Summary
多巴胺是明显的调节中脑核，其中包含的多巴胺神经元的胞体和树突。在这里，我们描述了一次解剖和样品处理方法效果发挥到极致，因此，结论和见解，在黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）在啮齿动物的脑核的多巴胺调节。
Abstract
多巴胺是一种中枢神经系统的大力研究的神经递质。事实上，在自发活动的参与和奖励有关的行为，促进多巴胺调控的分子缺陷五十年的调查。纹状体和伏隔核的多巴胺调控时，大脑的分子基础，其在终端领域的黑质纹状体和mesoaccumbens途径地区的监管重点在这些查询大多数。此外，这些研究都集中在多巴胺的组织内容的分析与正常化的唯一的湿纸巾重量。调查的蛋白质，调节多巴胺，如酪氨酸羟化酶（TH）蛋白，TH磷酸化，多巴胺转运体（DAT），2囊泡单胺转运蛋白（VMAT2），通常不包括多巴胺的组织内容在同一样品的分析。同时分析多巴胺的组织内容及其调节蛋白（包括后TRA的能力nslational修改），不仅提供了内在的力量来解释多巴胺与TH，DAT或VMAT2蛋白水平和功能的关系，而且还扩展了样本经济。这意味着到更低的成本，但会产生多巴胺的分子调控，在几乎所有的研究者选择的范式的见解。
我们的分析集中在中脑。虽然最多巴胺调控的研究通常被忽视的SN和腹侧被盖区，这些原子核很容易解剖与实践。可以进行一个全面的读数，多巴胺的组织内容和TH的DAT，或VMAT2。行为在SN和腹侧被盖区的多巴胺功能的影响有正蓬勃发展的文学，和外源性物质或疾病的进程，其中1-5 impingements。此外，如生长因子的化合物对多巴胺和多巴胺调节蛋白产生深远的影响，到相对更大程度上的SN或腹侧被盖区 我们将说明夹层技术来分隔这两个核和解剖组织来样加工，产生的文件，揭示在体内的多巴胺调控的分子机制，具体的每一个细胞核（图1）。
Protocol
1。解剖
- 在湿冰床，放松啮齿类动物的大脑基质（冠状切片分离1 mm处），培养皿中含有5剃须刀，＃11手术刀。在一个单独的容器中，地方标记成干冰2毫升大小的离心管。
- 研究者会选择安乐死的方法。我们有可重复性的结果，理想的情况下，异氟醚蒸发器应该被用来进行非常简短的麻醉。但是，如果不提供，我们使用一个大型的电瓶包含一个平台。在位于批准通风罩电瓶，将异氟醚饱和的纱布下面的平台，并等待3-5分钟，以使异氟醚饱和的电瓶。将里面的老鼠和老鼠已经失去了知觉，尽快消除斩首。迅速取出大脑（最好是在两分钟内），冷水下冲洗，并立即放置在冷冻啮齿动物脑矩阵。
- 一分钟后的位置ING矩阵大脑，冷刀片，插入冷却大脑纹状体和伏隔核，如果除了中脑核分析所需的约2毫米，喙视交叉开始的。继续蹒跚其后每刀片的位置，以便更容易去除每一个人的刀片插入寒冷的刀片，每个部分通过桥，直到抵达中途1毫米。
- 当拉出剃须刀，海马开始寻找。当它已经完全包裹周围脑，开始采取部分使用11＃手术刀刀片， 如图2所示。
- 立即放入预冷的离心管干冰解剖组织。在大鼠，期望能够从两个冠状片的最低和最高的三个解剖SN和腹侧被盖区。商店组织于-80°C，直到准备处理。
2。组织分析：高效液相色谱法f或多巴胺和代谢产物
高效液相色谱设备用品及维修的完整信息，请参阅高效液相色谱分析，在手稿年底。
- 轻轻地从干冰使用冰冷的0.1 M的高氯酸4 - EDTA溶液（0.1 M的高氯酸及0.1 mM的EDTA），其中包含在N-甲基多巴胺浓度20毫微克/毫升，作为中取出后，立即组织匀浆高效液相色谱分析样品的复苏过程中的内部标准。我们使用的是均质1布兰森Sonifier 150，在全功率的10％（10 1）设置。以下的超声卷的建议：
在大鼠，SN = 250μL（单方面夹层），400μL（双侧夹层），腹侧被盖区= 200μL（单方面夹层），400μL（双边夹层）。
在鼠标，（只有双边夹层），SN = 200μL，腹侧被盖区= 200μL。 - 同质化后，干冰样品。样品然后centrifuged 12,000 RPM（杜邦Sorvall Microspin 24S）的蛋白质沉淀物颗粒可用于免疫印迹测定。上清直接注射到高效液相色谱法。以下是建议的注射量在大鼠或小鼠精确的分析：（无论从准备）SN = 150（或者准备），腹侧被盖区= 160μL
- 股票的标准准备在1毫克/毫升，加入适量的单胺类神经递质及代谢产物的多巴胺成分0.1米的高氯酸0.1 mM的EDTA。每个化合物的浓度为1毫克/毫升，除色氨酸是5毫克/毫升。股票的标准分为10μL分装，储存在超低直到需要。
