Summary
בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לבנות תאים מותאמים אישית המאפשרים יישום של שדה חשמלי בזרם ישר כדי לאפשר הדמית זמן לשגות של המוח מבוגר נגזר טרנסלוקציה תא מבשר העצבית במהלך galvanotaxis.
Abstract
הגילוי של גזע עצבי ותאי אב (תאים מבשרים עצביים המכונים באופן קולקטיבי) (NPCs) במוח של יונקי הבוגרים הוביל לגופו של מחקר שהמטרה תוך ניצול תכונות multipotent ושגשוג של תאים אלו לפיתוח אסטרטגיות neuroregenerative. צעד קריטי להצלחה של אסטרטגיות כאלו היא התגייסות NPCs לכיוון אתר נגע לאחר השתלת אקסוגני או כדי לשפר את התגובה של מבשרי אנדוגני הנמצאים באזור periventricular של מערכת העצבים המרכזיים. בהתאם לכך, הוא חיוני כדי להבין את המנגנונים שמקדמים, להדריך, ולשפר את הגירת NPC. העבודה שלנו מתמקדת בניצול של שדות חשמליים של זרם ישירים (dcEFs) לקידום והגירת NPC ישירה - תופעה הידועה בgalvanotaxis. שדות חשמליים פיסיולוגיים אנדוגניים לתפקד כרמזים קריטיים לנדידת תאים במהלך התפתחות תקינה ותיקון פצע. שיבוש תרופתיפוטנציאל צינור טרנס עצבי בעוברי האמביסטומה גורם מומים התפתחותיים חמורים 1. בהקשר של ריפוי פצע, קצב התיקון של קרנית פגועה מתואם ישירות עם סדר הגודל של פוטנציאל פצע אפיתל שמתעורר לאחר פציעה, כפי שמוצג על ידי שיפור או שיבוש תרופתי של 2-3 dcEF זה. אנחנו הוכחנו כי NPCs subependymal המבוגר לעבור הגירת cathodal מהירה וביים במבחנה, כאשר נחשף לdcEF לשימוש חיצוני. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקות של המעבדה שלנו ליצירת assay galvanotaxis פשוט ויעיל לרזולוציה גבוהה, תצפית ארוכת הטווח של טרנסלוקציה ביימה תא בגוף (נדידה) ברמת תא בודד. assay זה יהיה מתאים לחוקר את המנגנונים המווסתים את תמרת dcEF לתנועתיות סלולרית באמצעות השימוש בעכברים מהונדסים או נוקאאוט, RNA התערבות הקצר, או אגוניסטים הקולטן ספציפיים / יריבים.
Protocol
כל ההליכים כרוכים בטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת טורונטו ועדת טיפול בבעלי חיים בהתאם להנחיות מוסדיות (פרוטוקול לא. 20009387). השיטות הבאות יש לבצע באמצעות כלים וטכניקות סטריליות, במכסת מנוע זרימה למינרית היכן שאפשר.
בטקסט הפרוטוקול להלן, הביטוי "EFH-SFM" מתייחס לתקשורת החופשית בסרום בתוספת עם גורם צמיחה אפידרמיס, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי והפרין. EFH-SFM משמש כאשר חוקרים galvanotaxis של NPCs עבר התמיינות בגלל mitogens אלה לשמור NPCs ב4 המדינה המובחנות שלהם. כאשר חוקרים galvanotaxis של NPCs המושרה להתמיין לסוגי תאים בוגרים, "FBS-SFM" מתייחס לתקשורת החופשית בסרום בתוספת סרום שור עוברי 1%. FBS מקדם את הבידול של NPCs לפנוטיפים בשלים עצביים 5.
1. בידוד ותרבות של מבשרים עצביים (לאשמוצג בסרטון)
- לטשטש CD1 עכבר (6-8 שבועות) עם isofluorane והקרבה באמצעות פריקת צוואר רחם.
- לכבות את הראש באתנול 70% ולערוף את החיה במספריים חדים נתיחה.
- בעוד מחזיק את הראש עם מלקחיים כירורגיים, הסר את העור על פני שטח הגבו לחשוף את הגולגולת.
