Гальванотаксис пробирного анализа нейронных клеток-предшественников Кинетика миграции извне постоянного тока электрическое поле

Summary

В этом протоколе мы покажем, как для создания пользовательских камер, что позволяет применять постоянный ток электрического поля для включения покадровой визуализации мозга взрослого человека, полученных нейронных перемещение клеток-предшественников во время гальванотаксиса.

Abstract

Открытие нервных стволовых и клеток-предшественников (в совокупности называемые нейронные клетки-предшественники) (НПС) во взрослом мозге млекопитающих привело к телу исследований, направленных на использование мультипотентных и пролиферативных свойств этих клеток для развития neuroregenerative стратегии. Важным шагом для успеха такой стратегии является мобилизация NPCs к поражению сайта после экзогенной трансплантации или для усиления ответа эндогенных предшественников, которые находятся в перивентрикулярной области ЦНС. Соответственно, она имеет важное значение для понимания механизмов, которые способствуют, направлять и повышения NPC миграции. Наша работа сосредоточена на использовании постоянного тока электрических полей (dcEFs) оказывать содействие и прямое миграции НИП - явление, известное как гальванотаксиса. Эндогенные физиологической электрического поля действовал в качестве критических сигналов для миграции клеток во время нормального развития и заживления ран. Фармакологические нарушениятранс-нервной трубки потенциал в аксолотля эмбрионов вызывает тяжелые пороки развития ^1. В контексте заживления ран, скорость ремонта ранения роговицы напрямую связана с величиной эпителиальных потенциал рану, которая возникает после травмы, как показано с помощью фармакологических повышение или нарушение этого dcEF ^2-3. Мы показали, что взрослые subependymal NPCs пройти быструю и направлены катодная миграции в пробирке при воздействии извне dcEF. В этом протоколе описываются методы нашей лаборатории для создания простых и эффективных гальванотаксиса анализа высокого разрешения, долгосрочное наблюдение направлено перемещение тела клетки (миграции) на одном-клеточном уровне. Этот анализ был бы подходящим для исследования механизмов, которые регулируют dcEF трансдукции в клеточную подвижность за счет использования трансгенных мышах или, коротко интерферирующих РНК, или специфических агонистов рецептора / антагонистов.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными обращения были одобрены Университета Торонто комитета по Уходу за животными в соответствии с руководящими принципами институциональной (протокол №. 20009387). Следующие методы должны быть выполнены с использованием стерильных инструментов и методов, в ламинарном потоке, где это применимо.

В протоколе ниже текст, фраза "EFH-SFM" относится к бессывороточной среде с эпидермальный фактор роста, основной фактор роста фибробластов и гепарин. EFH-SFM используется при исследовании гальванотаксиса недифференцированных NPCs, потому что эти митогены поддерживать NPCs в их недифференцированное ⁴ состояние. При исследовании гальванотаксиса НПС вызвать их дифференцировку в зрелые типы клеток, "FBS-SFM" относится к бессывороточной среде с 1% эмбриональной телячьей сыворотки. FBS способствует дифференциации NPCs в зрелые нейронных фенотипов ^5.

1. Выделение и культуры нейронных прекурсоров (Непоказано на видео)

