Summary
في هذا البروتوكول ونحن لشرح كيفية بناء الغرف المخصصة التي تسمح بتطبيق حقل كهربائي مباشر الحالية لتمكين الوقت الفاصل بين التصوير من الدماغ العصبية مشتقة الكبار إزفاء الخلية تمهيدا خلال انجذاب غلفاني.
Abstract
وقد أدى اكتشاف الجذعية العصبية والخلايا الاصلية (وهو ما يسمى خلايا السلائف جماعي العصبية) (الشخصيات) في دماغ الثدييات الكبار لمجموعة من البحوث التي تهدف إلى الاستفادة من خصائص متعددة القدرات والتكاثري من هذه الخلايا لتطوير استراتيجيات neuroregenerative. A خطوة حاسمة لنجاح هذه الاستراتيجيات هو تعبئة الشخصيات نحو موقع الآفة أو بعد زرع الخارجية لتعزيز الاستجابة للالسلائف الذاتية التي تم العثور عليها في المنطقة المحيطة بالبطين من الجهاز العصبي المركزي. وفقا لذلك، من الضروري لفهم الآليات التي تشجع، توجيه، وتعزيز الهجرة NPC. عملنا يركز على الاستفادة من حقول التيار الكهربائي المباشر (dcEFs) لتعزيز والهجرة مباشرة NPC - وهي ظاهرة تعرف باسم انجذاب غلفاني. الذاتية المجالات الكهربائية الفيزيولوجية يعمل واشارات حاسمة للهجرة الخلايا خلال التطور الطبيعي وإصلاح الجرح. تعطيل الدوائيةعبر أنبوب العصبي في الأجنة المحتملة قنفذ البحر يسبب تشوهات في النمو الحاد 1. في سياق التئام الجروح، ويرتبط بشكل مباشر على معدل إصلاح القرنية الجرحى مع حجم إمكانيات الجرح الظهارية الذي ينشأ بعد الإصابة، كما يتضح من تعزيز الدوائية أو تعطيل هذا dcEF 2-3. لقد أثبتنا أن اللجان التحضيرية الوطنية تحت البطانة العصبية الكبار الخضوع الهجرة السريع وإخراج المهبطي في المختبر عند تعرضها إلى dcEF يطبق خارجيا. في هذا البروتوكول وصفنا تقنيات المختبر لإنشاء مقايسة انجذاب غلفاني بسيطة وفعالة لتسوية عالية، على المدى الطويل مراقبة موجهة الخلية إزفاء الجسم (الهجرة) على مستوى وحيدة الخلية. وهذا الاختبار تكون مناسبة للتحقيق في الآليات التي تنظم تنبيغ dcEF في الحركة الخلوية من خلال استخدام الفئران المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب، RNA قصيرة التدخل، أو منبهات مستقبلات محددة / الخصوم.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل مع الحيوانات من جامعة تورونتو لحيوانات جنة رعاية فقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية (البروتوكول رقم 20009387). يجب أن يتم تنفيذ الطرق التالية باستخدام أدوات معقمة والتقنيات، في الصفحي هود تدفق حيثما ينطبق ذلك.
في النص أدناه بروتوكول، فإن عبارة "EFH-SFM" يشير إلى وسائل الإعلام الحرة تستكمل مع مصل عامل نمو البشرة، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية والهيبارين. يستخدم EFH-SFM عند التحقيق في انجذاب غلفاني من الشخصيات غير متمايزة لأن هذه الشخصيات mitogens الحفاظ على دولتهم في 4 غير متمايزة. عند التحقيق في انجذاب غلفاني من الشخصيات التي يسببها على التمايز إلى أنواع الخلايا الناضجة، "FBS-SFM" يشير إلى وسائل الإعلام الحرة المصل تستكمل مع مصل بقري جنيني 1٪. FBS يعزز تمايز الشخصيات في الظواهر العصبية الناضجة 5.
1. العزلة وثقافة العصبية السلائف (غيرهو مبين في الفيديو)
- تخدير ماوس CD1 (6-8 أسابيع من العمر) مع isofluorane والتضحية عبر خلع عنق الرحم.
- اخماد الرأس في الايثانول 70٪ وقطع رأس الحيوان مع مقص تشريح حادة.
