Summary
In dit protocol we zien hoe aangepaste kamers die de toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld op time-lapse beeldvorming van volwassen hersenen afgeleide neurale voorlopercel translocatie in galvanotaxis schakelen mogelijk te construeren.
Abstract
De ontdekking van neurale stamcellen en progenitorcellen (gezamenlijk aangeduid neurale voorlopercellen) (NPC) in de volwassen hersenen van zoogdieren heeft geleid tot een hoeveelheid onderzoek gericht op het gebruik multipotente en proliferatieve eigenschappen van deze cellen voor de ontwikkeling van strategieën neuroregeneratieve. Een kritische stap voor het succes van deze strategieën is de mobilisatie van NPCs naar een laesie na transplantatie exogene of de reactie van de endogene precursors die worden gevonden in de periventriculaire gebied van de CNS verbeteren. Derhalve is het essentieel om de mechanismen bevordering, leiden en verbeteren NPC migratie. Ons werk richt zich op het gebruik van gelijkstroom elektrische velden (dcEFs) het bevorderen en directe NPC migratie - een fenomeen dat bekend staat als galvanotaxis. Endogene fysiologische elektrische velden functioneren als kritische aanwijzingen voor celmigratie tijdens de normale ontwikkeling en wondheling. Farmacologische verstoring van detrans-neurale buis potentieel in axolotl embryo's veroorzaakt ernstige ontwikkelingsstoornissen afwijkingen 1. In de context van wondheling, is de snelheid van herstel van verwonde hoornvlies direct gecorreleerd met de grootte van de wond epitheliale potentieel dat ontstaat na verwonding, zoals blijkt uit farmacologische versterking of verstoring van dit dcEF 2-3. We toonden aan dat volwassen subependymale NPCs snel en gericht kathodische migratie ondergaan in vitro bij blootstelling aan een extern aangebracht dcEF. In dit protocol beschrijven we ons lab de technieken voor het creëren van een eenvoudige en effectieve galvanotaxis test voor hoge resolutie lange termijn observatie van gericht cellichaam translocatie (migratie) op een single-cell niveau. Deze test zou geschikt zijn voor het onderzoeken van de mechanismen die in cellulaire transductie dcEF motiliteit reguleren door het gebruik van transgene of knock-out muizen, korte interfererende RNA, of specifieke receptor agonisten / antagonisten.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren behandeling werden goedgekeurd door de Universiteit van Toronto Animal Care Comite in overeenstemming met de institutionele richtlijnen (protocol nr. 20009387). De volgende methoden worden uitgevoerd met steriele instrumenten en technieken, in een laminaire stroming kap indien van toepassing.
In het protocol onderstaande tekst de uitdrukking "EFH-SFM" verwijst naar serumvrij medium, aangevuld met epidermale groeifactor, basische fibroblast groeifactor en heparine. EFH-SFM wordt gebruikt bij het onderzoek naar de galvanotaxis van ongedifferentieerde NPCs omdat deze mitogenen behouden NPC's in hun ongedifferentieerde toestand 4. Bij het onderzoek van de galvanotaxis NPCs geïnduceerd om te differentiëren tot rijpe celtypen, "FBS-SFM" verwijst naar serumvrij medium aangevuld met 1% foetaal runderserum. FBS bevordert de differentiatie van NPC's in rijpe neurale fenotypes 5.
1. Isolatie en Cultuur van Neurale Voorlopers (Nietgetoond in video)
- Verdoven van een CD1 muizen (6-8 weken oud) met isofluorane en opoffering via cervicale dislocatie.
- Doven het hoofd in 70% ethanol en onthoofden van het dier met scherpe dissectie schaar.
- Terwijl de kop met chirurgische forceps, verwijder de huid op het dorsale oppervlak van de schedel bloot te leggen.
- Met een scalpel en geen. 11 messen, scoren de schedel bij de voorhoofdsholte langs de mediolaterale as en ook langs de pijlnaad in de rostrocaudal richting.
- Schil de pariëtale botten uit de buurt van het hoofd met geen. 7 gebogen tang, zorg ervoor dat u doorboren het hersenweefsel.
