Summary
El flujo de fluido intersticial es elevada en los tumores sólidos y puede modular la invasión de células tumorales. Aquí se describe una técnica para aplicar el flujo de fluido intersticial a las células embebidas en una matriz y luego medir sus efectos sobre la invasión de células. Esta técnica se puede adaptar fácilmente para estudiar otros sistemas.
Abstract
El crecimiento y la progresión de la mayoría de los tumores sólidos depende de la transformación inicial de las células cancerosas y su respuesta a estroma asociada a la señalización en el microambiente del tumor 1. Anteriormente, la investigación sobre el microambiente del tumor se ha centrado principalmente en tumores del estroma interacciones 1-2. Sin embargo, el microambiente del tumor también incluye una variedad de fuerzas biofísicas, cuyos efectos siguen siendo poco conocidos. Estas fuerzas son las consecuencias biomecánicas de crecimiento de los tumores que conducen a cambios en la expresión génica, la división celular, la diferenciación y la invasión 3. Densidad de matriz 4, rigidez 5-6, 6-7 y la estructura, la presión del fluido intersticial 8, y el flujo de fluido intersticial 8 están alterados durante la progresión del cáncer.
El flujo de fluido intersticial en particular es mayor en los tumores en comparación con 8-10 tejidos normales. La baja estima que el líquido intersticialvelocidades ow se midieron y se encontró que en el intervalo de 0,1-3 micras s -1, dependiendo del tamaño del tumor y la diferenciación 9, 11. Esto es debido a la presión elevada del líquido intersticial causada por el tumor angiogénesis inducida por aumento de la permeabilidad vascular y 12. El flujo de fluido intersticial se ha demostrado que aumenta la invasión de las células cancerosas 13-14, fibroblastos vasculares y células musculares lisas 15. Esta invasión puede ser debido a los gradientes quimiotácticos autólogas creadas en torno a las células en 3-D de 16 o mayor metaloproteinasas de matriz (MMP) la expresión 15, la secreción de quimioquinas y la adhesión celular expresión de la molécula 17. Sin embargo, el mecanismo por el cual las células detectar el flujo de fluido no se entiende bien. Además de alterar el comportamiento de las células tumorales, el flujo de líquido intersticial modula la actividad de otras células en el microambiente tumoral. Está asociada con la diferenciación de conducción (a) de fibroblastos en promotor de tumores myofibroblasts 18, (b) al transporte de los antígenos y otros factores solubles a los ganglios linfáticos 19, y (c) modulación de morfogénesis linfático de células endoteliales 20.
La técnica que aquí se presenta impone el flujo de fluido intersticial en células in vitro y cuantifica sus efectos sobre la invasión (Figura 1). Este método ha sido publicada en múltiples estudios para medir los efectos de flujo de fluido en estroma y la invasión de las células cancerosas 13-15, 17. Al cambiar la composición de la matriz, el tipo de célula, y la concentración celular, este método puede ser aplicado a otras enfermedades y sistemas fisiológicos para estudiar los efectos del flujo intersticial en los procesos celulares tales como la invasión, la diferenciación, proliferación y la expresión génica.
Protocol
1. Ensayo de Set-up
- Descongelar una alícuota pequeña (<500 l) de Matrigel en hielo a 4 ° C (aproximadamente 2 horas).
- Prepare la receta de gel (véase el volumen de ejemplo en la tabla a continuación): 10x PBS (1x en el volumen total), hidróxido de sodio 1N (equivalente a 0.023 volúmenes de colágeno añadido, o por las recomendaciones del fabricante del colágeno, según corresponda), Matrigel y el colágeno de tipo I a la las concentraciones finales de 1 mg / ml y 1,3 mg / ml, respectivamente (otras formulaciones de la matriz pueden ser utilizados en función del tipo de célula y el experimento).
Ejemplo de receta de gel de
| Componentes | Concentración de archivo | La concentración final | Añadir un volumen |
| PBS 10 veces | 10 veces | 1X | 0.090 ml |
| Agua estéril | 0.346 ml | ||
| NaOH 1N | 0,008 ml | ||
| Matrigel | 9,90 mg / ml | 1 mg / ml | 0.101 ml |
| Cola de rata colágeno tipo I | 3,66 mg / ml | 1,3 mg / ml | 0.355 ml |
- Mezclar los componentes del gel sobre hielo en la misma secuencia que el anterior y solución final se incuba durante 1 hora a 4 ° C. En nuestra experiencia, una incubación de 1 hora antes de la siembra de células resultados en una gelificación más uniforme del colágeno. Asegúrese de mantener Matrigel y el colágeno en el hielo en todo momento y para trabajar lo más rápido posible para evitar la gelificación.
- Colocar 12 mm de diámetro 8 micras de poro insertos de cultivo de células en una placa de 12 pocillos usando pinzas esterilizadas.