- באמצעות אזמל ולא. 11 להב, להבקיע את הגולגולת בסינוס המצח לאורך ציר mediolateral, וגם לאורך תפר sagittal בכיוון rostrocaudal.
- מקלף את העצמות הקודקודית מהראש ללא. 7 מלקחיים מעוגלים, נזהרים שלא לנקב את רקמת המוח.
- הכנס מרית דקה מתחת למוח מתחיל מתחת למוח הקטן והתקדם לעבר נורות חוש הריח. בעוד מחזיק את הגולגולת במקום עם מלקחיים, משוך בעדינות את המוח מהגולגולת ולמקם אותו באופן מיידי בנוזל השדרתי מלאכותי קר כקרח (ראה מתכונים בהמשך).
- תחת מיקרוסקופ נתיחה, באמצעות סטרילימספריים ומלקחי נתיחה יחתכו את המוח במחצית לאורך קו האמצע. סובב אונה כל כך שהמשטח המדיאלי (חתך) פונה כלפי מעלה.
- בחר חצי כדור, ועם פני השטח המדיאלי פונים כלפי מעלה, אתר splenium של כפיס המוח (אזור אחורי של כפיס המוח).
- עושה חתך מפני השטח של קליפת המוח לsplenium של כפיס המוח לאורך ציר dorsoventral.
- קולף את הקליפה החרוטה כלפי נורת הריח לחשוף את הקירות המדיאלי וצדדיים של חדר הצדדי.
- סובב את הכדור, כך שהמשטח הגבה פונה כלפי מעלה, ולהשתמש microscissors המעוגל לגזור ולאסוף את הקירות החשופים המדיאלי וצדדיים, שמכילים את האזור שבו periventricular NPCs מתגורר 6.
- חזור על שלבים 1.8-1.11 לאונה השנייה.
- פיפטה הרקמות המבודדות ל7 מ"ל של פתרון טריפסין (ראה מתכון בהמשך) בצינור סמ"ק 15, ולמקם את הצינור על כיסא נדנדה ב37 מעלות צלזיוסחממה על 25 דקות.
- צנטריפוגה הצינור ב1500 סל"ד למשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend ורקמות ב2 מ"ל של תמיסת מעכב טריפסין (ראה מתכון בהמשך).
- עדינות triturate רקמות עם 30-50 פעמי פיפטה קטנות קידוח פסטר בזהירות כדי להימנע מבועות אוויר.
- צנטריפוגה הצינור ב1500 סל"ד למשך 5 דקות, לשאוב supernatant, resuspend וב1-2 מ"ל של SFM (ראה מתכון בהמשך) על ידי triturating הגלולה 3-5 פעמים.
- צנטריפוגה הצינור ב1500 סל"ד ל3 דקות, לשאוב 1 מיליליטר supernatant ו resuspend בSFM + EFH.
- ספירה לחיות צפיפות תאים עם haemocytometer וצלחת התאים בבקבוק תרבות T25 בצפיפות של 10 תאים לμl בSFM + EFH.
- הרשה התרבות לצמוח במשך 7 ימים ללא הפרעה להניב neurospheres העיקרי צף מורכב מNPCs.
2. הכנת Galvanotaxis הקאמרית
- הנח זכוכית מרובעת 3 לא. 1 תלושי כיסוי (22 x 22 x 0.17 מ"מ) אניבקבוק na של 6N חומצה הידרוכלורית בן הלילה.
- למחרת, השתמשו יהלום קצה של כוס מחתך לחתוך 6 רצועות מלבניות (22 X 5 X 0.17 מ"מ) של זכוכית מלא מרובע. 1 תלושי עטיפה.
- להעביר את התלושים המרובעים חומצה השטופות וחוטרים מלבניים למכסת מנוע זרימה למינרית. שוטף את הרצועות הראשונות עם אתנול 70% המלבניות ומרובעות, עם מי autoclaved תרבות כיתת רקמות, ולאפשר לו להתייבש על קים נגב (על סטריליות הוסיפה, הזכוכית ניתן לאפשר לו להתייבש באוויר).