- Steek een dunne spatel onder de hersenen vanaf onder de kleine hersenen en het bevorderen van de richting van de olfactorische bollen. Terwijl de schedel op zijn plaats met een pincet, trek de hersenen uit de schedel en onmiddellijk te plaatsen in ijskoud kunstmatige cerebrospinale vloeistof (zie recepten).
- Onder een dissectie microscoop met sterieledissectie schaar en pincet snijd de hersenen in de helft over de middellijn. Draai elk halfrond, zodat de mediale (cut) oppervlak naar boven wijst.
- Selecteer een halve bol, en met de mediale oppervlak naar boven, zoek de splenium van het corpus callosum (achterste gedeelte van het corpus callosum).
- Een insnijding van het oppervlak van de cortex de splenium van het corpus callosum langs de dorsoventrale as.
- Schillen ingesneden cortex naar de bulbus olfactorius tot de mediale en laterale wanden van de laterale ventrikel bloot.
- Draai het halfrond, zodat het dorsale oppervlak naar boven is gericht, en gebruiken gebogen microscissors uit te snijden en het verzamelen van de blootgestelde mediale en laterale muren, die de periventriculaire regio waar NPC's wonen 6 bevatten.
- Herhaal stappen 1.8-1.11 voor de andere halfrond.
- Pipetteer de geïsoleerde weefsel in 7 ml trypsine-oplossing (zie recept hieronder) in een 15 cc tube, en plaats de buis op een rocker in een 37 ° Cincubator gedurende 25 min.
- Centrifugeer het buisje bij 1500 rpm gedurende 5 min, zuig de supernatant en resuspendeer het weefsel in 2 ml trypsine inhibitor oplossing (zie recept).
- Voorzichtig het weefsel voorzichtig fijnstampen met een klein boorgat Pasteur pipet 30 tot 50 keer om luchtbellen te voorkomen.
- Centrifugeer het buisje bij 1500 rpm gedurende 5 min, zuig de supernatant en resuspendeer in 1-2 ml SFM (zie recept) door tritureren de pellet 3-5 keer.
- Centrifugeer het buisje bij 1500 rpm gedurende 3 min, aspireer het supernatant en resuspendeer in 1 ml SFM + EFH.
- Tellen leven celdichtheid met een hemocytometer en plaat cellen in een T25 kweekkolf bij een dichtheid van 10 cellen per ul in SFM + EFH.
- Laat de cultuur te groeien gedurende 7 dagen ongestoord aan vrij zwevende primaire neurosferen bestaat uit NPCs opleveren.
2. Galvanotaxis Kamer Voorbereiding
- Plaats 3 vierkante glas niet. 1 dekglaasjes (22 x 22 x 0,17 mm) ina fles 6 N zoutzuur 's nachts.
- De volgende dag met een diamant-tip glas-cutter tot 6 rechthoekige stroken (22 x 5 x 0,17 mm) van glas gesneden van niet vierkant. 1 dekglaasjes.
- Breng de zuurgewassen vierkante en rechthoekige slips glijdt in een laminaire stroming kap. Was de rechthoekige en vierkante strips eerst met 70% ethanol dan, met weefselkweek-grade geautoclaveerd water en laten drogen op een Kim Wipe (voor extra steriliteit, kan het glas worden toegestaan aan de lucht drogen).
- Toepassing vacuum vet aan de omtrek van een oppervlak van het vierkant objectglaasjes en verzegelen met de basis van 60 mm plastic petrischalen.
- Toepassing vacuum vet langs de lengteas van een oppervlak van de rechthoekige glazen strips en verzegelen om de randen van de vierkante objectglaasjes (zodanig dat zij evenwijdig aan elkaar) om een centrale trog maken.
- UV-steriliseer de kamers ten minste 15 min in de laminaire flow kast.
- Pipetteer 250-300 pl poly-L-lysine op de centrale holte van de kamers en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Ongeveer 15 min vóór het einde van de incubatieperiode bereiden Matrigel oplossing (zie recept).
- Zuig het poly-L-lysine, was de centrale troggen met 1 ml van geautoclaveerd water en pipet 250-300 pi Matrigel oplossing op de centrale troggen.