*所有的重量，如果适用的复合盐的形式纠正。
准备100毫升的高氯酸溶液稀释10μL等份的股票标准的工作标准。工作标准的浓度为0.1微克/毫升，除色氨酸为0.5微克/毫升。 50μL的这方面的工作标准，注入高效液相色谱法，除色氨酸是25纳克的每个组件的5毫微克列金额。 - 多巴胺回收样本等份内的测定：
有几个步骤，涉及到确定从样品等分多巴胺恢复。 - 首先，除以峰高标准的多巴胺多巴胺样品的峰高和这个比例乘以总金额多巴胺（纳克）的标准。我们标准的多巴胺浓度为0.1纳克/μL和50μL标准检测。因此，标准中的多巴胺数量为5毫微克。因此，下面的等式可以用来确定一个给定样品中的多巴胺恢复：
（多巴胺标准样品/多巴胺峰高峰高）* 5纳克 - 校正样品使用内部标准的N-甲基多巴胺的损失：
实际恢复的N-甲基多巴胺多巴胺同样的方式计算，除以N-甲基DOP胺N-甲基多巴胺的标准峰的高度和这个比例乘以总金额N-甲基多巴胺（NG）的标准样品的峰高。多巴胺一样，我们的标准的N-甲基多巴胺浓度为0.1 ng /μL。 50μL的标准检测。因此，标准的N-甲基多巴胺金额为5毫微克。因此，下面的等式可以用来确定一个给定的样品中N-甲基多巴胺恢复：
（N-甲基多巴胺样品的峰高/ N-甲基多巴胺标准峰高）* 5ng
然而，由于不是从每个样品中的N-甲基多巴胺样品本身，而是从HPLC缓冲区，预计在每个样品的N-甲基多巴胺金额计算。在高效液相色谱法缓冲N-甲基多巴胺浓度为20 ng / mL或0.02毫微克/μL，所以N-甲基多巴胺在每个样品的预期金额是由等分量乘以N-甲基多巴胺浓度的高效液相色谱缓冲发现每个样品为HPLC分析。这表现在以下公式：
（0.02毫微克/μL）*（等分样品量的高效液相色谱分析） - 预期和恢复的N-甲基多巴胺之间的差异可以用来纠正任何样品损失调整为多巴胺回收金额。简单地采取比预期的N-甲基多巴胺/恢复N-甲基多巴胺和多巴胺的回收量乘以。因此，样品中的等份的金额为多巴胺的整体方程如下：
（多巴胺标准样品/多巴胺峰高峰高）*（N-甲基多巴胺标准/ N-甲基多巴胺样品的峰高峰高）*（0.02毫微克/μL）*（等分样本量用于高效液相色谱分析） - 共有多巴胺回收样品：
从样品等分恢复多巴胺的值，然后用在一个给定的样本来推断多巴胺总额。这是除以回收量（纳克）Of伤残等分体积和样品超声英寸的高效液相色谱法缓冲总额乘以这个值，这是由下面的等式：
（取样品中量的多巴胺（NG）/体积样品分装）*（高效液相色谱缓冲区的总成交量到其中的样品，超声）。
读者可以参考以下的结合不仅SN和腹侧被盖区的多巴胺调节的蛋白质，但纹状体和伏隔核以及读数多巴胺及其代谢产物在评估全面介绍研究2,4,10。
3。组织分析：总蛋白和最终正常化TH和DAT结果
- 放入湿冰沉淀的蛋白质颗粒（来自高效液相色谱法缓冲处理），以维持4°C确保所有缓冲区已被删除，存档（如果需要验证分析）。如果SN或腹侧被盖区是处理双边（只大鼠），添加300微升（SN）或200μL（VTA）的1％的SDS含5毫米的Tris（pH值8.3）和1 mM EDTA的沉淀和超声粉碎。 SN颗粒或100μL加入150μLSDS溶液腹侧被盖区微丸，如果处理从单方面解剖组织。
- 〜5分钟即可完成蛋白质变性，使冷却至室温的样品将在不久的开水。在这一步确保帽安全举行。
- 确定蛋白质浓度的样品使用BCA分析，包括蛋白质标准曲线（白蛋白标准）范围为2 - 40微克蛋白。检测5μl样品一式三份的数量和使用中值对标准曲线，以确定蛋白质的数量。除以蛋白浓度的检测量。注意：这是第一正常化总TH，DAT和VMAT2结果总蛋白恢复采取两个步骤。
- 准备减少10％的丙烯酰胺ĞSDS电泳样品缓冲液的样品（含二硫）埃尔斯。理想的情况下，最后的总蛋白浓度应该〜2微克/微升。此浓度的选择的原因是为了减少最终确定的TH磷酸化所必需的样本量，加载精确量化TH磷酸化ser31和ser40〜100μg总蛋白将是必要。如果黄色后加入样品缓冲液样品中，样品是太酸。加入1 M在10μL增量的Tris（pH值8.2），直到恢复蓝色。
- 准备样品为多巴胺调节蛋白的下列裁决如下：
