Summary
Bu protokolü biz galvanotaksis sırasında nöral prekürsör hücre translokasyon edilen erişkin beyninin time-lapse görüntüleme sağlamak için bir doğru akım elektrik alanın uygulanmasına izin özel odaları oluşturmak nasıl gösterilmektedir.
Abstract
Nöral kök ve erişkin memeli beynindeki progenitor hücreler (toplu olarak adlandırılır sinir öncü hücreleri) (NPC) keşfedilmesi neuroregenerative stratejilerin geliştirilmesi için bu hücrelerin multipotent ve proliferatif özellikler kullanılarak yönelik araştırmalar bir gövde yol açmıştır. Bu tür stratejilerin başarısı için kritik bir adım eksojen Transplantasyon sonrası lezyon yerinde doğru veya MSS periventriküler bölgede bulunan endojen öncüleri yanıtı arttırmak için NPCs harekete geçirilmesidir. Buna göre, teşvik rehberlik ve NPC göç geliştirmek mekanizmaları anlamak için önemlidir. Galvanotaksis olarak bilinen bir olgu - Bizim iş tanıtmak için doğru akım elektrik alanların kullanımı (dcEFs) ve doğrudan NPC göç üzerinde duruluyor. Endojen fizyolojik elektrik alanları normal gelişimi ve yara onarımı sırasında hücre göçü için kritik ipuçları olarak işlev görür. Farmakolojik bozulmasıAxolotl embriyolar trans-nöral tüp potansiyeli ciddi gelişimsel malformasyonlar 1 neden olur. Yara iyileştirme bağlamında, yaralı, kornea tamir oranı doğrudan bu dcEF 2-3 farmakolojik olarak artırma ya da bozulma ile gösterildiği gibi, yaralanma sonrası ortaya çıkan epitel yara potansiyel büyüklüğü ile ilişkilidir. Biz bir şekilde dıştan uygulanan dcEF maruz kaldığında yetişkin subepandimal YZK'lar in vitro hızlı ve yönetmenliğini cathodal göç tabi olduğunu göstermiştir. Bu protokolü biz yüksek çözünürlüklü, bir tek hücre düzeyinde yönettiği hücre gövdesi translokasyon (göç) uzun vadeli gözlem için basit ve etkili bir galvanotaksis tahlil oluşturmak için laboratuvar tekniklerini açıklar. Bu tahlil, transgenik veya nakavt fareleri kısa müdahale RNA, ya da özel bir reseptör agonistleri / antagonistleri kullanımı yoluyla hücre hareketliliği içine dcEF transdüksiyon düzenleyen mekanizma araştırılması için uygun olacaktır.
Protocol
Hayvan taşıma içeren tüm prosedürler kurumsal düzenlemeler (protokol no. 20009387) uyarınca Toronto Hayvan Bakım Komitesince Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Aşağıdaki yöntemler uygulanabilir durumlarda bir laminer akış kaputu, steril alet ve teknikler kullanılarak yapılmalıdır.
Aşağıdaki protokol metninde, ifade "EFH-SFM" epidermal büyüme faktörü, temel fibroblast büyüme faktörü ve heparin ile takviye serum serbest medya anlamına gelir. Bu mitojenler kendi ayrışmamış devlet 4 YZK'lar korumak için farklılaşmamış NPCs galvanotaksis araştırılırken EFH-SFM kullanılır. Olgun hücre tipleri farklılaşması için indüklenebilir NPCs galvanotaksis araştırırken, "FBS-SFM"% 1 fetal sığır serumu serum serbest medya anlamına gelir. FBS olgun nöral fenotipleri 5 içine NPCs farklılaşma teşvik etmektedir.
1. Sinir Öncüleri izolasyonu ve Kültür (Değil) Videoda gösterilen
- Servikal dislokasyon yoluyla isofluorane ve özveri ile bir CD1 fare (6-8 haftalık) Anesteziyoloji.
