Summary
Interstitielle Fluidstrom wird in soliden Tumoren erhöht und modulieren kann Tumorzellinvasion. Hier beschreiben wir eine Technik, um interstitielle Flüssigkeit fließen, um Zellen in einer Matrix eingebettet zu bringen und dann die seine Auswirkungen auf Zellinvasion. Diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Systeme zu studieren.
Abstract
Das Wachstum und die Progression der meisten soliden Tumoren sind abhängig von der anfänglichen Transformation der Krebszellen und ihre Reaktion auf Stroma-assoziierten Signalmoleküle in der Tumor-Mikroumgebung 1. Bisher hat die Forschung auf die Tumor-Mikroumgebung in erster Linie auf die Tumor-Stroma-Interaktionen 2.1 konzentriert. Allerdings ist die Tumor-Mikroumgebung auch eine Vielzahl von biophysikalischen Kräfte, deren Wirkungen noch wenig verstanden. Diese Kräfte sind biomechanischen Folgen des Tumorwachstums, die zu Veränderungen in der Genexpression, Zellteilung, Differenzierung und Invasion 3 führen. Dichte-Matrix 4, Steifigkeit 5-6, 6-7 und Struktur, interstitielle Flüssigkeitsdruck 8, und der interstitiellen Flüssigkeit fließen 8 sind alle während der Tumorprogression verändert.
Interstitielle Fluidströmung insbesondere eine höhere Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe 8-10. Die geschätzte interstitiellen Flüssigkeit flow Geschwindigkeiten wurden gemessen und in dem Bereich von 0,1-3 um s -1, je nach Größe des Tumors und Differenzierung 9, 11. Dies ist aufgrund des erhöhten interstitiellen Druckes mit Tumor-induzierte Angiogenese und erhöhte Gefäßpermeabilität 12 hervorgerufen wird. Interstitielle Fluidströmung hat sich gezeigt, um das Eindringen von Krebszellen 13-14, vaskulären Fibroblasten und glatten Muskelzellen 15 erhöht wird. Dieses Eindringen kann auf autologen chemotaktische Gradienten um Zellen in 3-D 16 erzeugt oder erhöht Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Expression 15, Chemokin Sekretion und Expression Zelladhäsionsmolekül 17. Jedoch ist der Mechanismus, durch den Zellen zu erfassen Fluidströmung nicht gut verstanden. Zusätzlich zu verändern Tumorzelle Verhalten moduliert interstitiellen Flüssigkeit fließen die Aktivität anderer Zellen in der Tumor-Mikroumgebung. Es ist mit (a) Fahren Differenzierung von Fibroblasten in tumorpromovierenden myofibr verbundenoblasts 18, (b) Transportieren von Antigenen und anderen löslichen Faktoren in Lymphknoten 19, und (c) Modulieren lymphatischen Endothelzellen Morphogenese 20.
Die hier vorgestellte Technik auferlegt interstitiellen Flüssigkeit fließen auf Zellen in vitro und quantifiziert deren Auswirkungen auf Invasion (Abbildung 1). Diese Methode wurde in mehreren Studien veröffentlicht worden, um die Auswirkungen der Strömung auf Stroma und die Invasion von Krebszellen 13-15, 17 zu messen. Durch Ändern der Matrix-Zusammensetzung, dem Zelltyp, und Zellkonzentration, kann dieses Verfahren auf andere Krankheiten und physiologische Systeme angewendet werden, um die Auswirkungen der interstitiellen Strömung auf zellulärer Prozesse, wie Invasion, Differenzierung, Proliferation und die Genexpression zu untersuchen.
Protocol
1. Assay Set-up
- Auftauen einer kleinen aliquoten (<500 ul) von Matrigel auf Eis bei 4 ° C (etwa 2 Stunden).
- Bereiten Sie Gel-Rezeptur (siehe Beispiel Volumina in Tabelle unten): 10x PBS (1x im Gesamtvolumen), 1 N Natronlauge (entspricht 0,023 Bände hinzugefügt Kollagen, respektive dem Kollagen den Empfehlungen des Herstellers, soweit erforderlich), geben Sie Matrigel und Kollagen I zu Endkonzentrationen von 1 mg / ml und 1,3 mg / ml (andere Matrix-Formulierungen verwendet werden, je nach Zelltyp und Experiment werden).