- Incubeer de kamers bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Zuig het Matrigel oplossing en voorzichtig de centrale troggen wassen met 1-2 ml SFM.
- Pipetteer 100 ul van EFH-SFM of FBS-SFM op de centrale troggen en breng de galvanotaxis kamers op het toneel van een tellende microscoop.
- Pipetteer 3-4 ml van de neurosfeer cultuur bevattende in een 60 mm petrischaal en breng de petrischaal in het stadium van het tellen microscoop.
- Op een bezichtiging doel van 5x, gebruik maken van een P10 pipet tot 5-8 gehele neurosferen (maximaal vier per keer) over te dragen op de centrale dal van elk galvanotaxiskamer zonder dissociëren ze, en voorzichtig uit de neurosferen rond de centrale trog zonder verstoring van de Matrigel substraat.
- Voeg een extra 150 tot 200 ul van EFH-SFM of FBS-SFM op de centrale dalen.
- Breng de galvanotaxis kamers in een 37 ° C, 5% CO2, 100% bevochtigde incubator voor 17-20 uur (indien analyseren ongedifferentieerde NPC) om de neurosferen te houden aan de Matrigel substraat en in enkele cellen los zoals getoond in figuur 1 . Als analyse gedifferentieerde NPCs dient de incubatietijd te worden verlengd tot 69-72 uur om de differentiatie van de cellen mogelijk.
3. Leef Cell Time-Lapse Imaging
- De live cell imaging systeem equilibreren bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende ten minste 30 minuten voor aanvang van de time-lapse opname.
- Knip twee 12 cm stukken van 1 mm diameter Zilver draad, spoel ze van het ene uiterste, en plaats ze in Clorox bLeach gedurende 20 min tot Ag / AgCl elektroden vormen.
- Breng de galvanotaxis kamers op het stadium van een microscoop geteld en selecteren welke kamer wordt gebruikt voor live-cell imaging migratie analyse gebaseerd op de volgende criteria: i) de neurosferen moet bijna volledig gedissocieerd tot afzonderlijke cellen en ii) de cellen moeten beschikken ronde morfologie met weinig tot geen processen die zich vanaf de cellichamen.
- Overdracht van de geselecteerde galvanotaxis kamer in een laminaire stroming kap, maar ook een afzonderlijk vierkante no. 1 glas dekglas en vacuüm vet.
- Was de afdekkap slip met 70% ethanol dan met geautoclaveerd water en breng een strook vacuum vet op twee parallelle randen van het dekglaasje.
- Zuig het kweekmedium van de centrale dal van de kamer, dan snel plaats het deksel slip (vet-kant naar beneden) op de kamer, zodat het vet strips rusten op de twee parallelle rechthoekige glazen stroken effectief, een dak makennaar de kamer.
- Pipetteer 100 ul van verse EFH-SFM of FBS-SFM in de centrale trog via capillaire werking.
- Gebruik vacuum vet grenzen voor pools van kweekmedia maken op elk uiteinde van de centrale goot, zoals weergegeven in figuur 2.
- Knip twee 15 cm stukken van PVC-buizen, en gebruik een 10 cc spuit met een 18 gauge naald aan agarose oplossing zorgvuldig te injecteren in de slang, zodat er geen luchtbellen ontstaan in de buizen, en laat de gel te stollen gedurende 5 minuten.
- Breng de galvanotaxis kamer naar de live cell imaging systeem, samen met de agarose gel buizen, Ag / AgCl elektroden en een paar lege 60 mm petrischalen die wordt gebruikt als kweekmedium reservoirs en bevat de Ag / AgCl elektroden. Laat de galvanotaxis kamer te rusten binnen de 37 ° C, 5% CO2 omgeving voor 20-30 min.
- Gedurende deze tijd, de voorbereiding van de deksels van de 2 lege petrischalen en het deksel van de petrischaal galvanotaxis kamer is door het boren van gatenin hen met een Dremel of iets dergelijks zoals getoond in figuur 3.