- % 70 etanol içinde baş söndürün ve keskin disseksiyon makas ile hayvan başını kesmek.
- Cerrahi forseps ile kafa tutarken, kafatası maruz dorsal yüzeyi üzerinde cilt kaldırmak.
- Bir neşter ve hiçbir kullanma. 11 bıçak, mediyolateral eksen boyunca ön sinüs de kafatası puan, ve aynı zamanda rostro yönde dikiş boyunca sagital.
- Uzakta olmayan baş parietal kemikler Peel. 7 kavisli bir forseps, delmek için beyin dokusu umursamadı alıyor.
- Beyincik altından başlayarak ve olfaktor doğru ilerleyen beyin altında ince bir spatula yerleştirin. Forseps ile yerde kafatası tutarken, yavaşça kafatası beyin çekin ve hemen buz yapay beyin omurilik sıvısı (aşağıda tarifleri bakınız) yerleştirin.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, steril kullanarakDiseksiyon makas ve forseps orta hat boyunca yarım beyin kesti. Medial (kesim) yüzey yukarı bakacak şekilde her hemisferin döndürün.
- Bir hemisfer seçin ve medial yüzeyi yukarı bakacak şekilde, korpus kallozum (KK posterior bölgesi) splenium bulun.
- Korteks yüzeyinden dorsoventral ekseni boyunca korpus kallozum spleniumda bir kesi olun.
- Lateral ventrikül medial ve lateral duvarları açığa koku ampul doğru kazılı korteks Peel.
- Dorsal yüzeyi yukarı bakacak şekilde yarımkürede döndürün ve NPC'ler 6 ikamet periventriküler bölge içerir maruz medial ve lateral duvarlar, kesip toplamak için kavisli microscissors kullanın.
- Tekrar diğer yarımkürede için 1,8-1,11 adımları.
- Bir 15 cc tüp içinde tripsin solüsyonu (aşağıda tarif bakınız) 7 ml içine izole edilmiş doku pipet, ve 37 ° C de bir rocker tüp yerleştirmek25 dakika inkübatör.
- 5 dakika boyunca 1,500 rpm'de santrifüje tüp, süpernatan aspire, ve (aşağıda tarif bakınız) tripsin inhibitörü çözelti 2 ml doku tekrar süspansiyon.
- Yavaşça hava kabarcıkları önlemek için dikkatli bir küçük kuyu Pasteur pipeti 30-50 kez doku çiğnemek.
- 5 dakika boyunca 1,500 rpm'de santrifüje tüp, süpernatan aspire ve pelet 3-5 kez triturating ile SFM 1-2 ml (aşağıda tarif bakınız) içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
- 3 dakika 1.500 rpm'de tüp santrifüjleyin, SFM + EFH arasında bölgesindeki süpernatant ve tekrar süspansiyon 1 ml aspire.
- SFM + EFH içinde başına 10 ul hücre yoğunluğunda bir T25 kültürü şişesi içinde bir haemocytometer ve plaka hücreler ile hücre yoğunluğu, canlı sayın.
- Kültür NPC oluşan serbest yüzen birincil neurospheres verim örselenmemiş 7 gün büyümeye izin verin.
2. Galvanotaksis Odası Hazırlama
- Hayır 3 kare cam yerleştirin. 1 kapak camları (22 x 22 x 0.17 mm) iGecede 6N hidroklorik asit na şişe.
- Ertesi gün, kare hiçbir gelen cam 6 dikdörtgen şeritler (22 x 5 x 0.17 mm) kesmek için bir elmas uçlu cam kesici kullanın. 1 kapak fişleri.
- Bir laminer akış kaputun içine asitle yıkanmış kare fişleri ve dikdörtgen fişleri aktarın. Doku kültürü dereceli otoklava su ile, sonra% 70 etanol ile ilk dikdörtgen ve kare şeritler yıkayın ve silin bir Kim üzerinde kurumasına izin (ilave sterilite, cam hava kuru izin verilebilir).