Beispiel Gel-Rezeptur
| Komponenten | Stoffkonzentration | Endkonzentration | Fügen Volumen |
| 10X PBS | 10X | 1X | 0,090 ml |
| Steriles Wasser | 0,346 ml | ||
| 1 N NaOH | 0,008 ml | ||
| Matrigel | 9,90 mg / ml | 1 mg / ml | 0,101 ml |
| Rattenschwanz Kollagen Typ I | 3,66 mg / ml | 1,3 mg / ml | 0,355 ml |
- Mischen Komponenten des Gels auf Eis in der gleichen Reihenfolge wie oben und inkubieren endgültige Lösung für 1 Stunde bei 4 ° C Nach unserer Erfahrung, eine 1-stündigen Inkubation vor dem Aussähen der Zellen führt zu einer gleichmäßigeren Gelierung des Kollagens. Achten Sie darauf, Matrigel und Kollagen auf Eis halten zu allen Zeiten und an so schnell wie möglich arbeiten, um die Gelierung zu verhindern.
- Platz 12 mm Durchmesser 8 um Pore Zellkultur-Inserts in eine 12-Well-Platte mit einer sterilisierten Pinzette.
- Zählen von Zellen und Resuspendieren in serumfreiem Medium bei 5 × 10 6 Zellen / ml (Gesamtvolumen sollte 10% des Gel-Lösung).
- Geben Sie 100 ul Zell-suspension zu 900 ul Gel-Lösung (Endzellkonzentration 5 x 10 5 Zellen / ml) mischen und gründlich durch Pipettieren vorsichtig nach oben und unten.
- Fügen Sie 150 ul der fertigen Mischung für jeden Einsatz und Transfer zu einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für 30 Minuten, bis Gel polymerisiert.
- Mit Serum-freien Medien,
- Geben Sie 100 ul oben auf dem Gel und 1200 ul unter dem Einsatz für den statischen Zustand. Die Flüssigkeitsstand im Inneren des Einsatzes und außen in der auch etwa gleich sein sollte, was zu einer minimalen Druckdifferenz über dem Gel und ohne interstitielle Strömung.
- Geben Sie 100 ul unter dem Einsatz und 650 ul oben Gel für den Strömungszustand. Seien Sie vorsichtig, um mögliche Luftblasen unterhalb des Einsatzes zu vermeiden, da diese Zellen, die aus der Migration durch die Membran an diesen Standorten zu verhindern. Die Druckdifferenz, die dieses Volumen erzeugt wird, ungefähr 1,3 cm H 2 O (oder 1 mm Hg).
- Legen Sie die Platte in einem 37° C, 5% CO 2-Inkubator für 24 Stunden.
2. Zellfärbung und Zählen
- Fügen Sie 500 ul 1X PBS pro Vertiefung in neue 24-Well-Platte, das wird benutzt, um die Einsätze zu waschen.
- Entfernen des Mediums restlichen in dem oberen Abschnitt der Strömung Transwells und die Lautstärke festzulegen. Berechnen Sie insgesamt eluierten Volumen durch Subtraktion des verbleibenden Volumens aus dem Gesamtvolumen ursprünglich aufgenommen, 650 ul (dies wird für Durchfluss Berechnungen verwendet werden, siehe unten). Wattestäbchen, um das Gel aus den Einsätzen zu entfernen und um die obere Oberfläche der Membran Wischtuch nicht befallenen Zellen zu entfernen. Legen Sie die Einsätze in den 24-Well-Platte mit 1X PBS für 15 s, um Einsätze zu waschen.
- PBS entfernen und hinzufügen 500 ul von 4% Paraformaldehyd (PFA) unter jedem Einsatz, Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die transmigrierten Zellen zu fixieren.
- Entfernen Sie die PFA und spülen Sie einmal mit 500 ul 1X PBS, um restliches Fixativ entfernen.
- Fügen Sie 500 ul of 0,5% Triton X-100-Lösung unter den Einsätzen und inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu permeabilisieren.
- Schneiden Sie aus Membranen des Einsatzes mit einer Rasierklinge und Ort in 100 ul 2 pg / ml DAPI in 1X PBS-Lösung, wobei darauf geachtet, um die Unterseite der Membran der Vorderseite nach unten platzieren (transmigrierten Zellen nach unten).