- في حين الضغط على الرأس مع ملقط جراحي، وإزالة الجلد على السطح الظهري لفضح الجمجمة.
- وباستخدام مشرط لا. 11 شفرة، يسجل الجمجمة في الجيب الجبهي على طول محور الناصف الوحشي، وكذلك على طول الدرز السهمي في الاتجاه rostrocaudal.
- قشر العظام الجدارية بعيدا عن الرأس مع عدم وجود. 7 ملقط المنحني، مع الحرص على عدم اختراق أنسجة المخ.
- إدراج ملعقة رقيقة تحت الدماغ بدءا من تحت المخيخ والتقدم نحو المصابيح حاسة الشم. في حين عقد الجمجمة في مكان مع ملقط، وسحب بلطف الدماغ من الجمجمة ووضع على الفور في الجليد الباردة السائل النخاعي الاصطناعي (انظر صفات أدناه).
- تحت المجهر تشريح، وذلك باستخدام العقيمةقطع مقص وملقط تشريح الدماغ إلى النصف على طول خط الوسط. تدوير كل نصف الكرة بحيث الإنسي (قطع) عن سطح البحر وتواجه صعودا.
- تحديد نصف الكرة، ومع السطح الإنسي التي تواجه التصاعدي، حدد موقع splenium من الجسم الثفني (المنطقة الخلفية من الجسم الثفني).
- إجراء شق من سطح القشرة إلى splenium من الجسم الثفني على طول محور ظهري بطني.
- قشر القشرة قطعي نحو البصلة الشمية لفضح جدران الإنسي والجانبية للبطين الوحشي.
- تدوير نصف الكرة بحيث يواجه السطح الظهري إلى أعلى، واستخدام microscissors المنحني لقطع الجدران وجمع يتعرض الإنسي والجانبية، والتي تحتوي على منطقة حول البطينات الدماغية حيث يقيم الشخصيات 6.
- كرر الخطوات من 1،8-1،11 لنصف الكرة الأرضية الأخرى.
- ماصة الأنسجة المعزولة إلى 7 مل من محلول التربسين (انظر صفة أدناه) في أنبوب سم مكعب 15، ووضع أنبوب على الروك في C ° 37حاضنة لمدة 25 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، نضح طاف، و resuspend الأنسجة في 2 مل من محلول التربسين المانع (انظر صفة أدناه).
- يسحن بلطف الأنسجة مع صغيرة بئر مرات باستور 30-50 ماصة بعناية لتجنب فقاعات الهواء.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، نضح طاف، و resuspend في 1-2 مل من SFM (انظر صفة أدناه) بواسطة الطحن وبيليه 3-5 مرات.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق، نضح طاف و resuspend في 1 مل من SFM + EFH.
- عد كثافة الخلية يعيش مع وhaemocytometer وحة الخلايا في قارورة T25 الثقافة في مناطق ذات كثافة من 10 خلية لكل ميكرولتر في SFM + EFH.
- السماح للثقافة أن تنمو دون عائق لمدة 7 أيام لانتاج التعويم الحر neurospheres الابتدائية تتألف من الشخصيات.
2. انجذاب غلفاني غرفة التحضير
- المكان 3 مربع الزجاج لا. تغطية زلات 1 (22 × 22 × 0،17 مم) طNA زجاجة من حمض الهيدروكلوريك 6N بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، استخدم الماس طرف زجاج لقطع لشرائح 6 قطع مستطيلة (22 × 5 × 0،17 مم) من الزجاج من أي مربع. تغطية زلات 1.
- نقل زلات حمض غسلها مربع ومستطيل زلات إلى الصفحي هود التدفق. غسل شرائح مستطيلة ومربعة الأولى مع الايثانول 70٪، ثم بالماء ثقافة الجودة الأنسجة تعقيمها، والسماح ليجف على كيم مسح (على العقم وأضاف، قد يسمح الزجاج لالهواء الجاف).
- تطبيق الشحوم فراغ في محيط سطح واحد من الشرائح الزجاجية مربع، وختم لهم قاعدة 60 مم أطباق بتري بلاستيكية.
- تطبيق الشحوم فراغ على طول محور واحد طويل سطح الزجاج شرائط مستطيلة، وختم لهم حواف الآخر من الشرائح الزجاجية مربع (بحيث تكون موازية لبعضها البعض) من أجل إنشاء حوض المركزية.