- Pipetteer 1 tot 1,5 ml EFH-SFM of FBS-SFM op beide zijden van de centrale trog en 7-8 ml SFM in elke lege petrischaal. Plaats een petrischaal aan elke kant van de centrale galvanotaxis kamer van de trog en plaats een Ag / AgCl elektrode in elk gerecht. De kloof tussen de galvanotaxis kamer en de petrischalen op elektrische continuïteit te leggen met de agarose gel bruggen, zoals weergegeven in figuur 4.
- Sluit de Ag / AgCl elektroden op een externe voeding, met een ampèremeter in serie met elektrische stroom te meten, en schakel de voeding. Gebruik een voltmeter om de sterkte van het elektrische veld meten direct aan de centrale trog en het uitgangsniveau van de voeding totdat de gewenste elektrische veldsterkte bereikt (de assays uitgevoerd in dit laboratorium gebruik van een dcEF sterkte van 250 mV / mm met elektrische stroom tussen de 1 en 1,5 mA).
- Initiate de time-lapse-module op de live-cell imaging systeem, en dat het experiment uit te voeren voor de gewenste hoeveelheid tijd. Na voltooiing van de test vast de cellen in 4% paraformaldehyde voor standaard immunokleuring analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kinematische analyse blijkt dat in de aanwezigheid van een 250 mV / mm dcEF, ongedifferentieerde NPCs zeer gericht en snelle galvanotaxis naar de kathode (Figuur 5A, Movie 1) vertonen. In afwezigheid van een dcEF wordt willekeurige beweging van de cellen waargenomen (Figuur 5B, Movie 2). Dit veldsterkte> 98% van ongedifferentieerde NPCs migreren voor de gehele 6-8 hr waarvoor zij worden afgebeeld, en aangezien er dode cellen migreren niet suggereert dat zij levensvatbaar blijven gedurende deze periode in de afwezigheid of aanwezigheid van een dcEF.
Gedifferentieerde fenotype ondergaan verwaarlozen migratie zowel in de aanwezigheid en afwezigheid van een dcEF (Films 3, 4). Subsets van gedifferentieerde cellen verlengen processen die doorgaans loodrecht uitlijnen op de richting van de dcEF, maar geen merkbare cellichaam translocatie waargenomen.
Immunokleuring controleert of NPCs positieve expressio behoudenn van de neurale precursor marker nestin na 6 uur van dcEF blootstelling (Figuur 6A). In de assays waarbij NPCs geïnduceerd om te differentiëren tot rijpe fenotypes de meeste cellen het mature astrocyten marker gliale fibrillaire zure proteïne (GFAP) na 6 uur van dcEF blootstelling (Figuur 6B).
De primaire antilichamen gebruikt in deze analyses zijn als volgt: muizen monoklonaal anti-nestine (1:400, Millipore, Canada) en konijn polyklonaal anti-GFAP (1:500, Sigma, Canada). De secundaire antilichamen die in deze analyses zijn als volgt: geit-anti-muis geconjugeerd met Alexafluor 568 (1:400, Invitrogen-Gibco, Canada), en geit-anti-konijn geconjugeerd met Alexafluor 488 (1:400, Invitrogen-Gibco , Canada).
Figuur 1. Neurosferen zich aan de Matrigel substraat en dissociaten in enkele cellen na 17 uur incubatie bij 37 ° C / 5% CO2, 100% vochtigheid in EFH-SFM.
Figuur 2. Illustratie van galvanotaxis kamer. Strips van vacuüm vet worden gebruikt om een pool van kweekmedia aan weerszijden van de centrale trog maken.
Figuur 3. Schema van gaten worden geboord in de deksels galvanotaxis de kamer en het kweekmedium reservoirs. De 7 mm diameter gaten in beide deksels worden gebruikt om de agarose gel buisjes. De 4 mm diameter gaten in het deksel van de galvanotaxis kamer wordt gebruikt om de elektrische potentiaal direct aan de centrale trog met een voltmeter meten. De 4 mm diameter in het deksel van het kweekmedium reservoir is om de Ag / AgCl elektrode van het deksel van de schaal uitsteken voor aansluiting op de voeding.