- למרוח משחת ואקום להיקף של פני שטח באחת שקופיות הזכוכית המרובעות, ולאטום אותם לבסיס של 60 צלחות פטרי פלסטיק מ"מ.
- למרוח משחת ואקום לאורך הציר הארוך של משטח אחד מרצועות הזכוכית המלבניות, ולאטום אותם לקצוות שונים של שקופיות הזכוכית המרובעות (כזה שהם מקבילים זה לזה) על מנת ליצור שוקת מרכזית.
- UV-לעקר את התאים לפחות 15 דקות במכסת מנוע הזרימה למינרית.
- 250-300 μl פיפטה של פולי-L-lysiנה אל השוקת המרכזית של התאים ולדגור על טמפרטורת חדר למשך 2 שעות.
- כ 15 דקות לפני תום תקופת הדגירה, להכין פתרון Matrigel (ראה מתכון בהמשך).
- לשאוב פולי-L-ליזין, לשטוף את השקתות המרכזיות עם 1 מיליליטר מי autoclaved, ו250-300 μl פיפטה של פתרון Matrigel אל השקתות המרכזיות.
- דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- לשאוב את פתרון Matrigel ולשטוף בעדינות את השקתות המרכזיות עם 1-2 מ"ל של SFM.
- 100 μl פיפטה של EFH-SFM או FBS-SFM אל השקתות המרכזיות ולהעביר את תאי galvanotaxis על הבמה של מיקרוסקופ ספירה.
- מיליליטר פיפטה 3-4 מתרבות neurosphere המכילה לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ ולהעביר את צלחת פטרי לבמה של המיקרוסקופ הספירה.
- במטרת צפייה של 5x, השתמש P10 פיפטה להעביר 5-8 neurospheres השלם (עד 4 בכל פעם) אל השוקת המרכזית של כל אחד galvanotaxisתא ללא dissociating, ולהפיץ את neurospheres סביב השוקת המרכזית בזהירות מבלי לשבש את מצע Matrigel.
- הוסף 150-200 μl נוסף של EFH-SFM או FBS-SFM אל השקתות המרכזיות.
- העברת תאי galvanotaxis ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 100% חממת humidified ל17-20 שעות (אם הניתוח עבר התמיינות NPCs) כדי לאפשר neurospheres לדבוק במצע Matrigel ולנתק לתאים בודדים, כפי שמוצג באיור 1 . אם ניתוח NPCs בדיל, תקופת הדגירה צריכה להיות מורחבת ל69-72 שעות כדי לאפשר ההתמיינות של התאים.
3. חי הדמית תא זמן לשגות
- אפשר למערכת הדמית התא החייה לאזן על 37 מעלות צלזיוס, CO 2 למינימום של 30 דקות לפני התחלת הקלטת זמן לשגות% 5.
- לחתוך שתי חתיכות 12 סנטימטר של 1 מ"מ קוטר חוט כסף, סלילם מקצה אחד, ולמקם אותם באקונומיקה ביץ ל20 דקות כדי ליצור אלקטרודות Ag / AgCl.
- העברת תאי galvanotaxis על הבמה של מיקרוסקופ ספירה ובחר שחדר ישמש לניתוח הגירת הדמיה חי תאים בהתבסס על הקריטריונים הבאים: א) את neurospheres צריכה להיות כמעט ניתק לחלוטין לתאים בודדים וii) התאים אמורים להחזיק מורפולוגיות עגולות עם מעט-to-אין תהליכים המשתרעות מגופי התא.
- העברה הקאמרית galvanotaxis נבחר לתוך מכסה מנוע זרימה למינרית, יחד עם כיכר לא נפרד. תלוש 1 מכסה זכוכית וגריז ואקום.
- שטוף את הכיסוי להחליק ראשון עם אתנול 70%, ולאחר מכן במי autoclaved, ולהחיל רצועת גריז ואקום בשני קצוות מקבילים של תלוש הכיסוי.