- Wrap Platte in Alufolie nehmen und auf einem Schüttler bei 150 rpm für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie Membranen in 500 ul 1X PBS auf Schüttler (3 Mal wiederholen für jeweils 10 Minuten), um freie DAPI zu entfernen.
- Ort Membranen auf Glasplättchen mit transmigrierten Zellen nach oben, fügen Montagelösung und Deckglas.
3. Datenanalyse
- Count DAPI-gefärbten Zellkernen auf 5 zufällig ausgewählten Standorten jeder Membran (bleiben Sie weg von den Rändern und verwenden Sie einen 10x-oder 20x Objektiv).
- Berechnen des Durchschnitts-Zellen und erhalten die prozentuale Invasion durch Verwendung der folgenden Formel:
Invasion Prozent = 100% x (durchschnittliche Zellzahl x Membranfläche) / (Fläche des mikroskopischen Bildes x Anzahl der Zellen seeded)
Die Invasion Prozent bis zu einem gewissen Kontrollbedingung (in der Regel der statische Zustand) um einen Vergleich zwischen unabhängigen Experimenten ermöglichen normalisiert werden. - Berechnen der durchschnittlichen Fließgeschwindigkeit: Die Gesamthöhe eluierte Volumen in der Strömungszustand von der Inkubationszeit (z. B. 24 Stunden).
- Berechnen Sie die mittlere Fließgeschwindigkeit: Teilen Sie die mittlere Strömungsgeschwindigkeit durch die Querschnittsfläche des Gels / Membran (in diesem Fall 60 mm 2).
4. Repräsentative Ergebnisse
Um Tumorzellinvasion unter interstitielle Strömung zu messen, führten wir unsere 3-D-Flow Invasion Assay unter Verwendung von MDA-MB-435S metastasierendem Melanom-Zellen. Diese Zellen haben früher gezeigt, dass in Reaktion auf interstitielle Fluidströmung 13-14 einzudringen. Die Zellen wurden in einer Matrix von 1,3 mg / ml Ratten-tai aus eingebettetenl Sehne Kollagen Typ I und 1 mg / ml Matrigel Basalmembran-Matrix in einer endgültigen Zellkonzentration von 5 x 10 5 Zellen / ml. Zwei verschiedene Bedingungen wurden verglichen: (1) Durchschnitt interstitielle flow = 0,1 &mgr; s -1 und (2) statischen Zustand = keine messbare Durchfluss (Abbildung 1).
Nach 24 Stunden wurden die Zellen, die durch die Poren der Membran eingedrungen mit DAPI gefärbt die Zellzählung erleichtern. 2 zeigt ein repräsentatives Bild der befallenen Zellen. Unter Hellfeld, sind nur die Poren der Membran sichtbar. Fluoreszenz-, die DAPI-gefärbten Nuklei wurden zum Zählen von Zellen und die Phalloidin gefärbt F-Aktin-Strukturen wurden verwendet, um die Zellkörper (optional) zu visualisieren. Mit Hilfe eines Student-t-Test unter Annahme gleicher Varianzen haben wir gezeigt, dass interstitielle Flow signifikant erhöht MDA-MB-435S Zellinvasion von 2,3-fache gegenüber der statischen Bedingungen (p = 0,003) (Abbildung 3). Diese corroborates zu ähnlichen Ergebnissen (aber mit unterschiedlichen Matrix-Bedingungen und sind daher Strömungsgeschwindigkeiten) mit dieser Zelllinie 13-14.
1. Schematische Darstellung der 3-D-interstitiellen Fluidströmung Invasionshemmtest. Bereiten Sie zuerst Gel-Lösung unter Verwendung von geeigneten Konzentrationen und Volumina. Dann fügen Sie Zellen auf Gel-Lösung und Transfer zum Zellkultur-Inserts. Schließlich fügen Sie entsprechende Volumen von Medien auf jede Bedingung und inkubieren. Interstitielle Flüssigkeit fließt durch einen Fluiddruck Kopf getrieben.
2. Transmigrierten MDA-MB-435S-Zellen auf der Membran. A) Bild von der Membran unter Hellfeld;; befallenen Zellen wurden nach unserer interstitiellen Flüssigkeit fließen Invasion Assay und mit DAPI gefärbt und Alexa Fluor 488-Phalloidin zu erleichtern Zählen der befallenen Zellen fixiert B) DAPI staINED Zellkerne (blau); C) Alexa Fluor 488-Phalloidin angefärbt F-Aktin (in grün). Maßstabsbalken repräsentiert 50 um.
