Summary
침입형 유체의 흐름은 고체 종양에서 상승되며 종양 세포 침공을 조절하실 수 있습니다. 여기에서 우리는 매트릭스에 포함된 세포에 침입형 유체 흐름을 적용한 다음 세포 침입에 미치는 영향을 측정할 수있는 기법을 설명합니다. 이 기술은 쉽게 다른 시스템을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.
Abstract
대부분의 고체 종양의 성장과 진보는 암 세포와 기질 - 연관된 종양 microenvironment 1에서 신호에 대한 그들의 반응의 초기 변화에 따라 달라집니다. 이전에는 종양 microenvironment에 관한 연구는 주로 종양 - stromal 상호 작용 1-2에 주력하고있다. 그러나, 종양 microenvironment도 효과 저조한 이해 남아 biophysical 세력, 다양한 포함되어 있습니다. 이들 세력은 유전자 발현의 변화, 세포 분열, 분화 및 침공 3로 이어질 종양 성장의 biomechanical 결과입니다. 매트릭스 밀도 4, 강성 5-6, 6-7 및 구조, 중간 유체 압력 8, 침입형 유체의 흐름 8 모든 암 진행하는 동안 변경됩니다.
특히 침입형 유체의 흐름은 정상 조직의 8-10에 비해 종양으로 높다. 예상 침입형 유체 층오우 판매율은 측정 및 종양 크기와 차별화 9, 11에 따라 0.1-3 μm의들 -1의 범위에 있어야 발견되었다. 이것은 종양 유발 angiogenesis 및 증가된 혈관 투과성 12 시까지 인한 고가 중간 유체 압력에 의한 것입니다. 침입형 유체의 흐름은 암세포 13-14, 혈관 섬유아 세포 및 평활근 세포 15 침략을 향상을 보여줘왔다. 이 침공은 3-D 16 셀 주위 만들거나 모체 metalloproteinase (MMP) 표현 15, 케모카인 분비와 세포 유착 분자 발현 17 증가 autologous chemotactic의 그라디언트가 원인일 수 있습니다. 그러나 세포가 유체의 흐름을 감지하는 메커니즘이 잘 이해되지 않습니다. 종양 세포의 행동을 변화 이외에도, 중간 유체 흐름은 종양 microenvironment의 다른 세포의 활동을 modulates. 이것은 종양 - 홍보 myofibr으로 섬유아 세포의 (A) 운전 분화와 관련된oblasts 18 (b)는 항원과 림프절 19, 그리고 (c) modulating 림프 내피 세포 morphogenesis 20 ~ 다른 용해 요인에 호송.
여기에 제시된 기술은 체외에서 세포에 침입형 유체 흐름을 부과하고 침공 (그림 1)에 미치는 영향을 quantifies. 이 방법은 stromal 및 암 세포 침입 13-15, 17 일에 유체 흐름의 효과를 측정하기 위해 여러 연구에 게시되었습니다. 매트릭스 구성, 셀 유형, 및 세포 농도를 변경하면이 방법은 이러한 침략, 분화, 증식 및 유전자 발현 등의 세포 프로세스에 침입형 흐름의 효과를 연구하기 위해 다른 질환과 생리적 시스템에 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 분석 설정
- 4 ° C (약 2 시간)에 얼음 Matrigel의 작은 나누어지는 (<500 μl)을 녹여.
- 겔 제조법 (아래 표에서 예를 들어 볼륨을 참조) 준비 : 10X PBS (총 판매량 1X), 1N 수산화 나트륨을 (추가 콜라겐의 0.023 권에 상응하거나 콜라겐 제조 업체의 권장 사항마다 적절한 등), Matrigel과 콜라겐이에 나를 입력 1 MG / ML 및 1.3 밀리그램 / 각각 ML (다른 매트릭스 공법은 세포 종류와 실험에 따라 사용될 수있다)의 최종 농도.