1. Анестезировать CD1 мыши (6-8 недель) с isofluorane и жертвы с помощью смещения шейных позвонков.
2. Окунуть голову в 70% этанола и обезглавить животное с острыми ножницами рассечение.
3. Удерживая голову с хирургическими щипцами, снимите кожу на спинной поверхности, чтобы разоблачить черепа.
4. С помощью скальпеля и нет. 11 лезвие, забить черепа в лобной пазухи по медиолатеральная оси, а также вдоль сагиттального шва в rostrocaudal направлении.
5. Пил теменной кости от головы нет. 7 изогнутый пинцет, стараясь не проколоть ткани головного мозга.
6. Вставьте тонкий шпатель под мозг, начиная с под мозжечком и продвижения к обонятельной луковицы. Удерживая черепа в месте с пинцетом, осторожно потяните мозг из черепа и сразу же поместить его в ледяной искусственной цереброспинальной жидкости (см. рецепты ниже).
7. Под микроскопом рассечение, используя стерильныерассечение ножницами и щипцами разрезать мозг пополам вдоль средней линии. Поворот каждого полушария, так что медиальная (разреза) поверхность обращена вверх.
8. Выберите полушарии, а с медиальной поверхности, обращенной вверх, найдите Валик мозолистого тела (задней области мозолистого тела).
9. Сделать разрез от поверхности коры на валик мозолистого тела вдоль оси дорсовентральных.
10. Пил надрезанные коры к обонятельной луковице, чтобы разоблачить медиальная и боковые стенки бокового желудочка.
11. Поверните полушарии, так что спинной поверхности обращена вверх, и использовать изогнутые microscissors вырезать и собирать подвергается медиальная и боковые стенки, которые содержат перивентрикулярной регионе, где проживают NPCs ^6.
12. Повторите шаги 1.8-1.11 для другого полушария.
13. Внесите изолированной ткани в 7 мл раствора трипсина (см. рецепт ниже), в 15 мл трубки, и поместить трубку на качалке при 37 ° Cинкубаторе в течение 25 мин.
14. Центрифуги трубы на 1500 оборотах в минуту в течение 5 минут, аспирации супернатант и ресуспендируют ткани в 2 мл раствора ингибитора трипсина (см. рецепт ниже).
15. Аккуратно растереть ткань с небольшой скважины пипетки Пастера в 30-50 раз тщательно, чтобы избежать воздушных пузырей.
16. Центрифуги трубы на 1500 оборотах в минуту в течение 5 минут, аспирации супернатант и ресуспендируют в 1-2 мл SFM (см. рецепт ниже) путем растирания гранул 3-5 раз.
17. Центрифуги трубы на 1500 оборотах в минуту в течение 3 минут, аспирации супернатант и ресуспендируют в 1 мл SFM + EFH.
18. Граф жить плотность клеток с гемоцитометра и пластины клеток в культуре T25 колбу с плотностью 10 клеток на мкл в SFM + EFH.
19. Разрешить культуры расти в течение 7 дней спокойно, получая свободно плавающих первичных нейросферы состоит из NPC.

2. Гальванотаксис палаты подготовка

1. Поместите 3 квадратных стекла нет. 1 скользит крышкой (22 х 22 х 0,17 мм) яН.А. бутылку 6N соляной кислоты в течение ночи.
2. На следующий день, используйте алмазный наконечник стеклянной Для обрезки 6 прямоугольных полос (22 х 5 х 0,17 мм) стекла от площади нет. 1 скользит крышкой.
3. Передача кислотно-промытый квадратных и прямоугольных скользит скользит в ламинарном боксе. Вымойте прямоугольные и квадратные полоски сначала с 70% этанола, то с тканевой культурой класса автоклавного водой, и дайте высохнуть на Ким Wipe (для большей стерильности, стекло может быть разрешено сухой воздух).
4. Применение вакуумной смазкой по периметру одной поверхности квадратных предметные стекла, и запечатать их до основания 60 мм, пластиковые чашки Петри.
5. Применение вакуумной смазки вдоль длинной оси, одна из поверхностей прямоугольной полоски стекла, и запечатать их к противоположным краям площади предметные стекла (например, что они параллельны друг другу), чтобы создать центральный желоб.
6. УФ-стерилизации камеры, по крайней мере 15 минут в ламинарном боксе.
7. Внесите 250-300 мкл поли-L-Лисипе на центральную впадину камер и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 часов.
8. Примерно за 15 мин до окончания инкубационного периода, приготовления раствора Matrigel (см. рецепт ниже).
9. Аспирируйте поли-L-лизин, мыть центрального желоба с 1 мл автоклавного воды и пипеткой 250-300 мкл Matrigel раствора на центральной впадины.
10. Инкубируйте камерах при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
11. Аспирируйте Matrigel решения и осторожно мыть центрального желоба с 1-2 мл УЛ.
12. Внесите 100 мкл EFH-SFM или FBS-SFM на центральной впадины и передать гальванотаксиса камер на этапе подсчета микроскопом.
13. Пипеткой 3-4 мл нейросфер содержащей культуру в 60 мм чашки Петри и передать чашку Петри на этапе подсчета микроскопом.
14. При просмотре цель 5x, использовать P10 пипетки для передачи 5-8 целом нейросферы (до четырех одновременно) на центральную впадину каждой гальванотаксисаКамера без оторвать их, и тщательно распространение нейросферы вокруг центральной корыта, не нарушая Matrigel подложки.
15. Добавить дополнительные 150-200 мкл EFH-SFM или FBS-SFM на центральной впадины.
16. Передача гальванотаксиса камер в 37 ° C, 5% CO _2, 100% увлажненном инкубаторе в течение 17-20 часов (если анализ недифференцированные НПС), чтобы нейросферы присоединиться к Matrigel подложки и распадаются на отдельные клетки, как показано на рисунке 1 . Если в результате анализа дифференцированных NPC, инкубационный период должен быть продлен до 69-72 часов, чтобы позволить дифференцировки клеток.