- Kare cam slaytlar bir yüzeyi çevre vakum gres sürün ve 60 mm plastik Petri kaplarının tabanına onları mühür.
- Dikdörtgen cam şeritleri bir yüzeyi uzun ekseni boyunca vakum uygula yağ, ve bir merkezi oluk oluşturmak için kare cam slaytların zıt kenarları (birbirlerine paralel olduğu gibi) ile geri kapatın.
- Laminer akış kaputu en az 15 dakika süreyle odaları UV sterilize.
- Poli-L-lysi pipetle 250-300 ul2 saat oda sıcaklığında inkübe odaları ve merkezi oluk üzerine ne.
- İnkübasyon süresinin sonunda önce yaklaşık 15 dakika, (aşağıda tarif bakınız) Matrigel solüsyon hazırlanır.
- , Poli-L-lizin aspire otoklavlanmış 1 mL su, ve merkezi oluklar üzerine Matrigel solüsyonu bir pipet 250-300 ul ile merkezi çukurların yıkayın.
- 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe odaları.
- Matrigel çözüm aspire ve yavaşça SFM 1-2 ml merkezi çukurların yıkayın.
- Pipet 100 merkez çukurların üzerine EFH-SFM veya FBS-SFM ul ve sayma mikroskop sahneye galvanotaksis odaları aktarın.
- Pipet 3-4 60 mm Petri kabı içine neurosphere içeren kültür ml ve sayma mikroskop aşamasına Petri kabı aktarın.
- 5x görüntüleme amacı, her galvanotaksis merkezi çukur üzerine 5-8 bütün neurospheres (dört bir defada) aktarmak için bir P10 pipet kullanınOnları dissociating ve dikkatle Matrigel substrat aksatmadan merkez çukur etrafında neurospheres yayılmış olmadan oda.
- Merkez oluklar üzerine EFH-SFM veya FBS-SFM ek 150-200 ul ekleyin.
- 37 ° C,% 5 CO2, 17-20 saat süreyle% 100 nemlendirilmiş kuluçka makinesi içine galvanotaksis odaları aktarın (eğer farklılaşmamış analiz NPC) Şekil 1 'de gösterildiği gibi neurospheres Matrigel substrata yapışır ve tek hücre halinde ayrıştırmak için izin vermek için . Farklılaşmış NPC analiz ise, kuluçka süresi, hücrelerin farklılaşması izin vermek için 69-72 saat için genişletilmelidir.
3. Hücre Time-Lapse Görüntüleme Canlı
- Canlı hücre görüntüleme sistemi 37, denge sağlaması için izin ° C,% 5 lik önce geçen zaman kaydının başlatılması için 30 dakika arasında, en az CO2.
- Bir ucundan 1 mm çaplı gümüş tel, bobin ikisi 12 cm parçalar koparıp ve Clorox b koyunleach 20 dakika için Ag / AgCI elektrotlar oluşturur.
- Bir sayma mikroskop sahneye galvanotaksis odaları aktarın ve aşağıdaki kriterlere göre canlı hücre görüntüleme göçü analiz için kullanılacak olan kamara seçin: i) neurospheres hücreleri sahip olmalıdır) tek hücreler ve ii içine neredeyse tamamen ayrılmış olmalıdır az-hayır süreçleri yuvarlak morfolojileri hücre gövdeleri uzanan.
- Ayrı bir kare hayır birlikte, bir laminer akış kaputun içine seçilen galvanotaksis odasına aktarın. 1 cam kapak kayma ve vakum gres.
- Kapak otoklavlanmış su ile, sonra% 70 etanol ile ilk kayma ve Kapak kayma iki paralel kenarlarında vakum gres bir şerit uygulayın yıkayın.