Figuur 4. Illustratie van galvanotaxis kamer assemblage voor time-lapse imaging. De galvanotaxis kamer is centraal petrischaal, waarbij de cellen worden uitgeplaat. De media in de centrale petrischaal behuizing galvanotaxis de kamer hetzij SFM + EFH of SFM + 1% FBS. De petrischalen aan weerszijden van de galvanotaxis kamer worden gevuld met SFM en bevatten ook de Ag / AgCl elektroden. Deze elektroden zijn aangesloten op een externe voeding, en het overbruggen van de drie petrischalen met agarose-gel bruggen vormt een compleet circuit.
Figuur 5. In de presentatiece van een dcEF ongedifferentieerde NPC's zijn volop in beweging galvanotactic migratie naar de kathode (A), terwijl in de afwezigheid van een dcEF de cellen ondergaan willekeurige radiale migratie (B).
Figuur 6. Immunokleuring verifieert NPCs blijven nestin-positieve ongedifferentieerde precursors na 6 uur van blootstelling dcEF (A) en dat NPCs geïnduceerd om te differentiëren vooral de oudere astrocyten marker GFAP expressie na 6 uur van blootstelling dcEF (B).
Film 1. Time-lapse video van ongedifferentieerde NPCs blootgesteld aan een dcEF. NPCs uitgeplaat op galvanotaxis kamers gedurende 17 uur in SFM + EFH en vervolgens blootgesteld aan een 250 mV / mm dcEF vertonen snelle migratie en gericht naar de kathode. 1 seconde van video = 15 minuten real-time. Klik hier om mo te bekijkenvie.
Movie 2. Time-lapse video ongedifferentieerde NPCs in afwezigheid van een dcEF. NPCs uitgeplaat op galvanotaxis kamers gedurende 17 uur in SFM + EFH en afgebeeld in afwezigheid van een aangelegd dcEF ondergaan willekeurige migratie. 1 seconde van video = 15 minuten real-time. Klik hier om naar de film te bekijken .
Movie 3. Time-lapse video van gedifferentieerde NPCs blootgesteld aan een dcEF. NPCs uitgeplaat op galvanotaxis kamers voor 69-72 uur in SFM + FBS en vervolgens blootgesteld aan een 250 mV / mm dcEF vertonen weinig migratie in elke richting. 1 seconde van video = 15 minuten real-time. Klik hier om naar de film te bekijken .
Movie 4. Time-lapse video van gedifferentieerde NPCs in de afwezigheid van een dcEF. NPCs uitgeplaat op galvanotaxis chambers voor 69-72 uur in SFM + FBS en afgebeeld in afwezigheid van een aangelegd dcEF vertonen weinig migratie in elke richting, vergelijkbaar met gedifferentieerde NPCs die zijn blootgesteld aan een dcEF. 1 seconde van video = 15 minuten real-time. Klik hier om naar de film te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is aangepast van de reeds lang gevestigde methoden van eerdere studies 7-9. Galvanotactic kamers kunnen worden geconstrueerd met een verscheidenheid van verschillende technieken, waaronder de bouw van een aparte glazen goed voor opsluiting van cel zaaien of met CO 2 laser ablatie voor microfabricage van de centrale trog 10,11. Sommige technieken kunnen omslachtiger of duurder dan andere. Wij hebben er een eenvoudige en kosteneffectieve test voor de bouw van een NPC galvanotaxis kamer met gebruik van materialen vaak gevonden in de meeste cel-biologische laboratoria. Ons protocol bestaat uit een verwarmd, bevochtigd, CO 2 incubator gereglementeerde dat de live-cell imaging systeem om de cellen onder optimale omstandigheden te handhaven voor continue lange termijn beeldvorming omringt. Het ontbreken van een dergelijke inrichting is een beperking van een aantal eerder gepubliceerde technieken 9,12.
Recent werk van een andere groep vertoonden een gelijksoortige galvanotactic gedrag van cellen van een hippocampus cellijn 13, met behulp van een ander protocol en een meer arbeidsintensieve galvanotaxis kamer-ontwerp. De assay is bijzonder elegant in dat een analyse van de identieke uitgangspopulatie van cellen mogelijk maakt - primaire celculturen van ongedifferentieerde neurosfeercellen afgeleid NPCs - die zijn blootgesteld aan verschillende voorwaarden zodoende de vergelijking van de trekkende eigenschappen van zowel ongedifferentieerde en gedifferentieerde cellen, simpelweg door het wijzigen van de elementen die voor de cultuur media binnen de galvanotaxis kamer te vullen.
