Summary
Interstitiële vloeistof stroom wordt verhoogd in solide tumoren en kan moduleren tumorcel invasie. Hier beschrijven een techniek interstitiële fluïdumstroming toepassing cellen ingebed in een matrix en meet de gevolgen celinvasie. Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast aan andere te bestuderen.
Abstract
De groei en progressie van solide tumoren meest afhangen van de eerste transformatie van de kankercellen en hun reactie op stroma-geassocieerde signalering in de tumor micro 1. Eerder heeft onderzoek gedaan naar de tumor micro-omgeving zich vooral gericht op de tumor-stroma interacties 1-2. Echter, de tumor micro-omgeving omvat ook een aantal biofysische krachten, waarvan de gevolgen nog steeds slecht begrepen. Deze krachten zijn biomechanische gevolgen van de groei van tumoren die leiden tot veranderingen in genexpressie, celdeling, differentiatie en invasie 3. Matrix dichtheid 4, stijfheid 5-6, en de structuur 6-7, interstitiële vloeistofdruk 8, en interstitiële vloeistofstroming 8 zijn allemaal veranderen tijdens de voortgang van kanker.
Interstitiële fluïdumstroom in het bijzonder hoger in tumoren ten opzichte van normale weefsels 8-10. De geschatte interstitiële vloeistof flow snelheden werden gemeten en in het gebied van 0,1-3 um en -1, afhankelijk tumorgrootte en differentiatie 9, 11. Dit is te wijten aan hoge interstitiële druk door tumor geïnduceerde angiogenèse-en verhoogde vasculaire permeabiliteit 12. Interstitiale fluïdum debiet is aangetoond invasie van kankercellen 13-14 vasculaire fibroblasten en gladde spiercellen 15 verhogen. Dit invasie kan het gevolg autologe chemotactische gradiënten die rond cellen 3-D 16 of meer matrix metalloproteinase (MMP) expressie 15 chemokine secretie en cell adhesion molecule expressie 17. Echter, het mechanisme waardoor cellen voelen stroming niet goed begrepen. Naast het veranderen van het gedrag van tumorcellen, interstitiële vloeistofstroming moduleert de werking van andere cellen in de tumor micro-omgeving. Het is gekoppeld met (een) rijden differentiatie van fibroblasten in tumor-bevorderende myofibroblasts 18 (b) transporteren van antigenen en andere oplosbare factoren lymfeknopen 19 en (c) moduleren lymfatische endotheelcellen morfogenese 20.
De techniek die hier stelt interstitiële vloeistofstroom op cellen in vitro en kwantificeert het effect ervan op invasie (figuur 1). Deze methode is gepubliceerd in meerdere studies het effect van de vloeistofstroom meten stromale en kankercel invasie 13-15, 17. Door de matrixsamenstelling, celtype en celconcentratie Deze methode kan worden toegepast op andere ziekten en fysiologische systemen om de effecten van interstitiële stroom bestuderen op cellulaire processen zoals invasie, differentiatie, proliferatie en genexpressie.
Protocol
1. Test Set-up
- Dooi een kleine hoeveelheid (<500 ul) van Matrigel op ijs bij 4 ° C (ongeveer 2 uur).
- Bereid gel recept (zie voorbeeld volumes in onderstaande tabel): 10 x PBS (1x in het totale volume), 1 N natriumhydroxide (gelijk aan 0.023 volumes van toegevoegde collageen, of per het collageen aanbevelingen van de fabrikant, indien van toepassing), Matrigel en collageen type I tot en met eindconcentraties van 1 mg / ml en 1,3 mg / ml (andere matrix formuleringen kunnen worden afhankelijk van celtype en experiment).
Voorbeeld gel recept
| Componenten | Stock Concentratie | Eindconcentratie | Voeg volume |
| 10X PBS | 10X | 1X | 0.090 ml |
| Steriel water | 0.346 ml | ||
| 1N NaOH | 0.008 ml | ||
| Matrigel | 9,90 mg / ml | 1 mg / ml | 0.101 ml |
| Rat staart type I collageen | 3,66 mg / ml | 1,3 mg / ml | 0.355 ml |
- Meng componenten van de gel op ijs in dezelfde volgorde als hierboven incubeer uiteindelijke oplossing gedurende 1 uur bij 4 ° C. In onze ervaring van 1 uur incubatie voor cel zaaien resulteert in een meer uniform gelering van het collageen. Zorg ervoor dat u Matrigel en collageen te houden op het ijs te allen tijde en om zo snel mogelijk werken om gelering te voorkomen.
- Place 12 mm diameter 8 urn poriën celkweek voegt in een 12-wells plaat met een steriele tang.
- Tel cellen en hersuspenderen in serum-vrij medium met 5 x 10 6 cellen / ml (totaal volume te 10% van de gel oplossing).
- Voeg 100 ul van de cel suspension tot 900 ul van gel-oplossing (laatste cel concentratie 5 x 10 5 cellen / ml) en meng goed door pipetteren lichtjes op en neer.