- UV-تعقيم غرف على الأقل 15 دقيقة في الصفحي هود التدفق.
- ماصة 250-300 ميكرولتر من بولي-L-lysiشمال شرق على الحوض الصغير للدوائر المركزية واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
- ما يقرب من 15 دقيقة قبل نهاية فترة الحضانة، وإعداد الحل Matrigel (انظر صفة أدناه).
- نضح في بولي-L-يسين، وغسل أحواض وسط مع 1 مل من الماء تعقيمها، وماصة 250-300 ميكرولتر من حل لMatrigel على أحواض المركزية.
- احتضان الدوائر في C ° 37 لمدة 1 ساعة.
- نضح الحل Matrigel وغسل بلطف مع أحواض المركزي 1-2 مل من SFM.
- ماصة 100 ميكرولتر من EFH-SFM أو FBS-SFM على أحواض للوسط ونقل الدوائر انجذاب غلفاني على خشبة المسرح المجهر من العد.
- ماصة مل 3-4 من الثقافة التي تحتوي على neurosphere في طبق بتري 60 مم ونقل طبق بيتري إلى مرحلة المجهر العد.
- إلى هدف عرضها 5X، استخدم ماصة نقل P10 5-8 neurospheres كله (ما يصل إلى أربعة في وقت واحد) على الحوض الصغير وسط كل انجذاب غلفانيغرفة دون الانفصال لهم، ونشر بعناية neurospheres حول الحوض الصغير دون تعطيل وسط الركيزة Matrigel.
- إضافة ميكرولتر من 150-200 إضافية EFH-SFM أو FBS-SFM على وأحواض المركزية.
- نقل الدوائر انجذاب غلفاني ° C إلى 37، 5٪ CO 2، حاضنة مرطب 100٪ لل17-20 ساعة (إذا تحليل الشخصيات غير متمايزة) للسماح للneurospheres على الانضمام إلى الركيزة Matrigel وفصل واحد في الخلايا كما هو موضح في الشكل (1) . إذا تحليل الشخصيات المتباينة، ينبغي أن تمتد فترة الحضانة إلى 69-72 ساعة للسماح للتمايز الخلايا.
3. تعيش خلية الوقت الفاصل بين التصوير
- السماح للخلية الحية التصوير نظام للتوازن في 37 ° C، 5٪ CO 2 لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل الشروع في تسجيل الوقت الفاصل بين.
- قطع قطعتين 12 سم من 1 مم سلك فضي، لفائف لهم من نهاية واحدة، ووضعها في كلوروكس بليتش لمدة 20 دقيقة لتشكيل جي / أجكل الأقطاب الكهربائية.
- نقل الدوائر انجذاب غلفاني على خشبة المسرح المجهر من العد وتحديد أي غرفة سيتم استخدامها لخلايا الحية التصوير تحليل الهجرة على أساس المعايير التالية: ط) ينبغي أن يكون تقريبا neurospheres فصلها تماما في الخلايا واحد والثاني) الخلايا ينبغي أن يتمتع الأشكال التضاريسية جولة مع قليل إلى عدم العمليات تمتد من أجسام الخلايا.
- نقل غرفة انجذاب غلفاني المحددة في الصفحي هود تدفق، جنبا إلى جنب مع أي مربع منفصلة. 1 زلة غطاء الزجاج والشحوم فراغ.
- غسل غطاء ينزلق الأولى مع الايثانول 70٪، ثم تعقيمها بالماء، وتطبيق شريط من الشحوم فراغ على اثنين من حواف متوازية من الانزلاق الغطاء.
- نضح وسائل الإعلام الثقافة من الحوض الصغير المركزية للغرفة، ثم وضع غطاء بسرعة الانزلاق (الشحوم من جانب أسفل) على هذه الدائرة أن بقية شرائح الشحوم على اتجاهين متوازيين شرائح مستطيلة من الزجاج، على نحو فعال خلق سقفإلى الدائرة.
- ماصة 100 ميكرولتر من جديد EFH-SFM أو FBS-SFM في الحوض الصغير المركزية عن طريق عمل شعري.