3. Живая клетка Time-Lapse изображений

1. Разрешить живые системы визуализации ячейки для уравновешивания при 37 ° C, 5% CO ₂ в течение как минимум 30 минут до начала записи со сжатием времени.
2. Вырежьте два 12 см кусками диаметром 1 мм серебряной проволоки, катушки их с одного конца, и поместить их в Clorox бвыщелачивания в течение 20 мин с образованием Ag / AgCl электродов.
3. Передача гальванотаксиса камер на этапе подсчета микроскопа и выбрать, какие камеры будут использоваться для живых клеток визуализации миграции анализ на основе следующих критериев: а) нейросферы должна быть почти полностью распадается на отдельные клетки и б) клетки должны обладать круглый морфологии с небольшим до никакие процессы простирается от клеточных тел.
4. Передача выбранной камеры гальванотаксиса в ламинаре, наряду с отдельными нет кв. 1 стакан скольжения крышки и вакуумной смазкой.
5. Промойте крышку скольжение сначала с 70% этанола, то с автоклавного водой, и нанесите полосу вакуумной смазки на двух параллельных краев покровного стекла.
6. Аспирируйте культуру средств массовой информации из центрального желоба в камере, а затем быстро установить крышку скольжения (Смазка-лицевой стороной вниз) на камере так, что остальные смазки полосы на две параллельные прямоугольные полоски стекла, фактически создавая крышув камеру.
7. Внесите 100 мкл свежей EFH-SFM или FBS-SFM в центральный желоб с помощью капиллярного действия.
8. Использование вакуумной смазкой для создания границ для бассейнов культуры, средств массовой информации на каждом конце центральной корыта, как показано на рисунке 2.
9. Вырежьте два 15 см куски труб из ПВХ, а также использовать 10 мл шприц с иглой 18 калибра тщательно вводят раствор агарозы в трубку, гарантируя, что ни пузырьки образуют в трубах, и позволяют закрепить гелем в течение 5 мин.
10. Передача гальванотаксиса камеру к живой системы визуализации ячейки, наряду с агарозном геле труб, Ag / AgCl электродов, и пара пустых 60 мм чашки Петри, которые будут использоваться в качестве питательной среды водоемов и будет содержать Ag / AgCl электродов. Позвольте камере гальванотаксиса на отдых в 37 ° C, 5% CO ₂ окружающей среды в течение 20-30 мин.
11. За это время подготовить крышки 2 пустые чашки Петри и крышку чашки Петри гальванотаксиса камеры путем сверления отверстийв них с Dremel или подобный инструмент, как показано на рисунке 3.
12. Внесите 1-1,5 мл EFH-SFM или FBS-SFM на обе стороны от центральной корыто, и 7-8 мл SFM в каждую пустую чашку Петри. Положите одну чашку Петри с каждой стороны от центрального желоба камеры гальванотаксиса и место одним Ag / AgCl электрод в каждом блюде. Преодоление разрыва между камерой гальванотаксиса и чашки Петри установить непрерывность электрической цепи с агарозном геле мосты, как показано на рисунке 4.
13. Подключите Ag / AgCl электродов к внешнему источнику питания, с амперметр последовательно для измерения электрического тока и включите питание. С помощью вольтметра измерить напряженность электрического поля непосредственно через центральный желоб, а также настроить выход блока питания до желаемой напряженности электрического поля достигается (анализы, выполненные в этой лаборатории используют силу dcEF от 250 мВ / мм Электрический ток от 1 до 1,5 мА).
14. InitiaТе покадровой модуль на живые системы визуализации ячейки и позволяют эксперимента для запуска нужного количества времени. После завершения анализа, зафиксировать клетки в 4% параформальдегид для стандартного анализа иммуноокрашивания.