예 겔 제조법
| 구성 요소 | 주식 농도 | 최종 농도 | 볼륨을 추가 |
| 10X PBS | 10X | 1X | 0.090 ML |
| 멸균 물 | 0.346 ML | ||
| 1N NaOH | 0.008 ML | ||
| Matrigel | 9.90 밀리그램 / ML | 1 MG / ML | 0.101 ML |
| 쥐의 꼬리 타입 I의 콜라겐 | 3.66 밀리그램 / ML | 1.3 MG / ML | 0.355 ML |
- 4 ° C.에 1 시간을위한 위의하고 품어 최종 해결책 '같은 순서대로 얼음 젤의 구성 요소를 섞어 우리의 경험에서 콜라겐의 더 많은 유니폼을 겔화의 세포 시딩 결과 이전 1 시간 보육. 항상 얼음 Matrigel과 콜라겐을 유지하고 겔화 방지를 위해 최대한 빨리 가능한 작동하도록해야합니다.
- 소독 집게를 사용하여 12도 강판으로 장소 12mm 직경 8 μm의 기공 세포 배양 삽입합니다.
- 5 X 10 6 세포 / ML (총 볼륨 겔 용액의 10 %이어야합니다)에 혈청이없는 미디어 셀 및 resuspend 세어보세요.
- 세포 통화 100 μl 추가겔 용액 900 μl (최종 세포 농도가 5 × 10 5 세포 / ML)에 spension하며 위아래로 가볍게 pipetting에 의해 철저하게 섞는다.
- 겔은 polymerizes 때까지 30 분 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에 각각 삽입 및 전송로 최종 혼합물의 150 μl를 추가합니다.
- 혈청 프리 미디어를 사용하면,
- 정적 상태에 삽입 이하 겔과 1,200 μl 위에 100 μl를 추가합니다. 우물에 삽입하고 외부 내부의 액체 레벨 겔없이 중간 흐름 전반에 걸쳐 최소한의 압력 차이가 발생, 약이어야합니다.
- 유동 상태에 젤 위에 넣고 650 μl 아래 100 μl를 추가합니다. 그들이 이러한 위치에있는 멤브레인 통해 마이 그 레이션에서 세포를 차단하므로 삽입 아래에있는 공기 방울을 피하기 위해주의하십시오. 이러한 볼륨에 의해 생성되는 압력 차이는 약 1.3 cm H 2 O (또는 1mm HG)입니다.
- 37의 장소 플레이트° C, 24 시간을위한 5% CO 2 배양기.
2. 세포 염색법과 집계
- 500 1X PBS의 μl 당 자로 새로운 24 잘 플레이트를 추가, 이것은 삽입을 씻어 사용됩니다.
- 흐름 transwells의 상단 부분에 남아있는 매체를 제거하고 볼륨을 결정합니다. 원래, 650 μl를 (이것은 아래 참조, 유량 계산에 사용됩니다) 추가된 총 볼륨에서 나머지 볼륨을 빼는 방법으로 총 eluted 볼륨을 계산합니다. 삽입에서 젤을 제거 및 비 침략 세포를 제거하는 멤브레인의 상단 표면을 닦아하기 위해 면봉을 사용합니다. 삽입을 씻어 15 s에 대한 1X PBS를 포함하는 24 잘 판에 삽입 놓으십시오.
- PBS를 제거하고 transmigrated 세포를 해결하기 위해 상온에서 30 분간 각각 넣고 품어 밑에 4 % paraformaldehyde (PFA) 500 μl를 추가합니다.
- PFA를 제거하고 잔류 정착액을 제거하기 위해 500 μl 1X PBS로 한번 헹굼.
- 500 μl O를 추가하십시오세포를 permeabilize 위해 상온에서 10 분 삽입하고 품어 아래 F 0.5 % 트리톤 X-100 솔루션입니다.
- 아래로 막 얼굴의 아래쪽에 배치하기 위해 신중하다고, 2 μg / 1X PBS 용액에 ML DAPI 100 μl로 면도날과 장소를 사용하여 삽입 세포막을 잘라 (transmigrated 세포 뒤집음).