- Voeg 150 pi van het uiteindelijke mengsel elk inzetstuk overgebracht in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 30 minuten tot gel polymeriseert.
- Met behulp van serum-vrije media,
- Voeg 100 ul boven de gel en 1200 pi onder het inzetstuk voor het statische toestand. De vloeistof niveau binnen het inzetstuk en buiten de put is ongeveer gelijk er nauwelijks drukverschil over de gel en niet interstitiële stromen.
- Voeg 100 ul onder de insert en 650 ul boven gel voor de doorstroming. Wees voorzichtig om eventuele luchtbellen onder de insert te vermijden, want zij zullen cellen voorkomen migreren door het membraan op deze locaties. Het drukverschil die door deze volumes ongeveer 1,3 cm H2O (of 1 mm Hg).
- Plaats plaat in een 37° C, 5% CO2 incubator gedurende 24 uur.
2. Cel Beitsen en tellen
- Voeg 500 ul van PBS per putje 1X in nieuwe 24-wells plaat, die wordt gebruikt om de inzetstukken te wassen.
- Verwijder het medium nog in het bovenste gedeelte van de stroom transwells en bepalen van het volume. Bereken de totale volume geëlueerd door aftrekken van de resterende hoeveelheid van het totale volume oorspronkelijk toegevoegde, 650 pi (dit wordt gebruikt debiet berekeningen, zie hieronder). Gebruik wattenstaafje de gel uit de inzetstukken en het bovenvlak van het membraan vegen niet-invasie cellen te verwijderen. Plaats de inserts in de 24-wells plaat met 1X PBS gedurende 15 s om inserts te wassen.
- Verwijder PBS en voeg 500 pi 4% paraformaldehyde (PFA) onder ieder inzetstuk en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om het transmigrated cellen vast te stellen.
- Verwijder de PFA en spoel een keer met 500 ul 1X PBS om de resterende fixeermiddel te verwijderen.
- Voeg 500 pi of 0,5% Triton X-100-oplossing onder de inzetstukken Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur aan de cellen permeabilize.
- Snij membranen uit de insert met behulp van een scheermesje en plaats in 100 ul van 2 ug / ml DAPI in 1X PBS-oplossing, let daarbij goed op de onderkant van het membraan naar beneden te plaatsen (transmigrated cellen naar beneden).
- Wrap plaat aluminiumfolie en op een schudinrichting bij 150 rpm gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de membranen in 500 ul 1X PBS op shaker (herhaal 3 keer gedurende 10 minuten elk) om gratis DAPI te verwijderen.
- Plaats membranen op glas dia's met transmigrated cellen naar boven, voeg de montage oplossing en dekglas.
3. Data-analyse
- Tel DAPI gekleurde kernen op 5 willekeurig gekozen locaties van elk membraan (blijf uit de buurt van de randen en gebruik een 10X of 20X objectief).
- Bereken de gemiddelde cellen en het percentage verkregen invasie met de volgende formule:
Percentage invasie = 100% x (gemiddelde cellen x membraanoppervlak) / (oppervlak van de microscoop beeld x aantal cellen gezaaid)
Het percentage invasie kan worden genormaliseerd om enige controle staat (meestal de statische toestand) om te kunnen vergelijken tussen onafhankelijke experimenten. - Bereken de gemiddelde debiet: verdeel het totale geëlueerde volume in de stroom staat door de incubatietijd (bijv. 24 uur).
- Bereken de gemiddelde stroomsnelheid: verdelen de gemiddelde stroomsnelheid door de doorsnede van de gel / membraan (in dit geval 60 mm 2).
4. Representatieve resultaten
Om tumorcel invasie onder interstitiële te meten, we hebben onze 3-D stroming invasie test met behulp van MDA-MB-435S uitgezaaide melanoom cellen. Deze cellen hebben eerder aangetoond vallen in reactie op interstitiële fluïdumstroming 13-14. De cellen werden ingebed in een matrix bestaande uit 1,3 mg / ml rat tail pees collageen type I en 1 mg / ml Matrigel basaalmembraan matrix bij een uiteindelijke cel concentratie van 5 x 10 5 cellen / ml. Twee verschillende omstandigheden werden vergeleken: (1) gemiddeld interstitiële stroom = 0,1 um en -1 en (2) rusttoestand = geen meetbare debiet (figuur 1).
Na 24 uur werden de cellen die bezet door de poriën van het membraan met DAPI kleurt bij celtellingen vergemakkelijken. Figuur 2 toont een representatief beeld van de bezette cellen. Onder brightfield alleen de poriën van het membraan zichtbaar. Met fluorescentie de DAPI gekleurde kernen werden gebruikt voor celtellingen en phalloidin gekleurde F-actine structuren werden gebruikt om het cellichaam (optioneel) visualiseren. Met behulp van een Student's t-test bij gelijke varianties, hebben we aangetoond dat interstitiële doorstroming aanzienlijk MDA-MB-435S celinvasie stijgt met 2,3-voudige boven een statische condities (p = 0,003) (Figuur 3). Dit corroborasysteem coördineert soortgelijke bevindingen (maar met verschillende matrix voorwaarden en daarom stroomsnelheden) met behulp van deze cellijn 13-14.