Representative Results

Кинематический анализ показывает, что в присутствии 250 мВ / мм dcEF, недифференцированные НПС проявляют высокую направлена ​​и быстрая гальванотаксиса к катоду (рис. 5А, фильм 1). В отсутствие dcEF, случайные движения клеток наблюдается (рис. 5Б, фильм 2). При этом напряженность поля,> 98% недифференцированных NPCs мигрировать на весь 6-8 часа, за которые они загружаются, и так как мертвые клетки не мигрируют, это говорит о том, что они остаются жизнеспособными в течение этого периода в отсутствии или наличии dcEF.

Дифференцированные фенотипов пройти незначительно миграции как в присутствии и отсутствии dcEF (3 Фильмы, 4). Подмножества дифференцированные клетки распространяются процессы, которые, как правило, выровнять перпендикулярно направлению dcEF, но не заметные перемещения тела клетки не наблюдается.

Иммуноокрашивание проверяет, что НПС поддержания положительного expressioп нервной нестин маркер предшественника через 6 ч dcEF экспозиции (рис. 6а). В тестах с участием НПЦ вызвать их дифференцировку в зрелые фенотипов, большинство клеток выразить зрелых астроцитов маркер глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) через 6 ч dcEF воздействия (рис. 6В).

В качестве первичных антител, используемых в этих анализах были следующие: мышиные моноклональные анти-нестин (1:400, Millipore, Канада) и кроличьих поликлональных анти-GFAP (1:500, Sigma, Канада). Вторичные антитела, используемые в этих анализах были следующие: козел-анти-мышь сопряженных с Alexafluor 568 (1:400, Invitrogen-Gibco, Канада), и коза-анти-кролик сопряженных с Alexafluor 488 (1:400, Invitrogen-Gibco , Канада).

Рисунок 1. Нейросферы придерживаться Matrigel подложки и диссоциацииел на отдельные клетки после 17 ч инкубации при 37 ° C / 5% CO _2, 100% влажности в EFH-SFM.

Рисунок 2. Иллюстрация камеры гальванотаксиса. Полоски вакуумной смазки используются для создания пула медиа-культуры по обе стороны от центральной корыта.

Рисунок 3. Схема отверстий, которые должны быть пробурены в крышках камеры гальванотаксиса и водохранилищ культуральной среде. 7 мм, диаметр отверстия в обе крышки используются для вставки трубы в агарозном геле. Диаметром 4 мм отверстия в крышке камеры гальванотаксиса используется для измерения электрического потенциала непосредственно через центральный желоб с помощью вольтметра. Диаметром 4 мм отверстие в крышке повторного культуральной средеservoir том, чтобы позволить Ag / AgCl электрод выступает из крышки блюдо для подключения к источнику питания.

Рисунок 4. Иллюстрация гальванотаксиса камеру сборки для покадровой обработки изображений. Камера гальванотаксиса является центральной чашке Петри, в которой клетки высевают. Средства массовой информации в центральном корпусе чашки Петри камеры гальванотаксиса либо SFM + EFH или SFM + 1% FBS. Чашки Петри по обе стороны от камеры гальванотаксиса заполнены SFM, а также содержат Ag / AgCl электродов. Эти электроды подключены к внешнему источнику питания, и преодоление трех чашек Петри с агарозном геле мостов образует полную схему.