- استخدام الشحوم فراغ لخلق حدود لحمامات السباحة وسائل الإعلام الثقافة على كل نهاية الحوض الصغير المركزية، كما هو مبين في الشكل 2.
- قطع قطعتين 15 سم من أنابيب PVC، واستخدام حقنة سم مكعب 10 مع إبرة قياس 18 إلى حقن بعناية الاغاروز حل في أنابيب، وضمان تشكيل فقاعات لا في أنابيب، والسماح للهلام لترسيخ لمدة 5 دقائق.
- نقل غرفة انجذاب غلفاني لنظام الخلية الحية التصوير، جنبا إلى جنب مع أنابيب هلام الاغاروز، جي / أقطاب أجكل، وزوج من 60 مم فارغة أطباق بتري التي سيتم استخدامها وثقافة الإعلام الخزانات وسوف تحتوي على جي / أقطاب أجكل. السماح للغرفة انجذاب غلفاني للراحة في 37 ° C، 5٪ CO 2 لمدة 20-30 دقيقة البيئة.
- خلال هذا الوقت، وإعداد الأغطية من الأطباق الفارغة وبيتري 2 غطاء الطبق غرفة انجذاب غلفاني في بتري بواسطة حفر ثقوبلهم في دريميل اداة أو ما شابه ذلك كما هو موضح في الشكل 3.
- ماصة 1-1،5 مل من EFH-SFM أو FBS-SFM على جانبي الحوض الصغير المركزية، و 7-8 مل من SFM في كل طبق بتري فارغة. طبق بتري مكان واحد على كل جانب من الحوض الصغير غرفة انجذاب غلفاني المركزي ومكان واحد جي / أجكل الكهربائي في كل طبق. جسر الفجوة بين غرفة انجذاب غلفاني وأطباق بتري لإنشاء الاستمرارية الكهربائية مع الجسور هلام الاغاروز، كما هو مبين في الشكل 4.
- توصيل الأقطاب الكهربائية جي / أجكل إلى مصدر طاقة خارجي، مع مقياس التيار الكهربائي في سلسلة لقياس التيار الكهربائي، وتشغيل التيار الكهربائي. استخدام الفولتميتر لقياس قوة الحقل الكهربائي مباشرة عبر الحوض الصغير المركزية، وضبط إخراج التيار الكهربائي حتى يتم تحقيق المطلوب شدة المجال الكهربائي (للفحوصات التي أجريت في هذا المختبر الاستفادة من قوة dcEF من 250 بالسيارات / ملم مع التيار الكهربائي بين 1 و 1.5 مللي أمبير).
- املبادراتالشركة المصرية للاتصالات وحدة مرور الزمن على نظام الخلية الحية التصوير، والسماح للتجربة لخوض المبلغ المطلوب من الوقت. بعد الانتهاء من الفحص، وتحديد الخلايا في بارافورمالدهيد 4٪ للتحليل المناعية القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحليل يكشف عن أن الحركية في وجود dcEF بالسيارات / 250 مم، عرض الشخصيات غير متمايزة انجذاب غلفاني الموجهة للغاية وسريعة نحو القطب السالب (الشكل 5A، الفيلم 1). في حالة عدم وجود dcEF، لوحظ حركة عشوائية من الخلايا (الشكل 5B، فيلم 2). في هذه القوة الميدانية،> 98٪ من الشخصيات غير متمايزة ترحيل لساعة كاملة ل6-8 التي كانت تصوير، ومنذ الخلايا الميتة لا ترحيل هذا يشير إلى أنها لا تزال قابلة للحياة خلال هذه الفترة في وجود أو غياب من dcEF.
الظواهر المتباينة الخضوع الهجرة لا تذكر سواء في وجود وعدم وجود dcEF (أفلام 3، 4). مجموعات فرعية من الخلايا المتمايزة توسيع نطاق العمليات التي تميل إلى محاذاة عموديا على اتجاه dcEF، ولكن يلاحظ أي جسم الخلية ملحوظ إزفاء.
المناعية يتحقق من الشخصيات المحافظة expressio إيجابيةن من nestin السلائف علامة العصبية بعد 6 ساعة من التعرض dcEF (الشكل 6A). في المقايسات التي تنطوي على الشخصيات التي يسببها على التمايز إلى الظواهر ناضجة، فإن غالبية الخلايا الناضجة تعبر عن علامة نجمية الدبقية بروتين لييفي الحمضية (GFAP) بعد 6 ساعة من التعرض dcEF (الشكل 6B).
كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذه التحليلات على النحو التالي: الماوس المضادة للnestin (1:400، ميليبور، كندا)، والأرانب بولكلونل حيدة النسيلة المضادة للGFAP (1:500، سيغما، كندا). كانت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في هذه التحليلات على النحو التالي: الماعز المضادة للماوس مترافق مع Alexafluor 568 (1:400، إينفيتروجن-Gibco، كندا)، والماعز المضادة للأرنب مترافق مع Alexafluor 488 (1:400، إينفيتروجن-Gibco ، كندا).
الشكل 1. Neurospheres الانضمام إلى الركيزة Matrigel وdissociيأكلون في الخلايا واحدة بعد 17 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2، 100٪ الرطوبة في EFH-SFM.
الشكل 2. توضيحات من غرفة انجذاب غلفاني. وتستخدم شرائح من الشحوم فراغ لخلق مجموعة من وسائل الإعلام الثقافة على جانبي الحوض الصغير المركزية.
الشكل 3. تخطيطي من الثقوب التي ينبغي حفر في الأغطية غرفة انجذاب غلفاني والخزانات ثقافة المتوسط. وتستخدم القطر مم 7 ثقوب في كل من الأغطية لإدراج أنابيب هلام الاغاروز. يتم استخدام الإطارات مم 4 ثقوب في غطاء للغرفة انجذاب غلفاني لقياس الجهد الكهربائي مباشرة عبر الحوض الصغير المركزية باستخدام الفولتميتر. قطر مم 4 ثقب في الغطاء من ثقافة إعادة المتوسطةservoir هو السماح القطب جي / أجكل لتبرز من غطاء الطبق للاتصال التيار الكهربائي.
الشكل 4. توضيحات التجمع غرفة انجذاب غلفاني لمرور الزمن التصوير. غرفة انجذاب غلفاني هو طبق بتري المركزية، التي ومطلي الخلايا. وسائل الإعلام داخل السكن وسط طبق بتري غرفة انجذاب غلفاني إما SFM + EFH أو SFM + 1٪ FBS. يتم تعبئة أطباق بتري على جانبي الغرفة انجذاب غلفاني مع SFM، وتحتوي أيضا على الأقطاب جي / أجكل. وترتبط هذه الأقطاب الكهربائية إلى مصدر طاقة خارجي، وسد الثلاثة أطباق بتري مع الاغاروز جل الجسور يشكل دائرة كاملة.
الشكل 5. في حاضرام من الشخصيات والمفاضلة dcEF الخضوع السريع الهجرة galvanotactic نحو القطب السالب (A)، في حين أنه في حالة عدم وجود dcEF الخلايا الخضوع الهجرة العشوائية شعاعي (B).
الشكل 6. المناعية يتحقق من أن تبقى اللجان التحضيرية الوطنية nestin إيجابية السلائف غير متمايزة بعد 6 ساعة من التعرض dcEF (A)، والتي يسببها للتمييز الشخصيات في الغالب تعبر عن ناضجة GFAP علامة نجمية بعد 6 ساعة من التعرض dcEF (B).
الفيلم 1. الزمن الفاصل بين الفيديو من الشخصيات غير متمايزة تتعرض لdcEF. الشخصيات مطلي على غرف لمدة 17 ساعة انجذاب غلفاني في SFM + EFH، ثم تعريضها لمن 250 بالسيارات / مم الهجرة المعرض dcEF السريع وموجهة نحو القطب السالب. 1 ثانية من الفيديو = 15 دقيقة الوقت الحقيقي. انقر هنا لمشاهدة موتتنافس.