- Contar las células y resuspender en medios libres de suero a 5 x 10 6 células / ml (volumen total debe ser de 10% de la solución de gel).
- Añadir 100 l de Su celularspension a 900 l de solución de gel (concentración final de células de 5 x 10 5 células / ml) y mezclar bien con la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Añadir 150 ml de la mezcla final de cada inserto y la transferencia a un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 30 minutos hasta que el gel se polimeriza.
- Utilizando medios libres de suero,
- Añadir 100 l en la parte superior del gel y l 1200 bajo el inserto para la condición estática. Los niveles de fluido en el interior del inserto y en el exterior, así debe ser aproximadamente igual, lo que resulta en la diferencia de presión mínima a través del gel y no hay flujo intersticial.
- Añadir 100 l bajo el inserto y por encima de 650 l de gel para la condición de flujo. Tenga cuidado para evitar las burbujas de aire debajo de la inserción, ya que impiden que las células migren a través de la membrana en estos lugares. La diferencia de presión generada por estos volúmenes es de aproximadamente 1,3 cm de H 2 O (o 1 mm de Hg).
- Coloque la placa en un 37° C, 5% de CO 2 incubadora durante 24 horas.
2. Tinción celular y recuento
- Añadir 500 l de 1X PBS por pocillo en la placa de nuevo 24-bien, lo que se utiliza para lavar los insertos.
- Eliminar el medio restante en la porción superior de los transwells flujo y determinar el volumen. Calcular el volumen total de eluido restando el volumen restante del volumen total originalmente añadido, 650 l (esto se usa para los cálculos de velocidad de flujo, ver más abajo). Utilizar bastoncillos de algodón para quitar el gel de los insertos y para limpiar la superficie superior de la membrana para eliminar las células no invadidas. Coloque los insertos en la placa de 24 pocillos que contenía 1X PBS durante 15 s para lavar insertos.
- Retire PBS y añadir 500 l de paraformaldehído al 4% (PFA) debajo de cada inserto y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar las células transmigrados.
- Retire la PFA y enjuagar una vez con 500 l 1X PBS para eliminar el fijador residual.
- Añadir 500 l of 0,5% Triton X-100 solución por debajo de las inserciones y se incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar las células.
- Cortar las membranas de la inserción utilizando una cuchilla de afeitar y el lugar en 100 l de 2 g / ml DAPI en 1X solución de PBS, teniendo cuidado de colocar la parte inferior de la cara membrana hacia abajo (células transmigrados boca abajo).
- Envolver la placa en papel de aluminio y el lugar en un agitador a 150 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lave las membranas en 500 l de PBS 1X en el agitador (repetir 3 veces durante 10 minutos cada uno) para eliminar DAPI libre.
- Coloque las membranas en portaobjetos de vidrio con células transmigrados hacia arriba, agregar la solución de montaje y cubreobjetos.
3. Análisis de Datos
- Cuente con DAPI núcleos teñidos en 5 lugares seleccionados al azar de cada membrana (mantenerse alejado de los bordes y utilizar un 10X o 20X lente del objetivo).
- Calcular el recuento promedio de células y obtener la invasión por ciento mediante la siguiente fórmula:
Invasión Porcentaje = x 100% (recuento medio de células x membrana de superficie) / (área de superficie del número microscopio x imagen de células sembradas)
La invasión por ciento puede ser normalizado en cierta condición de control (típicamente la condición estática) para permitir la comparación entre los experimentos independientes. - Calcular el caudal medio: dividir el volumen total eluida en la condición de flujo por el tiempo de incubación (por ejemplo, 24 h).
- Calcular la velocidad de flujo media: dividir el caudal medio por el área transversal del gel / membrana (en este caso de 60 mm 2).
4. Los resultados representativos
Para medir la invasión de células tumorales bajo flujo intersticial, hemos realizado nuestra 3-D ensayo de invasión de flujo utilizando MDA-MB-435S células de melanoma metastásico. Estas células han sido demostrado para invadir en respuesta al flujo de fluido intersticial 13-14. Las células fueron incorporados en una matriz compuesta de 1,3 mg / ml de rata taitendón l colágeno de tipo I y 1 mg / ml de matriz sótano Matrigel membrana celular a una concentración final de 5 x 10 5 células / ml. Dos condiciones se compararon diferentes: (1) el flujo intersticial media = 0,1 m s-1 y (2) condición estática = sin flujo mensurable (Figura 1).