- , Odasının merkezi çukur gelen kültür ortamı aspire sonra hızlı bir şekilde, iki paralel dikdörtgen cam şerit üzerinde kalan yağ şeritler, etkili bir çatı yaratılması da bu tür oda üzerine kapak slipi (yağ-yüzü aşağı bakacak şekilde) yerleştirmekodasına.
- Kapiller eylem yoluyla merkezi çukur içine taze EFH-SFM veya FBS-SFM Pipet 100 ul.
- Şekil 2'de gösterildiği gibi, merkezi oluk her bir ucunda, kültür besiyeri havuzları için sınırlarını oluşturmak için vakum yağ kullanır.
- PVC boru, iki 15 cm parçalar koparıp ve dikkatle hiçbir kabarcıklar tüpler oluşmaya sağlanması, boru içine agaroz enjekte çözüm için bir 18 gauge iğne ile 10 cc şırınga kullanmak ve jel 5 dakika boyunca katılaşmaya izin.
- Agaroz jel tüpler, Ag / AgCI elektrodları, ve kültür ortamı rezervuar olarak kullanılmak üzere boş 60 mm Petri kapları bir çift ile birlikte, bir canlı hücre görüntüleme sistemi için galvanotaksis oda aktarın ve Ag / AgCI elektrot içerir. Galvanotaksis odası 37 içinde dinlenmek için izin ° C, 20-30 dakika süreyle% 5 CO 2 ortamında.
- Bu süre zarfında, sondaj delikleri ile 2 boş Petri kaplarının kapakları ve galvanotaksis odasının en Petri kabı kapağı hazırlamakbunların Şekil 3 'de gösterildiği gibi bir Dremel ya da benzer araç ile içine.
- Pipet her boş Petri kabına merkez çukur iki yüzüne EFH-SFM veya FBS-SFM 1-1.5 ml ve SFM 7-8 ml. Her yemeğin içine galvanotaksis odasının merkezi çukur ve yerde bir Ag / AgCl elektrot her tarafında il birini Petri. Şekil 4'te gösterildiği gibi agaroz jel köprüleri ile elektriksel süreklilik kurmak için galvanotaksis haznesi ve Petri kutularına arasındaki boşluğu.
- Elektrik akımı ölçmek için seri bir ampermetre ile, harici bir güç kaynağına Ag / AgCl elektrot bağlayın ve güç kaynağını açın. Doğrudan merkezi çukur boyunca elektrik alanın gücünü ölçmek için bir voltmetre kullanın ve istenen elektrik alan şiddeti (Bu laboratuarda yapılan deneyler ile 250 mV / mm dcEF gücü kullanmak elde edilene kadar güç kaynağının çıkış ayarlayabilirsiniz 1 ve 1.5 mA arasında elektrik akımı).
- Inisiyatifite time-lapse canlı hücre görüntüleme sistemi üzerinde modül ve deney süresi istenilen miktarda için çalışmasına izin. Tahlil tamamlanmasından sonra, standart bir immun analiz için% 4 paraformaldehit içinde hücreler düzeltmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kinematik analizi bir 250 mV / mm dcEF varlığında, farklılaşmamış NPC katot karşı yönlendirilmiş ve çok hızlı galvanotaksis (Şekil 5A, Film 1) gösterdiğini ortaya koymaktadır. Bir dcEF yokluğunda, hücrelerin rasgele hareketi (Şekil 5B, Film 2) görülmektedir. Bu alan gücü az, farklılaşmamış NPCs>% 98'i yansıması olduğu için tüm 6-8 saat boyunca göç ve ölü hücreleri göç etmezler çünkü bu bir dcEF yokluğunda veya varlığında bu dönemde canlı kalır düşündürmektedir.
Ayrıştırılan fenotipleri varlığı ve bir dcEF yokluğunda (Filmler 3, 4) iki önemsiz göç geçer. Farklılaşmış hücrelerin alt kümeleri dcEF yönüne dik hale eğilimindedir işlemler uzatmak, fakat hiçbir fark hücre vücut translokasyon gözlemlenmiştir.