- TH：反对的TH蛋白的校准标准（吴）在SN（纳克每μg蛋白总量TH），TH的浓度预计从约介于0.05-0.27纳克每微克总蛋白2,4次， 7,10,11。反对线性TH标准曲线，范围从0.5 - 5.0纳克TH和使用主要抗体的TH（Millipore公司猫＃AB152，1:1000稀释在PVPţ-20阻断剂），这将产生一个线性的标准曲线，应该从SN总蛋白的最佳负载〜10微克。腹侧被盖区的TH浓度范围从0.4到1.0％μg蛋白4,11吴次。因此，腹侧被盖区的总蛋白负载应该是〜5微克。
- 的DAT：SN或腹侧被盖区的DAT相对数量明显少于同源终端纹状体和伏隔核4场地区。 TH蛋白恢复正常化的DAT的相对表达也明显在SN和腹侧被盖区。因此，量化SN或腹侧被盖区DAT蛋白的蛋白质负荷需要终端领域的区域样本负载相比要大得多。至少30μg总蛋白的需要精确评估在腹侧被盖区的DAT和额定负载的50μg总蛋白是在SN评估的需要。使用的主要抗体是圣克鲁斯，猫＃SC-1433。
- VMAT2：VMAT2的表达，作为规范化的总蛋白，是在比黑质纹状体区域mesoaccumbens更大。然而，相对于TH的表达，VMAT2的表达是最伟大的SN和至少在纹状体4。使用圣克鲁斯猫SC-15314＃，标称总蛋白负载的〜40微克，是最好VMAT2量化。
- 运行适当数量的总蛋白的10％丙烯酰胺凝胶上使用的SDS-PAGE。 Bio-Rad公司PROTEAN II电泳装置，用于确定，这是一个大的凝胶格式。蛋白质转移到0.45微米孔径硝化棉。为转移，Hoeffer坦克设置为至少27伏特，允许转移到接管夜间进行。
- 允许的印迹干燥至少30分钟，然后染色与丽春红S溶液（1％，5％冰醋酸丽春红S）〜5分钟。德用0.2％盐酸溶液染色，大力直到个别蛋白带明确解决和背景染色被删除。获得丽春氏染色的形象ING基于Image J在每个车道的相对蛋白负载进一步量化和规范化TH，DAT或VMAT2结果（ 图3）。
4。组织分析：网站特定TH磷酸
在ser31或ser40磷酸的TH可以增加12儿茶酚胺细胞L-多巴的合成。虽然在每个站点的数量要增加L-多巴的合成多巴胺的大脑区域如SN和腹侧被盖区是不成立的磷酸化，有证据表明，ser31磷酸化起着调节L-多巴合成10和DA合作不同的重要作用组织之间的纹状体的内容，SN，伏隔核和腹侧被盖区，10。尽管如此，列入ser40决定是必要的，因为许多研究表明，它可以影响TH的活性，磷酸化的门槛，尤其是如果达到12。
而ser19 phosphorylati不影响TH活动13,14，它可以被视为一个定点的Ca 2 +依赖的多巴胺神经元的信号，由于细胞外Ca 2 +去极化条件下12下增加ser19磷酸化是必要的。此外，还有是一个重大的ser19与ser31只有在SN和腹侧被盖区10的磷酸化的磷酸化的正相关关系，标志着ser19磷酸化状态可能影响ser31磷酸化，从而间接L-多巴合成。
站点特定的TH磷酸化化学计量学的最佳量化的样品负载的考虑：下面，准确和精确的测定特定地点的解剖组织中日磷酸化所需的注意事项。在可能的情况下，校准TH磷酸化标准应包括在样品TH磷酸化的评估。样品负荷必须考虑到ACC使每个磷酸化位点的指望。2-15固有的化学计量学法量化正在使用的抗体的动态工作范围内的磷酸化。作为最后一个音符，固有的总蛋白，每个样品的检测应还装载在标准曲线车道。这很容易实现与载体蛋白（如鼠肝）不表达TH。
- 的三磷酸化位点。ser19，ser19磷酸化的化学计量水平是最大的SN和腹侧被盖区，范围从0.15 - 0.25 2,10,11。其他的考虑是，通过我们的检测方法，ser19 PS量化的线性范围介于0.5和5.0毫微克磷酸化ser19 10。鉴于这些考虑，总的TH蛋白负载5至10毫微克（从而估计的0.75 - 2.5纳克磷酸化ser19从样品），将提供一个可靠的ser19次磷酸措施。我们使用的主要Phosphosolutions（货号＃p1580-19）1:1000稀释。
- ser31 ser31磷酸化化学计量学水平是在SN和腹侧被盖区相比，其同源终端领域的区域，范围从0.04 - 0.10 2,4,10,11较少。 ser31 PS我们的检测方法，检测线性范围介于0.5和7.0毫微克磷酸化ser31 10。鉴于这些因素，10和30毫微克之间总的TH蛋白负载（从而估计0.50 - 3.0纳克从样品的磷酸化ser31）将提供可靠的ser31TH磷酸化的措施。参见图4A为的ser31量化的例子。我们的主要抗体是一个内部的亲和纯化抗体制造21世纪生化（马萨诸塞州波士顿），磷酸化表位的特异性验证使用我们的内部标准2。