- לשאוב את תקשורת התרבות מהשוקת המרכזית של החדר, ואז למקם את תגית הכיסוי (גריז בצד פונה כלפי מטה) במהירות על התא כזה ששאר רצועות השומן על שתי רצועות זכוכית המלבניות המקבילות, ביעילות יצירת גגלתא.
- 100 μl פיפטה של טרי EFH-SFM או FBS-SFM לתוך השוקת המרכזית באמצעות פעולת נימים.
- השתמש בגריז ואקום כדי ליצור גבולות לברכות של מדיה תרבות בכל קצה של השוקת המרכזית, כפי שמוצג באיור 2.
- לחתוך שתי חתיכות 15 סנטימטרים של צינורות PVC, ולהשתמש במזרק סמ"ק 10 עם מחט מד 18 להזריק בזהירות פתרון agarose לתוך הצינור, הבטחה ללא בועות נוצרות בצינורות, ולאפשר לג'ל לביסוס למשך 5 דקות.
- העברה הקאמרית galvanotaxis למערכת הדמית התא החייה, יחד עם agarose ג'ל צינורות, Ag / AgCl אלקטרודות, וזוג 60 מנות מ"מ פטרי ריקות שתשמשנה כתרבות תקשורת והמאגרים יכילו Ag / AgCl אלקטרודות. אפשר הקאמרי galvanotaxis לנוח בתוך 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 סביבה ל20-30 דקות.
- במהלך תקופה זו, להכין את המכסים של 2 צלחות פטרי הריקות והמכסה של צלחת פטרי של galvanotaxis הקאמרי על ידי קידוח חורהאליהם עם כלי Dremel או דומה כפי שמוצג באיור 3.
- פיפטה 1-1.5 מ"ל של EFH-SFM או FBS-SFM על שני צדי התעלה המרכזית, ו7-8 מ"ל של SFM לכל צלחת פטרי ריקה. מקום פטרי צלחת אחת בכל צד של שוקת של הקאמריים galvanotaxis המרכזית ומקום אלקטרודה אחת Ag / AgCl לכל מנה. לגשר על הפער בין הקאמרי galvanotaxis וצלחות פטרי להקים המשכיות חשמלית עם גשרי agarose ג'ל, כפי שמוצג באיור 4.
- חבור את האלקטרודות Ag / AgCl לאספקת כוח חיצונית, עם מד זרם בסדרה למדידת זרם חשמלי, ולהפעיל את אספקת החשמל. השתמש ולטמטר למדוד את עוצמתו של השדה החשמלי ישירות מול השוקת המרכזית, ולהתאים את הפלט של אספקת החשמל עד לעוצמת השדה החשמלית הרצויה מושגת (המבחנים שבוצעו במעבדה זו לנצל את כוח dcEF של 250 mV / מ"מ עם זרם חשמלי בין 1 ל 1.5 mA).
- Initiaטה מודול זמן לשגות במערכת הדמית התא החייה, ולאפשר את הניסוי לרוץ לסכום הרצוי של זמן. לאחר השלים הבדיקה, לתקן את התאים בparaformaldehyde 4% לניתוח immunostaining סטנדרטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח kinematic מגלה כי בנוכחות dcEF 250 mV / מ"מ, NPCs עבר התמיינות תערוכת galvanotaxis ביים והמהיר ביותר לכיוון הקתודה (האיור 5A, סרט 1). בהעדר dcEF, תנועה אקראית של התאים הוא ציין (5B איור, סרט 2). בשדה הכח הזה,> 98% מNPCs עבר התמיינות להגר ל6-8 השעות כל שהם צלמו, ומאחר שתאים מתים לא נודדים זה מצביע על כך שהם נשארים קיימא בתקופה זו בהעדר או הנוכחות של dcEF.
פנוטיפים בדיל לעבור הגירה זניחה היא בנוכחות והיעדר dcEF (3 סרטים, 4). תת קבוצות של תאים מובחנים להרחיב את תהליכים שנוטים ליישר בניצב לכיוון של dcEF, אבל לא טרנסלוקציה גוף תא מורגשת הוא ציין.