İmmun Boyamanın NPC pozitif expressio korumak olduğunu doğrularn dcEF pozlama (Şekil 6A) 6 saat sonra nöral prekürsör işaretleyici nestin arasında. Olgun fenotip farklılaşması için indüklenebilir NPC ilgili analizlerde, hücrelerin büyük bir kısmını dcEF maruz kalma (Şekil 6B) 6 saat sonra olgun astrosit işaretleyici glial fibriller asidik protein (GFAP) ifade eder.
Aşağıdaki gibi bu analizlerde kullanılan primer antikorları: fare monoklonal anti-nestin (1:400, Millipore, Kanada), ve tavşan poliklonal anti-GFAP (1:500, Sigma, Kanada). Aşağıdaki gibi bu analizlerde kullanılan ikincil antikorları: Alexafluor 568 (1:400, Invitrogen-Gibco, Kanada) ile keçi anti-fare konjuge ve (1:400, Invitrogen-Gibco Alexafluor 488 ile keçi anti-tavşan konjuge , Kanada).
Şekil 1. Neurospheres Matrigel substrat ve dissoci uymak37 ° C /% 5 CO 2, EFH-SFM% 100 nemde inkübasyondan 17 saat izleyen tek hücre içine yedik.
Şekil 2. Galvanotaksis odasının çizimi. Vakum yağ şeritler merkezi oluk her iki tarafında da kültür ortamı bir havuzu oluşturmak için kullanılır.
Şekil 3,. Kapakları galvanotaksis haznesi ve kültür ortamı rezervuar içine açılması gerekir delik şematik. Her iki kapak da 7 mm çapındaki delikler agaroz jel tüpleri eklemek için kullanılır. Galvanotaksis odasının kapak olarak 4 mm çapında delikleri, bir voltmetre ile doğrudan merkezi oluk boyunca elektrik potansiyeli ölçmek için kullanılır. Kültür ortamı yeniden kapak 4 mm çapında delikservoir Ag / AgCI elektrot güç kaynağına bağlantı için çanak kapak uzanmasına olanak sağlamaktır.
Şekil 4. Time-lapse görüntüleme için galvanotaksis haznesi montaj çizimi. Galvanotaksis oda hücreleri kaplanmış olduğu merkezi Petri kabı vardır. Merkez Petri kabı muhafaza içerisindeki ortam galvanotaksis odasının SFM + EFH veya SFM da olduğunu +% 1 FBS. Galvanotaksis odasının her iki tarafında petri SFM ile doldurulur, ve ayrıca Ag / AgCI elektrotlar ihtiva eder. Bu elektrotlar, harici bir güç kaynağına bağlı ve agaroz jel köprü ile üç petri köprü tam bir devre oluşturur. Vardır
Şekil 5,. Presen olarakbir dcEF yokluğunda hücrelerin rasgele radyal geçiş (B) geçmesi ise bir dcEF farklılaşmamış NPCs ce, katot (A) yönünde çok hızlı göç galvanotactic geçer.
Şekil 6. İmmun Boyamanın olduğunu YZK'lar dcEF pozlama (A) 6 saat sonra nestin pozitif ayrışmamış öncüleri kalır ve çoğunlukla ayırt etmek neden olduğu YZK'lar dcEF pozlama (B) 6 saat sonra olgun astrosit işaretleyici GFAP ifade doğrular.
Bir dcEF maruz farklılaşmamış NPCs Movie 1. Time-lapse video. NPC SFM + EFH içinde 17 saat için galvanotaksis odaları üzerine kaplanmış ve daha sonra katot doğru bir 250 mV / mm dcEF sergi hızlı ve yönlendirilmiş göç maruz kalmaktadır. Video 1 saniye = 15 dakika gerçek zamanlı. mo görüntülemek için buraya tıklayınvie.