- ser40 ser40磷酸化化学计量学水平- SN和腹侧被盖区范围从〜0.02。0.06 2,4,10,11。通过我们的检测方法，SPS ER40检测线性范围为0.2和2.0毫微克磷酸化ser40 10。鉴于这些因素，10和30毫微克之间总的TH蛋白负载（从而估计0.20 - 1.8纳克的样品磷酸化ser40）将提供可靠的ser40TH磷酸化的措施。参见图4B为的ser40量化的例子。我们使用的主要Phosphosolutions（货号＃p1580-40）1:1000稀释。
5。代表结果
- SN与腹侧被盖区的多巴胺有三个读数多巴胺（或代谢物）可采取定量分析;为总清扫回收，每蛋白，每TH蛋白（纹状体，SN，伏隔核表明，腹侧被盖在下面的表1）。共有SN和腹侧被盖区多巴胺恢复是相当的可比性，6-9两到三个冠状切片解剖2纳克之间不等。多巴胺恢复正常化的总蛋白，表明THA受雇于吨，根据解剖方法，腹侧被盖区将有更大的多巴胺，平均每人总蛋白6-8 ng / mg蛋白在SN和9-10毫微克/毫克蛋白质在腹侧被盖区，4。最后，多巴胺总TH恢复正常化，还应该揭示了SN和腹侧被盖区之间的差异，在腹侧被盖区10，0.2和0.8之间不等，吴多巴胺每毫微克之间的两个地区2,10日蛋白。
多巴胺地区 共有伤残康复 多巴胺每毫克蛋白 多巴胺每纳克TH 纹状体 214±16 165±13 0.56±0.11 的SN 8.4±0.8 6.1±0.5 0.18±0.03 核交流cumbens 60±6 75±4 0.77±0.03 腹侧被盖区 6.0±1.0 9.2±1.4 0.22±0.03 - 总蛋白：TH，DAT，VMAT2使用校准的TH蛋白标准量化，更多的TH恢复SN比从解剖的腹侧被盖区（60纳克在SN和26纳克在腹侧被盖区2）。然而，时归蛋白质，这种关系颠倒，每在腹侧被盖区〜3总蛋白TH - 5倍，比在SN（〜0.32纳克/μg蛋白在VTA和在SN〜0.09）4， 10。
SN和腹侧被盖区的DAT复苏的预期是相似的，稍微恢复在腹侧被盖区为总蛋白或为总TH恢复4。值得注意的是，相比要少得多，在这些地区丰富的DAT蛋白是同源终端领域的地区4 VMAT2为总蛋白的恢复是在腹侧被盖区与SN 4。然而，当标准化的TH蛋白，有恢复在SN 4稍大。 - 特定网站从多项研究TH磷酸化 ，有一致的结果，在ser19，ser31，ser40磷酸化在SN和腹侧被盖区的数量，也关系同源终端领域的区域。 ser19磷酸化，特别是在SN和腹侧被盖区（0.2-0.3）相比，纹状体和伏隔核（0.05-0.15）2,4,7,10,11。 ser31磷酸化是明显在SN和腹侧被盖区相比，其同源终端领域的地区，这的2,4,7,10,11 somatodendritic地区之间〜0.06 - 0.10。抑制芳香酸脱羧酶国安局-1015期间，在ser31磷酸化增加2倍，在腹侧被盖区只有10。在SN 0.02和0.05，ser40磷酸范围VTA和一般这种化学计量学不显著不同于同源终端领域的地区2,4,7,10,11。
图1。多巴胺读数从一个组织剥离。
图2。孤立的中脑多巴胺能神经纤维的夹层技术。解剖黑质（SN）的腹侧被盖区（VTA）的技术。 1。取出覆皮层和海马（这些结构已经在上面的图片中删除）。 2。做一个垂直切割分离色素面积的SN从腹侧被盖区。 3。使背外侧部分的SN以上达到或接近中线的横向切。 4。逗的SN离脑干休息。一旦SN已被删除，同样挑逗腹侧被盖区远离其余的脑。注：本节通常是在观察坐标，相对于前囟门在5.7美联社。
图3。第二 （最后）的总蛋白负载丽春红S染色图像J分析正常化。丽春红S的大鼠黑质样品的总次测定的蛋白质染色。第一个五年车道形成的左侧是标准的总次曲线，以28μg蛋白大鼠肝匀浆被添加到镜像，从黑质样品的蛋白质负荷。旁边车道包含分子量（MW）的标记。大鼠黑质样品，其余车道包含〜28μg蛋白。根据每个样品的蛋白浓度BCA法测定蛋白质的负载。然而，尽管应该是平等的负载，有黑暗丽春红S染色之间的样本显示轻微的变化ImageJ的分析来分析每个样品丽春红S染色金额正常化，这是纠正的蛋白质含量的变异。