De test die in dit protocol is een krachtig hulpmiddel voor de lange termijn bijhouden en analyseren van NPC galvanotaxis, en eventueel andere celtypen die galvanotactic migratie 14,15 ondergaan. Zoals bij elk protocol, kan nuances in de voorbereiding en uitvoering van bepaalde stappen in dit protocol leidt tot succesvolle resultaten. De volgende richtlijnen en suggesties dienen alsSist in de succesvolle uitvoering van dit protocol:
- De cellen voorkomen ondergaan stroom-geassocieerde warmte dood zijn de afmetingen van de kamer galvanotaxis berekend om de effecten van Joule verwarmen 16 minimaliseren. De warmte die in de kamer is evenredig met het kwadraat van de stroom die er doorheen, die op zijn beurt evenredig met de doorsnede van de galvanotaxis kamer. We raden handhaving van de dwarsdoorsnede van de kamer als 2,04 mm 2 (12 mm x 0,17 mm).
- Na 7 dagen kweken neurosferen kunnen worden verzameld, gedissocieerd tot afzonderlijke cellen en opnieuw uitgeplaat in groeifactor omstandigheden (een proces genoemd "passage") om secundaire neurosferen geven. Krijgen we onze resultaten met die neurosferen ondergaan minder dan drie passages (maximum 21 dagen in cultuur) met een zichtbare daling trekkende vermogens gebruik neurosferen die zijn meer numbe passager keren. Dit komt overeen met onze eerdere werk waaruit blijkt dat op langere termijn culturen veranderen celkinetica 17.
- Bij het selecteren van een kamer die galvanotaxis NPC voor observatie is belangrijk om een kamer waarin de afgeleide neurosfeer cellen gedissocieerd en om het accurate kinematische analyse mogelijk. Als de neurosferen hebben overgenomen, onlosmakelijk verbonden goed (NPC's zijn aan elkaar gehecht en kan niet worden afgebakend), wordt de analyse van de individuele cel trekgedrag worden bijna onmogelijk. De culturen moeten meer tijd om voorafgaand aan de observatie dissociëren. Bovendien kunnen cellen die dicht bij elkaar fysiek onmogelijk de migratie van naburige cellen. Onze analyses hebben aangetoond dat cellen gepositioneerd ten minste een cellichaam afstand van de dichtstbijzijnde naburige cel migreren aanzienlijk grotere snelheden dan cellen die zijn geclusterd in het midden van de gedissocieerde neurosfeer, zij het met gelijke directedness.
- Als er een overvloed van processen zich vanaf de NPC, dit een indicatie dat de cellen beginnen te differentiëren en daarom geen werkelijke weergave van een ongedifferentieerde populatie. Een voordeel van het bereiden van de galvanotaxis kamers in drievoud is dat de resterende twee kamers die niet zijn geselecteerd voor time-lapse beelden kunnen direct worden bepaald na de geïncubeerde plating periode (stap 2.16) en immuun de differentiatie profiel van de cellen te controleren.
- Voor een optimaal resultaat van de cultuur media moeten vers bereid en aangevuld op elke dag dat het verplicht is.
- De time-lapse beelden en de daaropvolgende kinematische analyses zijn zeer gevoelig voor verstoring van het monster. De live-cell imaging microscoop moet worden gelegd op een lucht tafel om trillingen te minimaliseren, en het systeem mag niet worden verstoord tijdens het experimenteren.
Ons laboratorium routinematig beelden NPC galvanotas voor 6-8 uur, hoewel tot 15-hr analyses uitgevoerd. Over de 15-uur periodes, de dcEF de overkant van de kamer daalde van 250 mV / mm tot 227 mV / mm (9,2% afname). Langere periodes beeldvorming onvermijdelijk de pH van de media in de kamer, verder aanpassen van de elektrische veld. Daarom wordt aanbevolen om de media vervangen ongeveer elke 6 uur. Echter, hebben wij controlewerkzaamheden uitgevoerd 8-uur NPC galvanotaxis testen zonder media vervangen en hebben niet waargenomen merkbare celdood (dode cellen niet migreren) of daling van de celmotiliteit, de cellen behouden hun snelheid van migratie gedurende het experiment. De onderzoeker kan ook de diepte van de kamer naar de stabiliteit van de dcEF 10 te verhogen.