فيلم 2. الزمن الفاصل بين الفيديو من الشخصيات غير متمايزة في حالة عدم وجود dcEF. الشخصيات مطلي على غرف لمدة 17 ساعة انجذاب غلفاني في SFM + EFH، وتصويرها ثم في حال عدم وجود dcEF التطبيقية الخضوع الهجرة العشوائية. 1 ثانية من الفيديو = 15 دقيقة الوقت الحقيقي. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
الفيلم 3. الوقت الفاصل بين الشخصيات المتباينة الفيديو من يتعرض لdcEF. الشخصيات مطلي على غرف لانجذاب غلفاني 69-72 ساعة في FBS + SFM، ثم تعريضها لمن 250 بالسيارات / مم الهجرة المعرض dcEF القليل جدا في أي اتجاه. 1 ثانية من الفيديو = 15 دقيقة الوقت الحقيقي. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
الفيلم 4. الوقت الفاصل بين الشخصيات المتباينة من الفيديو في غياب لdcEF. مطلي على الشخصيات تشا انجذاب غلفانيmbers ل69-72 ساعة في FBS + SFM، ومن ثم تصويرها في حال عدم وجود dcEF التطبيقية يحمل القليل جدا من الهجرة في أي اتجاه، على غرار الشخصيات المتباينة التي تتعرض لdcEF. 1 ثانية من الفيديو = 15 دقيقة الوقت الحقيقي. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تكييف هذا البروتوكول من أساليب راسخة من الدراسات السابقة 7-9. ويمكن بناء غرف Galvanotactic باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات المختلفة، بما في ذلك بناء كوب منفصلة بشكل جيد لاحتجاز بذر الخلية، أو باستخدام الليزر التذرية CO 2 لمن الحوض الصغير الدقيق microfabrication المركزية 10،11. قد يكون بعض التقنيات أكثر شاقة مكلفة أو من غيرها. وقد وصفت لدينا مقايسة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لبناء غرفة انجذاب غلفاني NPC استخدام المواد التي توجد عادة في معظم المختبرات بيولوجيا الخلية. لدينا بروتوكول يتضمن، مرطب ساخنة، CO 2 حاضنة التنظيم الذي يحيط الخلية الحية التصوير نظام للحفاظ على الخلايا تحت الظروف المثلى للتصوير المستمر على المدى الطويل. عدم وجود جهاز مثل وجود قيود على بعض التقنيات التي تم نشرها مسبقا 9،12.
أظهرت الأعمال الأخيرة من قبل مجموعة أخرى مماثلة GALVAnotactic سلوك الخلايا من خط الخلية الحصين 13، باستخدام بروتوكول مختلفة وأكثر انجذاب غلفاني تصميم غرفة كثيفة العمالة. مقايسة لدينا هو أنيق وخاصة من حيث أنه يسمح تحليل من السكان بدءا من الخلايا متطابقة - مزارع الخلايا الأولية من الشخصيات neurosphere غير متمايزة المشتقة - التي تعرضت لظروف مختلفة مما يسمح مقارنة بين خصائص كل المهاجرة من خلايا غير متمايزة ومتباينة، ببساطة عن طريق تعديل العوامل المستخدمة لاستكمال وسائل الإعلام الثقافة داخل غرفة انجذاب غلفاني.
الفحص الواردة في هذا البروتوكول هو أداة قوية لتتبع طويلة الأجل وتحليل انجذاب غلفاني NPC، وربما غيرها من أنواع الخلايا التي تخضع الهجرة galvanotactic 14،15. كما هو الحال مع أي بروتوكول، قد الفروق الدقيقة في إعداد وتنفيذ خطوات معينة في هذا البروتوكول يؤدي إلى نتائج ناجحة. ينبغي للمبادئ التوجيهية التالية واقتراحاتsist في التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول:
- لمنع الخلايا من الموت تمر الكهربائية الحرارة الحالية المرتبطة، حسبت أبعاد غرفة انجذاب غلفاني للحد من آثار التدفئة الجول 16. الحرارة المتولدة في غرفة تتناسب مع مربع التيار المار من خلال ذلك، والذي هو بدوره يتناسب مع مساحة المقطع العرضي للغرفة انجذاب غلفاني. ننصح الحفاظ على مساحة المقطع العرضي للغرفة و2،04 مم 2 (12 مم × 0،17 مم).
- يمكن أن تجمع بعد 7 أيام من neurospheres الثقافة وفصلها إلى خلايا واحد وreplated في النمو عامل الظروف (أ العملية المشار إليها باسم "الركض") لانتاج neurospheres الثانوية. نحصل على نتائج أفضل باستخدام لدينا neurospheres التي خضعت أقل من ثلاثة مقاطع (الحد الأقصى 21 يوما في الثقافة)، مع انخفاض ملحوظ في القدرات المهاجرة عند استخدام neurospheres التي تم passaged أكبر numbeص من المرات. وهذا يتفق مع عملنا السابق مما يدل على أن على المدى الطويل الثقافات تغيير حركية الخلية 17.