Immunostaining מוודא שNPCs לשמור expressio החיוביn של nestin סמן המבשר העצבי אחרי 6 שעות של חשיפת dcEF (איור 6 א). במבחנים המעורבים NPCs המושרה להתמיין לפנוטיפים בוגרים, רוב התאים מבטאים את החלבון הבוגר astrocyte סמן גליה fibrillary חומצי (GFAP) אחרי 6 שעות של חשיפת dcEF (איור 6 ב).
הנוגדנים העיקריים המשמשים בניתוחים אלו היו כדלקמן: עכבר חד שבטי אנטי nestin (1:400, Millipore, קנדה), וארנבת אנטי GFAP polyclonal (1:500, סיגמא, קנדה). הנוגדנים מהשניים המשמשים בניתוחים אלו היו כדלקמן: עיזים אנטי עכבר מצומד עם Alexafluor 568 (1:400, Invitrogen-Gibco, קנדה), ותיש נגד ארנב מצומד עם Alexafluor 488 (1:400, Invitrogen-Gibco , קנדה).
איור 1. Neurospheres לדבוק במצע Matrigel וdissociאכלתי לתאים יחידים לאחר 17 שעות של דגירה על 37 מעלות% 5 / CO 2, לחות של 100% בEFH-SFM.
איור 2. איור של תא galvanotaxis. רצועות של שומן ואקום המשמשות ליצירת מאגר של תקשורת התרבות משני צדי התעלה המרכזית.
איור 3. סכמטי של חורים שיש נקדחו את המכסים הקאמריים galvanotaxis ומאגרי התרבות הבינוניים. את החורים בקוטר 7 מ"מ בשני העפעפיים משמשים להכניס את צינורות ג'ל agarose. את 4 חורים בקוטר המ"מ במכסה של חדר galvanotaxis משמשים למדידת הפוטנציאל החשמלי ישירות מול השוקת המרכזית באמצעות מד מתח. 4 מ"מ קוטר החור במכסה של מחדש התרבות הבינוניתservoir הוא לאפשר אלקטרודת Ag / AgCl כדי לבלוט מהמכסה של המנה לחיבור לאספקת החשמל.
איור 4. איור של קאמרית הרכבת galvanotaxis הדמית זמן לשגות. הקאמרי galvanotaxis הוא צלחת פטרי המרכזית, שבו התאים מצופים. התקשורת בתוך צלחת פטרי הדיור המרכזי הקאמרית galvanotaxis היא או SFM + EFH או SFM + 1% FBS. את צלחות הפטר בכל צד של חדר galvanotaxis מלאות בSFM, ומכילות גם את האלקטרודות Ag / AgCl. אלקטרודות אלו מחוברות לאספקת חשמל חיצונית, וגישור השלוש צלחות פטרי עם agarose ג'ל גשרים יוצרות מעגל שלם.
איור 5. בpresenספירה של NPCs עבר התמיינות dcEF לעבור הגירת galvanotactic מהירה לכיוון הקתודה (), ואילו בהעדר dcEF התאים עוברים הגירת רדיאלי אקראית (ב ').
האיור 6. Immunostaining מאמת שNPCs יישאר מבשרים עברו התמיינות nestin חיוביים אחרי 6 שעות של חשיפת dcEF (), וכי NPCs המושרה להבחין בעיקר להביע GFAP הסמן astrocyte הבוגר אחרי 6 שעות של חשיפת dcEF (B).
1. סרט וידאו זמן לשגות של NPCs עבר התמיינות נחשף לdcEF. NPCs מצופה על תאי galvanotaxis במשך 17 שעות בSFM + EFH, ולאחר מכן נחשף להגירת 250 mV / מ"מ dcEF תערוכה מהירה וכוון לעבר הקתודה. 1 שני של וידאו בזמן אמת = 15 דקות. לחץ כאן לצפיית מוvie.
2. סרט וידאו זמן לשגות של NPCs עבר התמיינות בהעדר dcEF. NPCs מצופה על galvanotaxis תאים במשך 17 שעות בSFM + EFH, ולאחר מכן צלם בהיעדר יישומית dcEF לעבור נדידה אקראית. 1 שני של וידאו בזמן אמת = 15 דקות. לחץ כאן לצפייה בסרט.