Рисунок 5. Кроме изложеСЕ dcEF недифференцированные NPCs пройти быструю миграцию galvanotactic к катоду (A), в то время как в отсутствие dcEF клетки претерпевают случайные радиальной миграции (B).

Рисунок 6. Иммуноокрашивание проверяет, что НПС остаются нестин-позитивных недифференцированные прекурсоров через 6 ч dcEF экспозиции (A), и что NPCs индуцировать дифференцировку основном выражают зрелых астроцитов GFAP маркера через 6 ч dcEF экспозиции (B).

Фильм 1. Покадровый видео недифференцированных НПС подвергается dcEF. NPCs высевали на камерах гальванотаксиса в течение 17 ч в SFM + EFH, а затем подвергаются 250 мВ / мм dcEF выставки быстрой и направленной миграции к катоду. 1 секунда видео = 15 минут реального времени. Нажмите здесь, чтобы просмотреть движениесоперничают.

Фильм 2. Покадровый видео недифференцированных NPCs в отсутствие dcEF. NPCs высевали на гальванотаксиса камерах в течение 17 ч в SFM + EFH, а затем отражаться в отсутствие прикладного dcEF проходят случайные миграции. 1 секунда видео = 15 минут реального времени. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Фильм 3. Покадровый видео дифференцированных НПС подвергается dcEF. NPCs высевали на камерах гальванотаксиса на 69-72 ч в SFM + FBS, а затем подвергаются 250 мВ / мм dcEF выставке очень мало миграции в любом направлении. 1 секунда видео = 15 минут реального времени. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Фильм 4. Покадровый видео дифференцированных NPCs в отсутствии в dcEF. NPCs высевали на гальванотаксиса чаmbers по 69-72 часов в SFM + FBS, а затем отражаться в отсутствие прикладного dcEF проявляют очень мало миграции в любом направлении, похожие на дифференцированную NPCs, которые подвергаются воздействию dcEF. 1 секунда видео = 15 минут реального времени. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Discussion

Этот протокол был адаптирован из устоявшихся методов предыдущих исследованиях ^7-9. Galvanotactic камеры могут быть построены с использованием различных методов, в том числе строительство отдельного стекла хорошо для удержания клетки посева, или с помощью CO ₂ лазерной абляции для микротехнологий центрального желоба ^10,11. Некоторые методы могут быть более трудоемкой и дорогостоящей, чем другие. Мы описали простой и экономически эффективный тест для построения камеры NPC гальванотаксиса использовании материалов часто встречаются в большинстве лабораторий клеточной биологии. Наш протокол включает в себя подогревом, увлажненный, CO ₂ регулируемых инкубатор, который окружает живая система визуализации ячейки для поддержания клеток при оптимальных условий для непрерывного долгосрочного изображений. Отсутствие такого аппарата является ограничение некоторых ранее опубликованных методов ^9,12.

Последние работы другой группы продемонстрировали похожие Galvanotactic поведение клетки гиппокампа клеточной линии ^13, использованием различных протоколов и более трудоемкие гальванотаксиса конструкция камеры. Наш анализ является особенно элегантно в том, что она позволяет анализ идентичны, начиная популяции клеток - первичных культур клеток недифференцированной нейросфер, полученных NPCs - которые были выставлены в различных условиях позволяя тем самым сравнению миграционных свойств как недифференцированные и дифференцированные клетки, просто путем изменения факторов, используемых в дополнение к культуральной среде в камере гальванотаксиса.