Abbildung 3. Erhöhte Invasion von MDA-MB-435S-Zellen unter Strom. Zellinvasion nach 24 Stunden deutlich durch interstitielle flow (p = 0,003) verbessert. Die Ergebnisse sind der Durchschnitt statischen Zustand normalisiert und Werte repräsentieren den Mittelwert ± SEM von 6 Zellkultur-Inserts.
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Discussion
Hier haben wir eine Methodik zur Quantifizierung der Wirkung der Strömung auf interstitielle Tumorzellinvasion, unter Verwendung von Zellen in einem 3-D-Matrix in einer Zellkultureinsatzes eingebetteten beschrieben. Diese und ähnliche Verfahren sind verwendet worden, um die Wirkung der interstitiellen Strömung auf einer Vielzahl von Zelltypen 13-15, 17 studierst. Unser Ansatz teilweise imitiert die Matrix Mikroumgebung des Tumors mit Kollagen Typ I und Matrigel, die Proteine in der Basalmembran von Epithelgewebe und dem umgebenden Stroma 21-22 gefunden enthalten. Dieses System ist relativ einfach zu Set-up, einfach und kostengünstiger als die meisten anderen mikrofluidischen Bauteilen, die zur interstitiellen Flüssigkeit fließen in vitro 23-24 studieren werden. Es benötigt keine Pumpen oder spezielle Ausrüstungen und ermöglicht mehrere Bedingungen gleichzeitig getestet werden. Darüber hinaus sind die Messungen, die denen der Boyden-Kammer vorhandenen Assays häufig verwendet, um Invasion und Migration zu testention von Krebszellen.
Durch Ändern der Zelltyp und die Zusammensetzung der Matrix kann verschiedene biologische Systeme modelliert werden, wie Brustkrebs 13, Blutgefäße 15 und dendritischen Zell-Trafficking 17. Veränderung der Matrix Eigenschaften und der Zusammensetzung und die Modulation der Förderhöhe ändert sich auch die interstitiellen Flüssigkeit Fließgeschwindigkeit und damit die Flexibilität bei der Assay-Parameter in Abhängigkeit von der biologischen Systems von Interesse. Dieses System kann auch in Co-Kultur-Assays verwendet werden. 14, 17
Zusätzlich zur Messung der Invasion bezeichnete der interstitiellen Flüssigkeit Flow Assays hier könnte erweitert werden, um Veränderungen in der anderen Zelle Verhaltensweisen wie Proteinexpression, Zellproliferation und Unterschiede in der Zelle Signalwege zu messen. Die Zellen können einfach direkt aus dem Gel für RNA, DNA und Protein-Extraktion isoliert werden und für nachfolgende Molekularbiologie Assays, wie PCR und Westernauslöschen. Dies ist ein sehr flexibles Assay, der einfach aufgebaut werden kann und geeignet ist, die Auswirkungen der interstitiellen Strömung an einer Reihe von zellulären Prozessen in einer Reihe von Zellsystemen zu untersuchen.
Einer der wesentlichen Nachteile dieses Tests ist die Tatsache, dass die Fließgeschwindigkeiten sehr abhängig von Matrix Konzentration. Strömungsgeschwindigkeit erhöht als Matrigel Konzentration abnimmt. Dies bedeutet, dass eine Matrix, die ausschließlich aus Kollagen, die in der Studie von Stroma zugehörigen Zellen verwendet werden können, werden höhere Strömungsgeschwindigkeiten (> 1 um s -1) als eine hauptsächlich aus Matrigel (<0,05 um s -1) haben eine gegebene Druckdifferenz. Wenn eine bestimmte Strömungsgeschwindigkeit erforderlich ist, kann man zuerst eine erste Prüfung, die Matrixzusammensetzung, die die gewünschte Strömungsgeschwindigkeit bietet identifizieren. Die Dicke des Gels variiert werden, um die Strömungsgeschwindigkeit einzustellen. Der Test auch nicht für Live Cell Imaging, wo das Verhalten einzelner Zellen ermöglichen eined Veränderungen in der Geschwindigkeit und Ausrichtung gemessen werden kann. Stattdessen wird mit diesem Assay einen Endpunkt Messung von Veränderungen in der Invasion in einer Population von Zellen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
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