3. סרט וידאו זמן לשגות של NPCs בדיל שנחשף לdcEF. NPCs מצופה על תאי galvanotaxis עבור 69-72 שעות בSFM + FBS, ולאחר מכן נחשף לmV / מ"מ תערוכת הגירת 250 dcEF מעט מאוד בכל כיוון. 1 שני של וידאו בזמן אמת = 15 דקות. לחץ כאן לצפייה בסרט.
4. סרט וידאו זמן לשגות של NPCs בדיל בהעדר לdcEF. NPCs מצופה על galvanotaxis צ'הmbers עבור 69-72 שעות בSFM + FBS, ואז צפה בי בהעדר יישומית dcEF מפגין הגירה מעט מאוד בכל כיוון, בדומה לNPCs בדיל כי הם חשופים לdcEF. 1 שני של וידאו בזמן אמת = 15 דקות. לחץ כאן לצפייה בסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה הותאם מהשיטות המבוססות היטב של מחקרים קודמים 7-9. תאי Galvanotactic ניתן לבנות תוך שימוש במגוון טכניקות שונות, כולל הבנייה של זכוכית נפרדת גם לכליאה של זריעת תא, או באמצעות אבלציה הליזר CO 2 לmicrofabrication של השוקת המרכזית 10,11. טכניקות מסוימות עשויות להיות מייגעות יותר או יקרות יותר מאחרים. כבר תארנו assay פשוט וחסכוני לבניית חדר NPC galvanotaxis שימוש בחומרים נפוצים ברוב מעבדות ביולוגיה של תא. הפרוטוקול שלנו כולל מחוממת, humidified, CO 2 מוסדרת חממה המקיפה את מערכת הדמית התא החייה כדי לשמור את התאים בתנאים אופטימליים להדמיה מתמשכת לטווח ארוך. חוסר מנגנון כזה הוא מגבלה של כמה טכניקות שפורסמו בעבר 9,12.
העבודות אחרונות על ידי קבוצה אחרת הוכיחו Galva דומההתנהגות notactic של תאים משורת תאים ביפוקמפוס 13, תוך שימוש בפרוטוקול שונה ועיצוב חדר יותר עתיר עבודת galvanotaxis. הבדיקה שלנו היא אלגנטית במיוחד בכך שהוא מאפשר ניתוח של אוכלוסיית המוצא הזהה של תאים - תרביות תאים שמקורם עיקריות של NPCs neurosphere עבר התמיינות - שנחשף למצבים שונים וכך מאפשרים השוואה של המאפיינים הנודדים של שני תאים מובחנים ומובדלים, פשוט על ידי שינוי הגורמים המשמשים כתוספת לתקשורת התרבות בתוך תא galvanotaxis.
הבדיקה שהוצגה בפרוטוקול זה היא כלי רב עצמה למעקב לטווח ארוך וניתוח של galvanotaxis NPC, וסוגי תאים אחרים ואולי שיעברו הגירת galvanotactic 14,15. כמו בכל פרוטוקול, ניואנסים בהכנה וביצוע של פעולות מסוימות בפרוטוקול זה עלולים להוביל לתוצאות לא מוצלחות. ההנחיות וההצעות הבאות כפי שצריכותsist בביצוע המוצלח של פרוטוקול זה:
- כדי למנוע את מות התאים עוברים מחום נוכחי הקשורים חשמלי, הממדים של חדר galvanotaxis חושבו כדי למזער את ההשפעות של חימום ג'אול 16. החום שנוצר בתא הוא פרופורציונלי לריבוע הזרם דרכו, שהוא בתורו פרופורציונלי לשטח החתך של חדר galvanotaxis. אנו ממליצים לשמור על שטח החתך של החדר כ2.04 מ"מ 2 (12 מ"מ x 0.17 מ"מ).