- 상온에서 30 분간 150 rpm으로 흔드는에 알루미늄 호일과 장소에서 랩 플레이트.
- 흔드는 500 μl 1X PBS 무료 DAPI를 제거하는 (각 10 분 반복 3 회)에서 세포막을 씻으십시오.
- 최대 직면한 transmigrated 전지와 유리 슬라이드에 플레이스 점막은 마운팅 솔루션과 커버 슬립을 추가합니다.
3. 데이터 분석
- 각 멤브레인 5 임의로 선택된 위치 (거리 가장자리에서 머물면서 10X 또는 20X 객관 렌즈 사용)에 DAPI 묻은 핵을 세어보세요.
- 평균 셀 카운트를 계산하고 다음 수식을 사용하여 %의 침공을 얻을 :
%의 침공 = 100 % X (평균 세포 개수 X 막 면적) / (세포 씨앗의 현미경 이미지 X 번호의 표면적)
%의 침공은 독립적인 실험 간의 비교를 가능하도록하기 위해서 몇 가지 제어 상태 (일반적으로 정적 상태)로 정규화 할 수 있습니다. - 배양 시간 (예, 24 시간)에 의해 유동 조건에서 총 eluted 볼륨을 분할 : 평균 유속을 계산합니다.
- 평균 유속 계산 : 젤 / 멤브레인 (이 경우에는 60mm 2)의 단면적에 의한 평균 유속을 나눕니다.
4. 대표 결과
중간 흐름 미만의 종양 세포 침공을 측정하기 위해, 우리는 MDA-MB-435S 전이성의 흑색증 세포를 사용하여 우리의 3 차원 유동 침략 분석을 수행. 이러한 세포는 이전에 중간 유체 유동 13-14에 대한 응답으로 침략을 보여왔다. 전지는 1.3 밀리그램 / ML 쥐 타이 구성된 매트릭스에 박혀 있었다난 힘줄의 콜라겐 유형 I 및 5 × 10 5 세포 / ML의 최종 세포 농도 1 밀리그램 / ML Matrigel 지하 막 행렬. 두 가지 조건을 비교했다 : (1) 평균 중간 흐름 = 0.1 μm의들 -1 (2) 정적 상태 = 노 측정 가능한 유량 (그림 1).
24 시간 후, 멤브레인의 땀구멍으로 침입 세포는 세포 계수를 촉진하기 위해 DAPI 물들일되었다. 그림 2는 침략 세포의 대표적인 이미지를 보여줍니다. brightfield에서 막만을 모공도 볼 수 있습니다. 형광 사용 DAPI 묻은 핵은 세포 계수와 phalloidin 스테인드 F-actin 구조에 사용되었다는 세포 본문 (선택 사항) 시각화하는 데 사용되었습니다. 동등 변화하는 가정 학생의 T-테스트를 사용하여, 우리는 그 중간 흐름이 크게 (그림 3) (P = 0.003) 정적 조건 이상의 2.3 배하여 MDA-MB-435S 세포 침공을 증가했다. 이 corrobora이 세포주 13-14를 사용하여 유사한 결과를 (하지만 다른 매트릭스 조건에 따라서 유량 판매율 포함) 오셨.
그림 1. 3 차원 침입형 유체 유동 침략 분석의 도식. 먼저 적절한 농도와 볼륨을 사용하여 겔 용액을 준비합니다. 그런 다음 겔 용액에 세포를 추가하고 세포 배양 삽입에 전송할 수 있습니다. 마지막으로 각 조건에 미디어의 적절한 볼륨을 추가하고 알을 품다. 침입형 유체의 흐름은 유체 압력의 머리에 의해 주도된다.
그림 2. 막에 MDA-MB-435S 세포를 Transmigrated. 명시야 이하 멤브레인의) 사진; 침략 세포 침입 세포 계수 촉진하기 위하여 DAPI와 알렉사 형석와의 중간 유체 흐름 침략 분석과 스테인드 488-복합 phalloidin 후 수정되었습니다 B) DAPI 역ined 핵 (파란색), C) 알렉사 형석 488-phalloidin의 스테인드 F-actin (녹색). 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다.