图4。代表TH控制和治疗的磷酸化的结果。代表ser31磷酸化酪氨酸羟化酶（PTH）和ser40生理盐水和甲基安非他明治疗大鼠PTH西方印迹，从先前的研究4。 SER 31 PTH在大鼠黑质样品。标定辑31 PTH标准曲线范围从0.3毫微克至2.0纳克，检测线性范围内。以前总TH水平的Western blot分析的基础上，每个样品装入6纳克总TH。 ser40 PTH在大鼠腹侧被盖样品标定ser40 PTH标准曲线的范围从0.2毫微克至1.5纳克，检测线性范围内。以前总TH水平的Western blot分析的基础上，9纳克总TH加载每个样品。
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Discussion
正如图1中所述，上面详细介绍的方法应该产生多巴胺和调节蛋白TH，的DAT，从一个样品SN或腹侧被盖区VMAT2的大鼠或小鼠获得多个读数。再次，开展这项协议的好处是，研究人员可以得到多巴胺是如何调节体内几乎所有的实验范式下，这样做，保存在任何所需的动物数量减少的重要实验资源的业务相匹配的读数实验。
这是绝对必要的，研究者观察在夹层（4℃），存储组织（至少-70℃），在冰冷的高效液相色谱法缓冲组织超声（贮藏温度后立即拆除超声）规定的温度要求，随后颗粒形成和处理。一旦沉淀超声和SDS溶液中煮沸，样品可能继续是弗思ER在室温下处理。存储归档的高效液相色谱分析样品的样品缓冲液用于蛋白质分析的样品应在-80°C。
再次，该协议的主要优势是先天的方式运作，比赛结果与体内的多巴胺调节。此外，正火多巴胺的组织读数标记的多巴胺能神经纤维（TH，DAT）的研究者提供的保证措施解剖SN或腹侧被盖区的一致性和准确性。由于多巴胺在成瘾，精神障碍，运动场馆的参与，这个协议可受聘在许多实验。一个值得注意的限制是TH的磷酸化结果的解释应是保守的，因为它不会在这个时候，在ser31或ser40磷酸化增加体内增加L-多巴合成所需的程度。然而，如前所述，有EVidence ser31磷酸调节L-多巴的合成，并具有调节中枢神经系统2,10总多巴胺组织内容的作用。在这个时候，TH蛋白和TH磷酸化的标准尚未投放市场。然而，这个实验室一直保持和扩大基于这样的标准后，那些使用时TH 在体内磷酸化调控的第一篇论文，出版了11。尽管如此，它是可能的正常化多巴胺的组织内容，以恢复这些离散的地区使用该协议的第蛋白质。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作，并作为引2,10，提供了资金，部分研究给予奖励为MF的Salvatore从美国联邦老龄化研究，爱德华·斯蒂尔斯信托基金和路易斯安那州西北的生物医学研究基金会，艾克Muslow博士前奖学金Pruett学士学位，路易斯安那州立大学健康科学中心什里夫波特。
Materials
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HPLC system: |
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The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system. |
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The column is maintained at 30-45 °C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run. |
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The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data. |
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Pump: Shimadzu LC-10AD |
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| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | J.T. Baker | 4095-02 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG | |
| Glycerol | Sigma | G8773-500 mL | |
| PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG | |
| dPBS | Gibco | 21600-069 | |
| Tween20 | Sigma | P1379-500 mL | |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| Ponceau S | Fluka | 81460 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G | |
| Dithiothreitol | Sigma | D-9163 | |
| Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL | |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo-Fisher Scientific | 23223 | |
| Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 | |
| [125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer | ||
Table 2. Specific reagents. |
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| 10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 | ||
| 1% SDS (pH to 8.2) | 10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20 | ||
| Copper II Sulfate Solution | 1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20 | ||
| 3X Sample Buffer | Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample. | ||
| 1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 | ||
| 10X Running Buffer (Makes 4 L) | Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g | ||
| 10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) | Glycine 360 g Trizma Base 96 g | ||
| Ponceau | Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL | ||
| .2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 | ||
| PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) | PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL | ||
| 10X Blot Buffer (Makes 4 L) | Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g | ||
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas. |
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Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11. |
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References
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