Summary

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

Published: December 04, 2012
doi:

Summary

Assay מסלול תנועתיות phagokinetic הוא שיטה המשמשת כדי להעריך את התנועה של תאים. באופן ספציפי, assay מודד chemokinesis (תנועתיות תאים האקראיות) לאורך הזמן באופן כמותי. Assay מנצל את יכולתם של תאים ליצור מסלול למדידת התנועה שלהם על coverslips colloidal מצופה זהב.

Abstract

תנועתיות ניידות היא תהליך ביולוגי חשוב לשני יצורים חד תאיים ורבים תאיים. הוא חיוני לתנועה של יצורים חד תאיים לכיוון מקור של חומרים מזינים או במרחק שאינם מתאימים תנאים, כמו גם באורגניזמים תאיים לפיתוח רקמות, מעקב חיסוני וריפוי פצעים, רק כדי להזכיר כמה תפקידים 1,2,3. הסרת פיקוח על תהליך זה יכול להוביל למחלות קשות נוירולוגיות, לב וכלי דם ומערכת חיסון, כמו גם היווצרות גידול החמיר והתפשטה 4,5. מולקולרי, פילמור יקטין ומחזור הקולט הוכחו לשחק תפקיד חשוב ביצירת רחבות סלולריות (lamellipodia), המניעות את התנועה קדימה בתא 6,7,8. עם זאת, שאלות רבות ביולוגיות על נדידת תאים נותרו ללא מענה.

התפקיד המרכזי לתנועתיות סלולרית באדם מחל בריאות מדגיש את החשיבות של הבנת MEC הספציפיhanisms מעורב בתהליך הזה והופך את השיטות מדויקות להערכת תנועתיות תא חשובה במיוחד. מיקרוסקופים משמשים בדרך כלל כדי לחזות את התנועה של תאים. עם זאת, תאים לנוע די לאט, מה שהופך את מדידת כמותית של נדידת תאי תהליך גוזל משאבים דורשים מצלמות ותוכנה יקרות כדי ליצור סרטים כמותיים נושנים של תאים ניעתי. לכן, היכולת לבצע מדידת כמותית של נדידת תאים שהיא יעיל וחסכוני, שאינם מייגע, ושמנצל ציוד מעבדה משותף היא צורך גדול עבור חוקרים רבים.

בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic מנצלת את יכולתו של תא נע כדי לנקות חלקיקי זהב ממסלולו כדי ליצור מסלול מדיד על coverslip זכוכית מצופת הזהב colloidal 9,10. עם השימוש בתוכנה זמינה באופן חופשי, מספר רבים של מסלולים ניתן להעריך עבור כל טיפול כדי להשיג את הצורכים סטטיסטיים. הבדיקה יכולה להיות מנוצלת כדי להעריךתנועתיות של תאים מסוגים רבים, כגון תאים סרטניים, 11,12 פיברובלסטים 9, נויטרופילים 13, תאי שריר שלד 14, 15, הקרטינוציטים trophoblasts 16, 17, תאי האנדותל ומונוציטים 10,18-22. הפרוטוקול כולל יצירת שקופיות מצופות בחלקיקי זהב (° Au) המופקים על ידי הפחתה של חומצת chloroauric (3 Au +) על ידי ציטרט הנתרן. שיטה זו פותחה על ידי Turkevich et al. בשנת 1951 23 ולאחר מכן השתפרה בשנתי ה -1970 על ידי Frens et al. 24,25. כתוצאה מהפחתת צעד זה כימי, חלקיקי זהב (10-20 ננומטר בקוטר) יזרזו מתערובת התגובה ויכולים להיות מיושמים על coverslips זכוכית, אשר אז מוכנים לשימוש בניתוחי נדידה סלולריות 9,26,27.

באופן כללי, בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic היא מדד מהיר, כמותית וקלה של תנועתיות סלולרית. בנוסף,יכול להיות מנוצל כמו assay פשוט תפוקה גבוהה, לשימוש עם סוגי תאים שאינם ניתן להדמיה נושנה, כמו גם שימושים אחרים, בהתאם לצרכימים של החוקר. ביחד, את היכולת למדידת כמותית תנועתיות סלולריות של סוגי תאים מרובים ללא צורך במיקרוסקופים ותוכנה יקרים, יחד עם השימוש בציוד מעבדה משותף וכימיקלים, לבצע בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic בחירה מוצקה למדענים בעלי עניין בהבנה סלולרית תנועתיות.

Protocol

1. הכנת Coverslips ג'לטין המצופה מקום coverslips חומצה שטף את הכוס (15 מ"מ קוטר) בצלחת סטרילית פלסטיק 100 מ"מ (ES). הנח 8-9 coverslips לצלחת ולוודא שהם לא נוגעים זה בזה או את הצדדים של הצלחת .. …

Representative Results

הראה דוגמה של תמונות שצולמו במיקרוסקופ אור מראה אזור מסלול המסומן על ידי תא בודד (monocyte מהניסויים שלנו מוצגת באיור 2). תאים ללא ניעתי ליצור, סגלגלים קטנים אופייניים או שטחים בצורת העיגול סביב עצמם מעידים על רמה בסיסית נמוכה של תנועה לתאי unstimulated אלה (איורים…

Discussion

בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic הוצגה במאמר זה היא שיטה פשוטה ויעילה ביותר לניתוח כמותי של נדידת תאים. כי ניתן לנתח סוגי תאים מרובים 9-17, לשיטה זו יש שימוש הרחב הפוטנציאל על פני תחומים רבים. השימוש בcoverslips הזכוכית מצופית זהב colloidal מאפשר מדידה של אזור מסלול המסומן על י?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (AI050677, HD-051998, וGM103433), מלקולם פייסט לב וכלי דם מחקר מלגה, ומלגת איגוד לב אמריקנית predoctoral (10PRE4200007).

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Glass Coverslips (15 mm) Fisher Scientific 12-545-83  
Gelatin 300 Bloom Sigma-Aldrich G-1890  
Tetrachloroauric Acid Trihydrate Fisher Chemical G54-1 14.5 mM (a final working solution)
Sodium Citrate Fisher Scientific BP327-500 0.5% (a final working solution)
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042 3% (a final working solution)
100 mm Tissue Culture Dish Sarstedt 83.1802  
12-Well Plates Fisher Scientific 08-772-29  
24-Well Plates Fisher Scientific 07-200-84  
Techne Oven Hybridiser HB-1D LabPlanet 2040500 The standard laboratory oven will suffice
10 ml Serological Pipettes Sarstedt 86.1254.001  
Pipet-Aid Filler/Dispenser Drummond 13-681-15  
P200 Single-Channel Manual Pipette Rainin PR-200  
200 ml Barrier Tips CLP BT200  
ImageJ software http://rsb.info.nih.gov/ij/   License: Public Domain
Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera Nikon   Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes.
      Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications.

References

  1. Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
  2. Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
  3. Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
  4. Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
  5. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  6. Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
  7. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  8. Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
  9. Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
  10. Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
  11. Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, 379-392 (2010).
  12. Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
  13. Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
  14. Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
  15. Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
  16. Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
  17. McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
  18. Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
  19. Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
  20. Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
  21. Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
  22. Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
  23. Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
  24. Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
  25. Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
  26. Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
  27. Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
  28. Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
  29. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
  30. Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
  31. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
  32. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  33. Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
  34. Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
  35. Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).

Play Video

Cite This Article
Nogalski, M. T., Chan, G. C., Stevenson, E. V., Collins-McMillen, D. K., Yurochko, A. D. A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay. J. Vis. Exp. (70), e4165, doi:10.3791/4165 (2012).

View Video