Анализ представленных в этом протоколе является мощным инструментом для долгосрочного отслеживания и анализа гальванотаксиса NPC, и, возможно, других типов клеток, которые подвергаются galvanotactic миграции ^14,15. Как и с любым протоколом, нюансы в подготовке и проведении определенные шаги в этом протоколе может привести к неудачным результатам. Следующие рекомендации и предложения должны, какпоклонений в успешное выполнение этого протокола:

• Чтобы предотвратить клетки от прохождения электрического тока, связанного тепловой смерти, размеры камеры гальванотаксиса были рассчитаны, чтобы минимизировать эффект Джоуля отопления ^16. Тепло, выделяемое в камере пропорциональна квадрату тока, протекающего через него, которая в свою очередь пропорциональна площади поперечного сечения палаты гальванотаксиса. Мы рекомендуем сохранении площади поперечного сечения из камеры, как 2,04 мм ² (12 мм х 0,17 мм).
• После 7 дней культуры нейросферы может быть собрана, распадается на отдельные клетки и replated в фактор роста условиях (процесс называется "пассажи") с получением вторичного нейросферы. Мы получим наши лучшие результаты, используя нейросферы, которые прошли менее чем за три прохода (максимум 21 дней в культуре), с видимым снижением миграционных возможностей при использовании нейросферы, которые были пересевать большее количесГ раз. Это согласуется с нашей предыдущей работы демонстрируя, что долгосрочные культур изменять ячейки кинетики ^17.
• При выборе камеры гальванотаксиса содержащие NPCs для наблюдения, важно, чтобы выбрать камеру, в которой нейросфер клеток, полученных из отделили а для того, чтобы обеспечить точный кинематический анализ. Если нейросферы не имеют диссоциированных хорошо (NPC привязаны друг к другу и не могут быть выделены), анализ отдельных клеток миграционное поведение станет практически невозможно. Культуры должно быть позволено больше времени, чтобы отделить до наблюдения. Кроме того, клетки, которые находятся в непосредственной близости друг от друга может физически препятствовать миграции соседних клеток. Наш анализ показал, что клетки на расстоянии не менее одной клетки тела от своих ближайших соседей клетки мигрировать в значительно большей скорости, чем клетки, которые группируются около центра диссоциированных нейросфер, хотя и с равными тяжелымctedness.
• Если есть обилие процессов простирается от NPC, это показатель того, что клетки начали дифференцироваться и, следовательно, они не являются истинным представлением недифференцированные населения. Преимущество подготовке гальванотаксиса камеры в трех экземплярах в том, что оставшиеся две камеры, которые не выбраны для покадровой визуализации может быть установлена ​​сразу же после их инкубационных периода покрытия (шаг 2,16), и иммуноокрашиванию для проверки профильная дифференциация клеток.
• Для получения оптимальных результатов культуральной среды должна быть свежеприготовленной и дополнена на каждый день, что это необходимо.
• Покадровой изображений и последующего анализа кинематических очень чувствительны к возмущению образца. Живых клеток визуализации микроскопа должен быть сделан на воздухе таблицу, чтобы минимизировать вибрации, и система не должна быть возмущенным во время эксперимента.

Наша лаборатория регулярно изображений NPC galvanotоси в течение 6-8 часов, хотя до 15-ч анализы были выполнены. В течение 15-часов периодов, dcEF по всей камере снизилось с 250 мВ / мм до 227 мВ / мм (9,2% меньше). Более длительные периоды изображения неизбежно изменение рН среды в камере, дальнейшие изменения электрического поля. Таким образом, рекомендуется заменить средства массовой информации примерно каждые 6 часов. Тем не менее, мы провели 8-час NPC гальванотаксиса анализы без замены средств массовой информации и не наблюдается заметного гибели клеток (отмершие клетки не мигрируют) или снижение подвижности клеток, клетки сохраняют свою скорость миграции в течение всего эксперимента. Следователь может также уменьшить глубину камеры для повышения стабильности dcEF ^10.