Bir dcEF yokluğunda farklılaşmamış NPCs Movie 2. Time-lapse video. NPC SFM + EFH içinde 17 saat için galvanotaksis odaları üzerine kaplanmış ve daha sonra uygulanan bir dcEF yokluğunda görüntülenmiştir rasgele göç geçer. Video 1 saniye = 15 dakika gerçek zamanlı. filmi görmek için buraya tıklayın .
Bir dcEF maruz farklılaştırılmış NPCs Movie 3. Time-lapse video. NPC SFM + FBS 69-72 saat süreyle galvanotaksis odaları üzerine kaplama ve ardından herhangi bir yönde 250 mV / aa dcEF sergi çok az göç maruz. Video 1 saniye = 15 dakika gerçek zamanlı. filmi görmek için buraya tıklayın .
Bir dcEF için yokluğunda farklı NPCs Film 4. Time-lapse video. Galvanotaksis cha üzerine kaplama YZK'laro zaman SFM + FBS içinde 69-72 saat süreyle mbers, ve bir uygulamalı dcEF yokluğunda görüntülenmiş bir dcEF maruz farklılaşmış NPC benzer başka bir yönünde, yani çok az göç sergilerler. Video 1 saniye = 15 dakika gerçek zamanlı. filmi görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, önceki çalışmalarda 7-9 köklü yöntemler adapte edilmiştir. Galvanotactic odaları hücre ekimi kısıtlanmasının veya merkez çukur 10,11 mikroimalat için CO2 lazer ablasyonu kullanmak için de ayrı bir cam yapım dahil olmak üzere farklı teknikler kullanarak çeşitli inşa edilebilir. Bazı teknikler diğerlerinden daha zahmetli ve masraflı olabilir. Biz genellikle çoğu hücre biyoloji laboratuvarlarında bulunan malzemeler kullanılarak bir NPC galvanotaksis odası oluşturmak için basit ve maliyet-etkin tahlil nitelendirdiler. Tüm protokol, sürekli uzun süreli görüntüleme için en uygun şartlar altında hücreleri korumak için canlı hücre görüntüleme sistemi çevreleyen ısıtılmış, nemlendirilmiş, CO2 kuluçka makinesi düzenlenmiş bulunmaktadır. Bu tür cihazların eksikliği, bazı daha önce yayınlanmış teknikleri 9,12 kısıtlamasıdır.
Başka bir grup tarafından yapılan son çalışma benzer galvanize gösterdifarklı bir protokol ve bir daha emek-yoğun galvanotaksis odası tasarımı kullanarak hipokampal hücre hattı 13 hücre notactic davranış. Farklılaşmamış neurosphere türetilmiş NPCs primer hücre kültürleri - - Bizim test bu hücrelerin aynı başlangıç popülasyonu bir analiz izin verdiğinden özellikle zarif böylece farklılaşmamış ve farklılaşmış hücrelerin hem göçmen özelliklerinin karşılaştırılması izin farklı koşullara maruz kalmış ki, sadece galvanotaksis bölme içinde kültür ortamına ilave için kullanılan faktörlerden değiştirerek.
Bu protokolde sunulan tahlil galvanotactic göç 14,15 geçmesi uzun vadeli izleme ve analiz NPC galvanotaksis, ve muhtemelen diğer hücre türleri için güçlü bir araçtır. Herhangi bir protokol, bu protokolde bazı adımlar hazırlanması ve yürütülmesinde nüansları başarısız sonuçlara yol açabilir. Aşağıdaki yönergeler ve öneriler gibi olmalıdırBu protokolün başarılı bir çalıştırma sist:
- Elektrik akımı ile ilişkili ısı ölümü geçiren gelen hücreleri önlemek için, galvanotaksis odasının boyutları Joule ısıtması 16 etkilerini en aza indirmek için hesaplanmıştır. Odacığın içinde üretilen ısı galvanotaksis odasının kesit alanı ile orantılı canlandiriyor akan akımın karesi, orantılıdır. Biz, 2.04 mm 2 (12 mm x 0.17 mm) olarak oda kesit alanı muhafaza öneriyoruz.