그림 3. 흐름 이하 MDA-MB-435S 세포의 침공 증가했습니다. 24 시간 후 세포 침공은 크게 중간 유량 (P = 0.003)에 의해 향상. 결과는 평균 정적 상태로 정규화과 가치는 6 세포 배양 삽입의 평균 ± SEM을 대표하고 있습니다.
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Discussion
여기에서 우리는 세포 배양 삽입 내에 3 차원 매트릭스에 포함된 세포를 이용하여 종양 세포 침공에 침입형 흐름의 효과를 quantifying위한 방법론을 설명했습니다. 이것과 유사한 방식이 세포 유형에 13-15, 17의 다양한 침입형 흐름의 효과를 연구하는 데 사용되었습니다. 우리의 접근 방식은 일부 유형을 사용하여 종양의 매트릭스 microenvironment을 모방한 것이었 나 상피 조직과 주변 기질 21-22 지하 막에서 발견된 단백질을 포함 콜라겐과 Matrigel. 이 시스템은 비교적에 설정 쉽고 간단하며 비용이 훨씬 더 체외 23-24에 침입형 유체의 흐름을 연구하는 데 사용되는 대부분의 microfluidic 장치를보다 효과적입니다. 그것은 펌프 또는 전문 장비가 필요하고 동시에 테스트할 수 있도록 여러 조건을 허용하지 않습니다. 또한, 측정은 일반적으로 침략과 migra를 테스트하는 데 사용되는 기존 Boyden 챔버 assays 분들 비교입니다암 세포의 기.
세포 유형과 매트릭스의 구성을 변경하면 다른 생물 학적 시스템은 유방암 13 혈관 15, 그리고 돌기 세포 밀매 17으로 모델링 될 수 있습니다. 행렬 속성과 조성과 modulating 압력 헤드를 변경하면 따라서 관심있는 생물 학적 시스템에 의존 분석 매개 변수의 유연성있게 중간 유체 흐름 속도가 변경됩니다. 이 제도는 공동 문화 assays에서도 사용하실 수 있습니다. 14, 17가
침략을 측정뿐만 아니라, 중간 유체 흐름 분석은 단백질 발현, 세포 증식 및 세포 신호 전달 행사의 차이와 같은 다른 세포 행동의 변화를 측정하기 위해 확대 수있다 여기에서 설명한. 세포는 쉽게 RNA, DNA가 젤 및 단백질 추출에서 직접 격리와 같은 PCR과 서양 등 후속 분자 생물 assays, 사용할 수 있습니다얼룩. 이것은 쉽게 설정하고 세포 시스템의 수가 세포 공정의 범위에 침입형 흐름의 영향을 조사하기 위해 적용할 수 있습니다 매우 유연한 분석이다.
이 분석의 주요 단점 중 하나는 흐름 판매율이 매트릭스 집중 매우 의존한다는 사실입니다. Matrigel 농도가 감소로 유속이 증가한다. 이것은 기질 연관된 세포의 연구에 사용할 수있는 콜라겐으로 전적으로 구성된 행렬이 하나가 Matrigel (<0.05 μm의들 -1)로 주로 구성보다 높은 유동 판매율 (> 1 μm의들 -1)을 갖게된다는 것을 의미합니다 주어진 압력 미분. 특정 유속이 필요한 경우, 하나는 먼저 원하는 유속을 제공하는 매트릭스 구성을 확인하는 초기 테스트를 수행할 수 있습니다. 겔의 두께는 유속을 조정하기 위해 다양한 수 있습니다. 분석은 또한 개별 세포의 행동은 라이브 세포 이미징을 위해 허용하지 않습니다그들의 속도와 방향의 D 변경 사항은 측정할 수있다. 대신,이 분석은 세포의 인구에 걸쳐 침략의 변화 종점 측정을 제공합니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
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