- عند اختيار غرفة تحتوي على انجذاب غلفاني الشخصيات للمراقبة، فمن المهم لاختيار غرفة في الخلايا التي تستمد neurosphere يكون جيدا فصلها من أجل السماح التحليلات الحركية الدقيقة. إذا لم نأت neurospheres جيدا (يتم الالتزام الشخصيات لبعضها البعض ولا يمكن أن يرسم)، وتحليل سلوك الخلية الفردية المهاجرة تصبح شبه مستحيل. ينبغي السماح للثقافات المزيد من الوقت لفصل قبل المراقبة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الخلايا التي هي على مقربة من بعضها البعض عرقلة جسديا هجرة الخلايا المجاورة. وقد أظهرت تحليلاتنا أن الخلايا وضعه على هيئة واحدة بعيدا عن الخلية الخلية المجاورة لها أقرب ترحيل بسرعات أكبر بكثير من الخلايا التي تتجمع معا بالقرب من مركز للneurosphere فصل، ولكن مع المساواة وخيمةctedness.
- إذا كان هناك وفرة من عمليات تمتد من الشخصيات، وهذا هو مؤشر على أن الخلايا بدأت في التفريق، وبالتالي فهي ليست التمثيل الحقيقي للسكان غير متمايزة. وهناك فائدة من إعداد غرف انجذاب غلفاني في ثلاث نسخ هي التي يمكن أن تكون ثابتة المتبقية مجلسين التي لم يتم اختيارها لمرور الزمن التصوير مباشرة بعد فترة من الطلاء المحتضنة (الخطوة 2.16)، وimmunostained للتحقق من الملف تمايز الخلايا.
- لأفضل النتائج ينبغي أن تكون وسائل الإعلام الثقافة وتستكمل الطازجة كل يوم على ما هو مطلوب منه.
- والوقت الفاصل بين الصور والتحليلات اللاحقة الحركية شديدة الحساسية للاضطراب من العينة. يجب وضع المجهر التصوير الخلية الحية على جدول لتقليل الاهتزازات الهواء، ونظام لا ينبغي مضطرب خلال التجريب.
لدينا مختبر الصور بشكل روتيني NPC galvanotمحور لمدة 6-8 ساعة، على الرغم من إجراء ما يصل إلى 15 ساعة التحليلات. على مدى الفترات 15-HR، انخفض dcEF عبر الدائرة بالسيارات من 250 / ملم إلى بالسيارات 227 / ملم (9.2٪ انخفاض). فترات أطول التصوير حتما تعديل درجة الحموضة وسائل الإعلام في غرفة، وتعديل زيادة مجال كهربائي. وبالتالي فمن المستحسن أن تحل محل وسائل الإعلام تقريبا كل ساعة 6. ومع ذلك، فقد أجرينا 8-HR NPC المقايسات انجذاب غلفاني دون استبدال وسائل الإعلام ولم يلاحظ أي موت الخلايا ملحوظ (الخلايا الميتة لا تهاجر) أو إنخفاض في الحركة الخلية، والحفاظ على خلايا سرعتها الهجرة في كافة مراحل التجربة. قد المحقق يقلل أيضا من عمق الدائرة لزيادة الاستقرار في dcEF 10.
بعد التصوير، يتم تنفيذ وحيدة الخلية تتبع تحليل الحركية على مجموعة فرعية من الخلايا المصورة باستخدام وحدة زايس Axiovision البرمجيات تتبع. ويتم اختيار الخلايا لتحليلها إذا يتم ترجمة أنها أقرب إلى حافة وneurosphere فصل واحد على الأقل بصرف النظر عن جسم الخلية خلية أقرب لها. الأساس المنطقي وراء ذلك هو لتقليل احتمال تداخل الخلايا بعضها البعض خلال تتبع، الأمر الذي سيجعل تتبع الخلايا الفردية شبه مستحيل. نحن نحلل المعلمات الأربعة التالية للهجرة:
- X محور النزوح - المسافة خلية يهاجر في اتجاه محور، وهو مواز لاتجاه dcEF.