- Kültür neurospheres 7 gün tek bir hücre içine, dissosiye toplanmış ve ikincil neurospheres vermek üzere (bir süreç 'pasajlanmasını da "olarak anılacaktır) büyüme faktörü koşullarda replated edilebilir sonra. Biz büyük bir numbe pasajlanmağa edildiğini neurospheres kullanırken en iyi sonuçları göç yeteneklerini görünür bir düşüş ile, (maksimum kültürü 21 gün) en az üç pasajlar uğramıştır neurospheres kullanılarak eldekere r. Bu uzun süreli kültürlerde hücre kinetiği 17 değiştirmez olduğunu gösteren önceki çalışmalarıyla örtüşmektedir.
- Gözlem için NPC içeren bir galvanotaksis oda seçerken, neurosphere edilen hücre doğru kinematik analizlere imkan için iyi ayrışmış olduğu bir bölme seçmek önemlidir. Neurospheres iyi ayrışmış değil varsa (NPC birbirine yapıştırılır ve tarif edilemez), bireysel hücre göç davranışlarını analiz imkansız yakın hale gelecektir. Kültürler öncesinde gözlem ayırmak için daha fazla zaman izin verilmelidir. Buna ek olarak, birbirine çok yakın olan hücrelerin fiziksel olarak komşu hücrelerin göç engelleyebilir. Bizim analizler uzakta onların en yakın komşu hücre en az bir hücre gövdesi konumlandırılmış hücreler eşit korkunç da olsa, disosiye neurosphere merkezine yakın bir araya kümelenmiş hücrelerden belirgin olarak daha fazla hızlarda göç ettiğini göstermiştirctedness.
- NPC uzanan süreçlerin bir bolluk varsa, bu hücrelerin ayırt başladı ve bu yüzden bir farklılaşmamış nüfusun gerçek bir temsilini olmadığı bir göstergesidir. Nüsha galvanotaksis odaları hazırlayan bir yararı time-lapse görüntüleme için seçili olup kalan iki meclisinin kendi İnkübe kaplama dönemi (Adım 2.16) hemen ardından sabit ve hücrelerin farklılaşması profili doğrulamak için immunohistokimyasal olmasıdır.
- En iyi sonuçlar için kültür ortamı, taze gerekli olduğunu her gün hazırlanmış ve tamamlanması gerekir.
- Time-lapse fotoğraf ve sonraki kinematik analizler numune pertürbasyon için son derece duyarlıdır. Canlı hücre görüntüleme mikroskop titreşimleri en aza indirmek için bir hava masaya konulmalıdır, ve sistem deney sırasında tedirgin edilmemelidir.
Bizim laboratuar rutin görüntüleri NPC galvanot6-8 saat için eksen yukarı 15-hr analizleri yapılmıştır rağmen. 15-hr dönemleri boyunca, odanın karşısında dcEF mV / mm 250 den 227 mV / mm (% 9.2 azalış) gerilemiştir. Daha uzun görüntüleme dönemler kaçınılmaz olarak elektrik alan değiştirerek, odasındaki ortam pH değiştirebilirsiniz. Böylece, her bir medya yaklaşık olarak 6 saat değiştirmek için tavsiye edilir. Ancak, yedek ortamlar olmadan 8 saat NPC galvanotaksis analizlerinin yapıldığı ve herhangi bir fark hücre ölümü (ölü hücreleri göç etmezler) veya hücre hareketliliğinde azalma gözlenmiştir değil; hücrelerin deney boyunca göç onların hızı korumak. Araştırmacı dcEF 10 kararlılığını arttırmak için oda derinliğini azaltır.