Figuur 1. Schematische weergave van de 3-D interstitiële stroming invasie assay. Maak eerst gel oplossing met behulp van geschikte concentraties en volumes. Voeg cellen gel oplossing en overbrengen celcultuur inserts. Voeg ten slotte juiste volume van de media om elke voorwaarde en incubeer. Interstitiale fluïdum debiet wordt gestuurd door een vloeistofdruk kop.
Figuur 2. Transmigrated MDA-MB-435S-cellen op de membraan. Binnengevallen cellen werden vastgesteld na onze interstitiële vloeistofstroom invasie test en gekleurd met DAPI en Alexa Fluor 488-geconjugeerd phalloidin te vergemakkelijken telling van binnengedrongen cellen; A) Afbeelding van het membraan onder helderveld; B) DAPI staINED kernen (in blauw), c) Alexa Fluor 488-phalloidin gekleurde F-actine (in groen). Schaal balk vertegenwoordigt 50 um.
Figuur 3. Verhoogde invasie van MDA-MB-435S cellen onder stroom. Cell invasie na 24 uur aanzienlijk verbeterd door interstitiële flow (p = 0,003). De resultaten zijn genormaliseerd om de gemiddelde rusttoestand en waarden vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM van 6 celkweek inzetstukken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we beschreven een methode voor het kwantificeren van het effect van de interstitiële doorstroming op de tumorcel invasie, met behulp van cellen ingebed in een 3-D matrix in een cel cultuur insert. Deze en soortgelijke methoden toegepast om het effect van interstitiële stroom bestuderen op verschillende celtypen 13-15, 17. Onze aanpak bootst een deel van de matrix micro-omgeving van de tumor met behulp van type I collageen en Matrigel welke eiwitten in de basale membraan van het epitheel weefsel en de omliggende stroma 21-22 bevatten. Dit systeem is relatief eenvoudig in te stellen-up, recht door zee, en meer kosteneffectief dan de meeste microfluïdische apparaten die worden gebruikt om interstitiële vloeistofstroming te bestuderen in vitro 23-24. Het is niet noodzakelijk pompen of speciale apparatuur en maakt meerdere omstandigheden gelijktijdig worden beproefd. Bovendien zijn de metingen vergelijkbaar met die van bestaande Boyden kamer assays gebruikt voor invasie en migratie testenTIE van kankercellen.
Door de celtype en de samenstelling van de matrix kan verschillende biologische systemen gemodelleerde, zoals borstkanker 13 bloedvaten 15 en dendritische cellen handel 17. Het wijzigen van de matrix eigenschappen en samenstelling en het moduleren van de druk hoofd zal ook de interstitiële vloeistof stroomsnelheid, waardoor voor flexibiliteit in de test parameters afhankelijk van het biologisch systeem van belang. Dit systeem kan ook worden gebruikt in co-kweek assays. 14, 17
Naast het meten invasie het interstitiale fluïdum debiet assay beschreven kan worden uitgebreid om veranderingen in andere cellen gedrag zoals eiwitexpressie celproliferatie en verschillen in signaaltransductie gebeurtenissen te meten. De cellen kunnen gemakkelijk direct geïsoleerd worden uit de gel voor RNA, DNA en proteïnen extractie en gebruikt voor de volgende moleculaire biologie assays, zoals PCR en Westdeppen. Dit is een zeer flexibele test die eenvoudig kunnen worden ingesteld en aangepast aan de effecten van interstitiële stroom te onderzoeken op tal van cellulaire processen in een aantal cellen.
Een van de belangrijkste nadelen van deze test is dat stroomsnelheden sterk afhankelijk van matrix concentratie. Stroomsnelheid toeneemt naarmate Matrigel concentratie afneemt. Dit betekent dat een matrix die uitsluitend uit collageen, die kunnen worden gebruikt in de studie van stroma verbonden cellen zullen hogere stroomsnelheden (> 1 pm s -1) hebben dan een hoofdzakelijk Matrigel (<0,05 um s -1) een bepaald drukverschil. Als een bepaalde stroomsnelheid nodig is, kan men eerst een eerste test uitvoeren van de matrix samenstelling die het gewenste stroomsnelheid biedt identificeren. De dikte van de gel kan ook worden gevarieerd om de stroomsnelheid te passen. De test is ook niet mogelijk voor live cell imaging, waar het gedrag van individuele cellen eend veranderingen in de snelheid en richting kan worden gemeten. In plaats daarvan assay geeft een eindpunt meting van veranderingen in invasie in een populatie van cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F.
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