- السرعة - المسافة بين الخط المستقيم وظائف الخلية الأولية والنهائية مقسوما على الوقت المنقضي.
- توجيه الأعضاء - محور س التشريد مقسوما على المسافة في خط مستقيم بين مواقف الخلية الأولية والنهائية.
- تعرج - سافر مسافة المسار مجموع الخلية مقسوما على المسافة في خط مستقيم بين المواقف الخلية الأولية والنهائية.
هذا الأخير معلمتين هي مؤشرات لكيفية مسار مستقيم الهجرة في اتجاه معين.
الحمار = "jove_content"> وعند استيعاب الأساليب في هذا البروتوكول، قد يرغب المحقق لتعديل بعض الجوانب الأوسع للتطبيقات. على سبيل المثال، يمكن أيضا أن يتم تعديل الفحص للتحقيق في سلوك المهاجرة من أنواع الخلايا الأخرى. ويمكن استخدام نماذج خروج المغلوب وراثية أو تقنيات ترنسفكأيشن سيرنا لاستهداف الجينات في المصالح التي قد تلعب دورا في الهجرة الخلية أو تنبيغ من dcEF في الحركة الخلية. في المختبر لدينا، قمنا بتعديل غرفة انجذاب غلفاني للسماح المستمر عبر وسائل الإعلام الثقافة نضح جديدة داخل الحوض الصغير المركزية خلال التجريب 18. والركيزة مناسبة والثقافة وسائل الإعلام تحتاج إلى تحديد لأنواع الخلايا الأخرى، وينبغي تعديل مدة بذر الخلية قبل التصوير عند الضرورة. وتجدر الإشارة إلى أن أبعاد الغرفة تحتاج إلى تعديل تبعا لسمك النسيج محل دراسة (على سبيل المثال، إذا تم وضع شريحة في غرفة النسيج). يتعين على المحقق أن تضع في اعتبارها ثار لحقل مجموعة الكهربائية، وتدفق التيار من خلال الغرفة هو يتناسب طرديا مع مساحة المقطع العرضي للغرفة، وبالتالي التوسعات الكبيرة لأبعاد الغرفة قد يؤدي إلى زيادة موت الخلايا التدفئة الجول ذات الصلة.
التقنيات الموضحة في هذا التقرير توفير أداة قوية لتحقيق المهمة، ولكن ليس على نطاق واسع دراسة، ظاهرة انجذاب غلفاني. قدرة الخلايا على الاستجابة للآثار dcEFs العلاجية مباشرة. وقد ثبت التحفيز الكهربائي (لمخ) بالفعل مفيدة في علاج مرض الشلل الرعاش، ولقد ثبت لتعزيز تكوين الخلايا العصبية قرن آمون في نموذج الفأر 19،20. ويجوز للفهم كامل للآليات الخلوية المسؤولة عن الحركة في تنبيغ dcEF الخلوية تؤدي في النهاية إلى استخدام التحفيز الكهربائي كوسيلة لتعزيز السريرية وتوجيه الهجرة الداخلية تمهيدا لمواقع الإصابة أو diseaSE لتسهيل عملية الإصلاح. ووصف الأساليب المذكورة أعلاه توفر طريقة بسيطة وقوية من التحقيق في هذه العمليات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويتم تمويل هذا العمل من قبل العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (منحة # 249669، 482986 و#) والقلب والسكتة الدماغية مؤسسة كندا (منحة # 485508). الكتاب أشكر يوسف الحايك والدكتور وان تشى لمساعدتهم في تطوير البروتوكولات التجريبية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Borgens, R. B., Shi, R. Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential. Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo. Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
- Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).
- Erickson, C. A., Nuccitelli, R. Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields. J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).
- Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent. J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).
- Li, L. Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration. Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).
- Song, B. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Huang, C. -W., Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Young, T. -H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- SATO, M. Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells. Biosystems. 88, 261-272 (2007).
- Meng, X. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).
- Zhao, M. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. The FASEB Journal. , (2002).
- Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).
- McCaig, C. D. Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential. Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).
- Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations. Nat. Med. 8, 268-273 (2002).
- Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields. PLoS ONE. 6, e23808 (2011).
- Deuschl, G. A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease. N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).
- Stone, S. S. D. Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory. J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).