Görüntüleme takiben, tek hücreli kinematik izleme analizi Zeiss Axiovision yazılım izleme modülünü kullanarak görüntülü hücrelerinin bir alt kümesi üzerinde gerçekleştirilir. Onlar yakın kenarına lokalize ise Hücreler analizi için seçilirdisosiye neurosphere ve dışında onun yakın cep en az bir hücre gövdesi. Bunun arkasındaki mantık imkansız yakın bireysel hücrelerin izleme yapacak, hangi izleme sırasında birbirleriyle örtüşen hücrelerin olasılığını en aza indirmektir. Biz göç aşağıdaki dört parametreleri analiz:
- X ekseni deplasmanı - bir hücre dcEF yönüne paralel olan eksen yönünde göç mesafesi.
- Velocity - Geçen zaman bölünür ilk ve son hücre konumları arasındaki doğrusal mesafe.
- Yönetme - ilk ve son hücre konumları arasındaki doğrusal mesafeye bölünmesiyle x-ekseni deplasman.
- Kıvrımlarında - toplam yol mesafesi ilk ve son hücre konumları arasındaki doğrusal mesafeye bölünmesiyle hücre tarafından gitti.
Son iki parametre göç yolu da belirli bir yönde ne kadar düz göstergeleridir.
18 sırasında merkezi çukur içinde taze kültür ortamı sürekli çapraz-perfüzyon izin galvanotaksis odasının değiştirdiniz. Uygun bir yüzey ve kültür ortamı diğer hücre türleri için seçilmesi gerekir ki, ve önceden görüntüleme için hücre tohum süresini gerektiği gibi ayarlanmalıdır. Özellikle, haznenin boyutları dokuyu (örneğin, bir doku dilim odasına yerleştirilir değilse) incelenmekte olan ve kalınlığına bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilir. Araştırmacı akılda tha taşımalıdırbir dizi elektrik alanı için t, bölmesi içinden akım akış bölmesinin enine kesit alanı ile doğrudan orantılı ise, ve bölme boyutları bu nedenle önemlidir büyütme artmış Joule ısıtması ile ilişkili hücre ölümüne neden olabilir.
Bu raporda açıklanan teknikler galvanotaksis fenomen, önemli araştırmak için güçlü bir araç sağlar, ancak yaygın olarak çalışılmamıştır. DcEFs yanıt hücrelerinin yeteneği doğrudan terapötik etkileri vardır. Elektrik uyarısı (derin beyin stimülasyon) önceden Parkinson hastalığının tedavisinde yararlı olan ve bir fare modelinde 19,20 hipokampal nöron teşvik etmek için gösterilmiştir. Hücresel hareketlilik içine dcEF transdüksiyon sorumlu hücresel mekanizmaları tam bir anlayış sonunda yaralanma veya disea mekanlarının artırılması ve endojen habercisi göç yönetmenlik için bir klinik araç olarak elektriksel stimülasyon kullanımına yol açabilirse tamir sürecini kolaylaştırmak için. Yöntemler bu süreçlerin araştırılması için basit ve güçlü bir yol sağlar yukarıda açıklanan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Kurumu (hibe # 249669 ve # 482986) ve Kalp ve Kanada İnme Vakfı (hibe # 485508) tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar deney protokolleri geliştirmek onların yardım için Youssef El-Hayek ve Dr Qi Wan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Borgens, R. B., Shi, R. Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential. Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo. Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
- Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).
- Erickson, C. A., Nuccitelli, R. Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields. J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).
- Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent. J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).
- Li, L. Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration. Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).
- Song, B. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Huang, C. -W., Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Young, T. -H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- SATO, M. Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells. Biosystems. 88, 261-272 (2007).
- Meng, X. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).
- Zhao, M. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. The FASEB Journal. , (2002).
- Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).
- McCaig, C. D. Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential. Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).
- Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations. Nat. Med. 8, 268-273 (2002).
- Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields. PLoS ONE. 6, e23808 (2011).
- Deuschl, G. A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease. N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).
- Stone, S. S. D. Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory. J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).