- לאחר 7 ימים של neurospheres התרבות ניתן לגבות ניתקו לתוך תאים בודדים וreplated בתנאי צמיחה של גורמים (תהליך המכונה 'passaging') להניב neurospheres משתיים. אנו משיגים התוצאות הטובות ביותר שלנו באמצעות neurospheres שעבר פחות משלושה קטעים (מקסימום 21 ימים בתרבות), עם ירידה ניכרת ביכולות נדידה בעת שימוש neurospheres כי כבר passaged numbe גדולr של פעמים. זה עולה בקנה אחד עם העבודה הקודמת שלנו מוכיחה כי תרבויות ארוכות טווח לשנות קינטיקה של תאים 17.
- בעת בחירת תא המכיל galvanotaxis NPCs להסתכלות, חשוב לבחור חדר שבו התאים שמקורם neurosphere יש ניתקו גם על מנת לאפשר ניתוחי kinematic מדויקים. אם יש לי neurospheres לא ניתק היטב (NPCs ונדבק זה לזה ולא ניתן שמסומן), ניתוח של התנהגות נדידת תא היחידה יהיה כמעט בלתי אפשרי. התרבויות יש לאפשר זמן רב יותר כדי לנתק לפני התצפית. בנוסף, תאים הנמצאים בסמיכות זה לזה מבחינה פיזית יכולים לחסום ההגירה של תאים שכנים. הניתוח שלנו הראה כי תאים הממוקמים גוף תא אחד לפחות מתא השכן הקרוב ביותר שלהם נודדים במהירויות גבוהות משמעותיות מתאים שהתקבצו יחד ליד מרכז neurosphere המנותק, אם כי קשה בשוויוןctedness.
- אם יש שפע של תהליכים המשתרעים מNPCs, זה הוא אינדיקטור שהתאים החלו להבחין ולכן הם לא ייצוג אמיתי של אוכלוסייה מובחנת. יתרון של הכנת תאי galvanotaxis בשלושה עותקים הוא ששני תאים הנותרים שלא נבחרו להדמית זמן לשגות ניתן לתקן מייד לאחר תקופת הדגרת הציפוי שלהם (שלב 2.16), וimmunostained לאמת את פרופיל ההתמיינות של התאים.
- לקבלת תוצאות אופטימליות תקשורת התרבות צריכה להיות טרי ונוסף על כל יום שהוא נדרש.
- דימויי זמן לשגות וניתוחי kinematic הבאים הם רגישים מאוד להפרעות של המדגם. מיקרוסקופ ההדמיה חייה התא צריך להיות ממוקם על שולחן אוויר כדי למזער את התנודות, והמערכת לא צריכה להיות מוטרדת במהלך ניסויים.
המעבדה שלנו באופן שגרתי התמונות NPC galvanotציר במשך 6-8 שעות, למרות שעד ניתוח 15-hr בוצע. במהלך תקופות 15-HR, dcEF פני תא ירד מ 250/227 מ"מ mV לmV / מ"מ (9.2% ירידה). תקופות ארוכות הדמיה בהכרח לשנות את ה-pH של התקשורת בתא, בהמשך שינוי השדה החשמלי. לכן מומלץ להחליף את המדיה בערך כל 6 שעות. עם זאת, יש לנו בצענו מבחני galvanotaxis NPC 8-hr ללא החלפת תקשורת ולא נצפו כל מוות מורגש תא (תאים מתים אינם נודדים) או ירידה בתנועתיות תא; התאים לשמור על המהירות של הגירתם לאורך הניסוי. החוקר עשוי גם להפחית את העומק מהלשכה כדי להגביר את היציבות של dcEF 10.
בעקבות הדמיה, ניתוח המעקב kinematic תא בודד מתבצע בקבוצת משנה של תאי ההדמיה באמצעות מודול של Zeiss AxioVision תוכנת מעקב. תאים שנבחרו לניתוח אם הם מקומיים קרובים יותר לקצה neurosphere הפריד וגוף תא אחד לפחות חוץ מהתא הקרוב ביותר שלו. הרציונל שעומד מאחורי זה הוא למזער את הסבירות של תאים חופפים אחד את השני במהלך מעקב, אשר יהפוך את המעקב אחר תאים בודדים כמעט בלתי אפשרי. אנו מנתחים את הארבעה הפרמטרים הבאים של הגירה:
- ציר ה-X עקירת - מרחק תא נודד לכיוון הציר, שהוא מקביל לכיוון dcEF.