После обработки изображений, одноклеточные кинематического анализа отслеживания осуществляется на подмножества отображаемого клеток, используя модуль отслеживания Zeiss AxioVision программного обеспечения. Клетки выбранных для анализа, если они локализованы ближе к краюдиссоциированных нейросфер и по крайней мере одна клетка тела кроме его ближайшего клетки. Обоснованием этого является сведение к минимуму вероятности клетки накладываются друг на друга во время отслеживания, который сделает отслеживание отдельных клеток практически невозможно. Мы анализируем следующие четыре параметра миграции:

1. X-оси, смещение - расстояние клетки мигрируют в направлении оси, параллельной направлению dcEF.
2. Velocity - прямолинейное расстояние между начальной и конечной позиции ячейки делится на прошедшее время.
3. Направленность - оси х смещение деленной на прямой линии расстояние между начальной и конечной позиции ячейки.
4. Извилистость - общее расстояние, проходимое клетки, деленная на прямой линии расстояние между начальной и конечной позиции ячейки.

Последние два параметра являются индикаторами того, как прямой путь миграции является в определенном направлении.

18. Соответствующие средства массовой информации подложки и культура должны быть выбраны для других типов клеток, а продолжительность клеточного посева до изображения должны быть скорректированы по мере необходимости. Следует отметить, что размеры камеры, возможно, придется изменить в зависимости от толщины ткани рассматривается (например, если ткани срез помещают в камеру). Следователь должен иметь в виду, тхат для набора электрическое поле, ток через камеру прямо пропорционально площади поперечного сечения из камеры и, следовательно, значительного расширения до размеров камеры может привести к увеличению джоулева нагрева связанных гибели клеток.

Методы, описанные в этом докладе, представляют собой мощный инструмент для исследования важны, но не широко изучается, феномен гальванотаксиса. Способность клеток реагировать на dcEFs имеет прямое терапевтическое значение. Электрическая стимуляция (глубокая стимуляция мозга) уже доказали свою эффективность в лечении болезни Паркинсона, и было показано по содействию гиппокампа нейрогенеза в мышиной модели ^19,20. Полное понимание клеточных механизмов, ответственных за dcEF трансдукции в клеточную подвижность в конечном итоге может привести к использованию электрической стимуляции в качестве клинического средства для укрепления и направляет migration эндогенных предшественников на сайты травмы или diseaSE для облегчения процесса восстановления. Методы, описанные выше, обеспечивают простой и надежный способ исследования этих процессов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose	Sigma	G6152	9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070
Bovine pancreas trypsin	Sigma	T1005
Sheep testes hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic acid	Sigma	K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7.5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-transferrin	R&D Systems	3188-AT	0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine	Sigma	P7505	Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000
Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides	VWR	16004
6N Hydrochloric Acid	VWR	BDH3204-1
High vacuum grease	Dow Corning
60 mm Petri dishes	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS	Invitrogen	10082139	Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope	Olympus	CKX41
Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Heat Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC tubing	Fisher Scientific	80000006	3/32"ID x 5/32"OD
Bleach	Clorox
10 cc syringe	BD	309604
18 gauge needle	BD	305195
Dremel drill	Dremel	Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber	Zeiss	Axiovert-200M
Recipes Item Volume 2M NaCl 6.2 ml 1M KCl 0.5 ml 1M MgCl2 0.32 ml 155mM NaHCO3 16.9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0.09256 ml Penicillin-streptomycin 1 ml Autoclaved water 74 ml Artificial cerebrospinal fluid Item Volume or Mass Artificial cerebrospinal fluid 30 ml Bovine pancreas trypsin 40 mg Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg Kynurenic acid 5 mg Trypsin Solution Item Volume or Mass SFM 15 ml Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg Trypsin Inhibitor Solution Item Volume Autoclaved water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7.5% NaHCO3 1.5 ml 1M HEPES 0.5 ml Transferrin, Putrescine solution 4 ml 25 mg insulin solution 4 ml Selenium 100 μl Progesterone 100 μl Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C) Item Volume Autoclaved water 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7.5% NaHCO3 0.75 ml 1M HEPES 0.25 ml Hormone mix 5 ml L-glutamine 0.5 ml Penicillin-streptomycin 0.5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS Item Volume Matrigel 150 μl SFM 3.6 ml Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration. Item Volume or Mass UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20 SFM Heat Inactivated FBS 8 ml 2 ml Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.