Na beeldvorming wordt eencellige kinematische tracking analyse uitgevoerd op een subset van de afgebeelde cellen gebruik van tracking module Zeiss AxioVision software. Cellen worden geselecteerd voor analyse wanneer zij dichter bij de rand van gelokaliseerdede gedissocieerde neurosfeer en ten minste een cellichaam afgezien van de dichtstbijzijnde cel. De reden hierachter is om de kans op cellen overlappen elkaar te minimaliseren tijdens het volgen, die zou maken het bijhouden van individuele cellen bijna onmogelijk. We analyseren de volgende vier parameters van de migratie:
- X-as verplaatsing - de afstand een cel migreert in de richting van de as, die evenwijdig is aan de richting van de dcEF.
- Velocity - de lineaire afstand tussen begin-en eind-cel posities gedeeld door de verlopen tijd.
- Gerichtheid - x-as verplaatsing gedeeld door de lineaire afstand tussen de eerste en de laatste cel posities.
- Tortuositeit - de totale pad afgelegde afstand door de cel gedeeld door de afstand in rechte lijn tussen de eerste en laatste cel posities.
De laatste twee parameters zijn indicatoren van hoe recht de migratieroute in een bepaalde richting.
18. Een geschikt substraat en kweekmedia zouden moeten worden geselecteerd voor andere celtypes en de duur van cel seeding voorafgaand aan beeldvorming te passen nodig. Met name kunnen de afmetingen van de kamer moeten worden gewijzigd afhankelijk van de dikte van het weefsel dat wordt onderzocht (bijvoorbeeld als een weefsel plak geplaatst in de kamer). De onderzoeker moet in gedachten te houden that voor een set elektrisch veld, de stroom door de kamer is recht evenredig met de doorsnede van de kamer, aanzienlijke uitbreidingen de afmetingen van de kamer, kan leiden tot verhoogde Joule verwarming gerelateerde celdood.
De technieken beschreven in dit verslag, een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van de belangrijke, maar niet op grote schaal onderzocht, fenomeen van galvanotaxis. Het vermogen van cellen om te reageren op dcEFs heeft direct therapeutische implicaties. Elektrische stimulatie (diepe hersenstimulatie) reeds nuttig gebleken bij de behandeling van de ziekte van Parkinson, en is aangetoond dat hippocampale neurogenese via in een muismodel 19,20. Een volledig begrip van de cellulaire mechanismen verantwoordelijk voor dcEF transductie in cellulaire motiliteit kan uiteindelijk leiden tot het gebruik van elektrische stimulatie als klinische middel voor het bevorderen en leiden endogene precursor migratie plaatsen van letsel of disease om de reparatie te vergemakkelijken. De hierboven beschreven methoden een eenvoudige en robuuste manier onderzoeken deze processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (subsidie # 249669 en # 482986) en Hart en Stroke Foundation van Canada (subsidie # 485508). De auteurs danken Youssef El-Hayek en Dr Qi Wan voor hun hulp bij de ontwikkeling van de experimentele protocollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Borgens, R. B., Shi, R. Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential. Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo. Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
- Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).
- Erickson, C. A., Nuccitelli, R. Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields. J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).
- Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent. J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).
- Li, L. Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration. Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).
- Song, B. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Huang, C. -W., Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Young, T. -H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- SATO, M. Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells. Biosystems. 88, 261-272 (2007).
- Meng, X. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).
- Zhao, M. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. The FASEB Journal. , (2002).
- Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).
- McCaig, C. D. Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential. Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).
- Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations. Nat. Med. 8, 268-273 (2002).
- Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields. PLoS ONE. 6, e23808 (2011).
- Deuschl, G. A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease. N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).
- Stone, S. S. D. Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory. J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).