- מהירות - מרחק הקו ישר בין עמדות הסלולריות ראשונות והאחרונות מחולקות בזמן שחלף.
- התכוונות - תזוזת ציר x מחולקת במרחק הקו ישר בין העמדות הסלולריות הראשונות והאחרונות.
- Tortuosity - המרחק הכולל נסע בנתיב התא מחולק במרחק הקו ישר בין עמדות הסלולריות ראשונות והאחרונות.
שני הפרמטרים האחרונים הם אינדיקטורים של איך ישר מסלול הנדידה הוא בכיוון מסוים.
תחת => "jove_content" עם האחיזה בשיטות בפרוטוקול זה, עשוי חוקר רוצה לשנות היבטים מסוימים עבור יישומים רחבים יותר. לדוגמה, הבדיקה יכולה גם להיות שונה כדי לחקור את התנהגות הנדידה של תאים מסוגים אחרים. מודלי נוקאאוט גנטיים או טכניקות transfection siRNA יכולים לשמש יעד גנים של עניין שעשוי לשחק תפקיד בנדידת תאים או התמרה של dcEF לתנועתיות של תאים. במעבדה שלנו, יש לנו שונים הקאמרי galvanotaxis להתיר-זלוף צלב המתמשך של תקשורת התרבות הטריה בתוך השוקת המרכזית במהלך ניסויים 18. אמצעי תקשורת ותרבות מצע המתאים הייתי צריכה להיבחר לסוגי תאים אחרים, ואת משך הזמן של זריעת תאים לפני ההדמיה צריך להיות מותאם לפי צורך. יש לציין, את הממדים של החדר ייתכן שיהיה צורך לשנות בהתאם לעובי של הרקמה נבדקת (למשל, אם פרוסת רקמה ממוקמת בתא). החוקר צריך לזכור thaלא לשדה חשמלי סט, זרימת הזרם דרך התא עומדת ביחס ישר לשטח חתך של החדר, ולכן גדלות משמעותיות לממדים של הקאמרי עלולות לגרום למוות של תאים גדל ג'אול חימום קשור.
הטכניקות המתוארות בדוח זה מספקים כלי רב עצמה לחקירה חשובה, אך לא נחקרו באופן נרחב, תופעת galvanotaxis. היכולת של תאים להגיב לdcEFs יש השלכות טיפוליות ישירות. גירוי חשמלי (גירוי מוחי עמוק) כבר הוכיח יעיל בטיפול במחלת הפרקינסון, והוכח לקדם neurogenesis היפוקמפוס במודל של עכברי 19,20. הבנה מלאה של המנגנונים האחראים לתמרת dcEF לתנועתיות סלולרית הסלולריים עשויה להוביל לשימוש בגירוי חשמלי כאמצעי לשיפור קליני ובימוי הגירת מבשר אנדוגני לאתרים של פציעה או disease כדי להקל את תהליך התיקון. השיטות שתוארו לעיל מספקים דרך פשוטה וחזקה של חקירת תהליכים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (מענק # 249669, ו# 482986) ולב ושבץ קרן של קנדה (מענק # 485508). המחברים מודים יוסוף אל האייק וואן ד"ר צ'י על סיועם בפיתוח פרוטוקולי הניסוי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Borgens, R. B., Shi, R. Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential. Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo. Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
- Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).
- Erickson, C. A., Nuccitelli, R. Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields. J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).
- Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent. J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).
- Li, L. Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration. Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).
- Song, B. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Huang, C. -W., Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Young, T. -H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- SATO, M. Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells. Biosystems. 88, 261-272 (2007).
- Meng, X. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).
- Zhao, M. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. The FASEB Journal. , (2002).
- Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).
- McCaig, C. D. Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential. Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).
- Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations. Nat. Med. 8, 268-273 (2002).
- Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields. PLoS ONE. 6, e23808 (2011).
- Deuschl, G. A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease. N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).
- Stone, S. S. D. Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory. J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).
