结果是髓鞘碎片污染的RNA样品，这将使在小胶质细胞的miRNA谱不仅难以解释，但也大幅降低RNA的质量，而不是由于高浓度的核酸，蛋白质，脂质髓鞘颗粒。
正如我们上面提到的，在测量中的小胶质细胞的miRNA表达的实质困难是少数甚至从大的小鼠组（10个或更多）获得的RNA的细胞和低量。因此，我们建议的10-30小分子RNA的短名单，并期待在每一个使用单一定量RT-PCR技术，而表达水平分别比使用较不敏感的多重PCR或阵列需要的RNA量相当高。我们描述由单一QRT-PCR的几个小分子RNA表达的评估后，其他大型的miRNA分析方法可用于后，他们仔细验证。最近，有一个更敏感的多重微流体平台13，这可能被采用大规模的microRNA在小胶质细胞的基因表达谱分析microRNA的方法报告。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院以R01 NS071039-01A1研究资助支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b-PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L.
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P.
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