Después de 24 horas, las células que invaden a través de los poros de la membrana se tiñeron con DAPI para facilitar el recuento de células. La figura 2 muestra una imagen representativa de las células invadidas. Bajo claro, sólo los poros de la membrana son visibles. Uso de fluorescencia, los núcleos con DAPI-manchado fueron utilizados para el recuento de células y las estructuras manchadas de phalloidin F-actina se utiliza para visualizar el cuerpo celular (opcional). El uso de un de t de Student asumiendo varianzas iguales, se demostró que el flujo intersticial aumenta significativamente la MDA-MB-435S invasión de las células en 2,3 veces en condiciones estáticas (p = 0,003) (Figura 3). Esta corroboraciónTes resultados similares (pero con diferentes condiciones de la matriz y por lo tanto las velocidades de flujo) utilizando esta línea celular 13-14.
Figura 1. Esquemática del ensayo de 3-D invasión intersticial de flujo de fluido. En primer lugar preparar la solución en gel utilizando concentraciones apropiadas y volúmenes. Luego añadir las células a la solución de gel y transferir a los insertos de cultivo celular. Por último agregar el volumen adecuado de los medios de comunicación a cada condición y se incuba. El flujo de fluido intersticial es impulsado por una cabeza de presión de fluido.
Figura 2. Transmigrado MDA-MB-435S celdas de membrana. Células invadidas fueron fijadas después de nuestra invasión de ensayo de flujo del líquido intersticial y se tiñeron con DAPI y Alexa Fluor 488-conjugado phalloidin para facilitar el recuento de las células invadidas, una imagen) de la membrana en campo claro; B) DAPI estaciónnúcleos INED (en azul), C) Alexa Fluor 488-phalloidin manchas F-actina (en verde). Barra de escala representa 50 micras.
Figura 3. El aumento de la invasión de MDA-MB-435S células bajo flujo. Invasión de la célula después de 24 h mejorado significativamente por el flujo intersticial (p = 0,003). Los resultados se normalizan a la condición estática y el promedio de los valores representan la media ± SEM de 6 inserciones de cultivo celular.
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Discussion
Aquí hemos descrito una metodología para cuantificar el efecto del flujo intersticial en la invasión de células tumorales, utilizando células embebidas en una matriz de 3-D dentro de un inserto de cultivo celular. Este y otros métodos se han utilizado para estudiar el efecto del flujo intersticial en una variedad de tipos celulares 13-15, 17. Nuestro enfoque parte imita la matriz de microambiente del tumor mediante el uso de colágeno tipo I y Matrigel que contienen proteínas que se encuentran en la membrana basal del tejido epitelial y el estroma circundante 21-22. Este sistema es relativamente fácil de configurar, fácil y más rentable que la mayoría de los dispositivos de microfluidos que se utilizan para estudiar el flujo del líquido intersticial in vitro 23-24. No requiere bombas o equipos especializados y permite varias condiciones para ser analizadas de forma simultánea. Además, las mediciones son comparables a los de los actuales ensayos de cámara de Boyden comúnmente utilizado para probar la invasión y la migraciónción de las células cancerosas.
Al cambiar el tipo de célula y la composición de la matriz, diferentes sistemas biológicos pueden ser modelada, tales como cáncer de mama 13, 15 vasos sanguíneos, y el tráfico de células dendríticas 17. La alteración de las propiedades de la matriz y la composición y la cabeza modulación de la presión también se cambia la velocidad de flujo de fluido intersticial, permitiendo así una flexibilidad en los parámetros de ensayo que dependen del sistema biológico de interés. Este sistema también puede utilizarse en ensayos de co-cultivo. 14, 17
Además de medir la invasión, el ensayo de flujo de fluido intersticial se describe aquí se podría ampliar para medir los cambios en los comportamientos de otras células, como expresión de la proteína, la proliferación celular y las diferencias en los eventos de señalización celular. Las células pueden ser fácilmente aislados directamente a partir del gel de ARN, ADN, y extracción de proteínas y se utiliza para posteriores estudios de biología molecular, tales como PCR y occidentalborrar. Este es un ensayo altamente flexible que se puede configurar fácilmente y adaptado para investigar los efectos del flujo intersticial en una gama de procesos celulares en un número de sistemas celulares.
Uno de los principales inconvenientes de este ensayo es el hecho de que las velocidades de flujo son muy dependiente de la concentración de la matriz. Velocidad de flujo aumenta a medida que disminuye la concentración de Matrigel. Esto significa que una matriz que consiste únicamente en el colágeno, que puede ser utilizado en el estudio de las células del estroma asociadas, tendrán mayores velocidades de flujo (> 1 m s -1) que consiste principalmente en una de Matrigel (<0,05 m s -1) para una presión dada diferencial. Si una velocidad de flujo específico es necesario, una primera puede realizar una prueba inicial para identificar la composición de la matriz que proporciona la velocidad de flujo deseada. El espesor del gel también se puede variar para ajustar la velocidad del flujo. El ensayo también no permite imágenes de células vivas, donde el comportamiento de las células individuales de und cambios en su velocidad y direccionalidad se puede medir. En su lugar, este ensayo proporciona una medición de la variable de cambios en la invasión a través de una población de células.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
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