Summary
I detta protokoll visar vi hur man konstruerar egna kammare som tillåter tillämpningen av en likström elektriskt fält för att möjliggöra time-lapse avbildning av vuxna hjärnan härrör neurala translokation prekursorcell under galvanotaxis.
Abstract
Upptäckten av neurala stam-och stamfaderceller (kollektivt benämnda neurala prekursorceller) (NPC) i den vuxna däggdjur hjärnan har lett till en mängd forskning som syftar till att utnyttja de multipotenta och proliferativa egenskaperna hos dessa celler för utveckling av neuroregenerative strategier. Ett kritiskt steg för att lyckas med sådana strategier är att mobilisera NPC mot en lesion plats efter exogent transplantation eller för att öka responsen av de endogena prekursorer som finns i periventrikulär området av CNS. Därför är det viktigt att förstå de mekanismer som främjar, vägleda och förbättra NPC migration. Vårt arbete fokuserar på utnyttjandet av likström elektriska fält (dcEFs) för att främja och direkt NPC migration - ett fenomen som kallas galvanotaxis. Endogena fysiologiska elektriska fält fungerar som kritiska ledtrådar för cellmigrering under normal utveckling och sårläkning. Farmakologisk störning avtrans-neuralrörsdefekter potential i Axolotl embryon orsakar allvarliga utvecklingsstörningar missbildningar 1. I samband med sårläkning, är graden av reparation av skadade hornhinnan direkt korrelerad med storleken på epiteliala sår potential som uppstår efter skada, vilket framgår av farmakologisk förbättring eller avbrott i denna dcEF 2-3. Vi har visat att vuxna subependymala NPC genomgår en snabb och riktad katod migration in vitro när de utsätts för en externt applicerad dcEF. I detta protokoll beskriver vi vår labs tekniker för att skapa en enkel och effektiv galvanotaxis analys för högupplöst långsiktigt observation av riktad cellkroppen translokation (migration) på en enda cellnivå. Denna analys skulle vara lämplig för att undersöka de mekanismer som reglerar dcEF transduktion till cellulär motilitet genom användning av transgena eller knockout-möss, korta interfererande RNA, eller specifika receptoragonister / antagonister.
Protocol
Alla förfaranden som rör djurhantering godkändes av University of Toronto Animal Care kommittén i enlighet med institutionella riktlinjer (protokoll nr. 20.009.387). Följande metoder bör utföras med sterila verktyg och tekniker, i ett dragskåp med laminärt flöde i förekommande fall.
I protokollet texten nedan, hänvisar uttrycket "EFH-SFM" till serumfria media kompletterade med epidermal tillväxtfaktor, basisk fibroblasttillväxtfaktor och heparin. EFH-SFM används när undersöker galvanotaxis av odifferentierade NPC eftersom dessa mitogener upprätthåller NPCs i sitt odifferentierade tillstånd 4. När undersöker galvanotaxis av NPC inducerats att differentiera till mogna celltyper, "FBS-SFM" avser serumfria media kompletterade med 1% fetalt bovint serum. FBS främjar differentiering av NPC: er till mogna neurala fenotyper 5.
1. Isolering och odling av neurala prekursorer (ejvisas i video)
- Bedöva en CD1 mus (6-8 veckor gamla) med isofluoran och offer via cervikal dislokation.
- Släck huvudet i 70% etanol och halshugga djuret med vassa dissekering sax.
- Håll huvudet med kirurgiska tång, ta bort huden på rygg ytan för att exponera skallen.
- Med hjälp av en skalpell och nej. 11 blad, poäng skallen vid främre sinus längs mediolateral axeln, och även längs den sagittala suturen i rostrocaudal riktning.
- Skala parietalben bort från huvudet utan. 7 böjda tänger, noga med att inte tränga igenom hjärnvävnaden.
- Stick in en tunn spatel under hjärnan från under lillhjärnan och framåt mot olfaktoriska glödlampor. Håll skallen på plats med pincett, dra försiktigt hjärnan från skallen och omedelbart placera den i iskall artificiell cerebrospinalvätska (se recept nedan).
- Enligt en dissektion mikroskop, med användning av sterildissekering sax och pincett klippa hjärnan i halv längs mittlinjen. Rotera varje hemisfär så att den mediala (cut) är vänd uppåt.
- Välj en halvsfär, och med den mediala ytan vänd uppåt, lokalisera splenium av corpus callosum (bakre regionen av corpus callosum).
- Göra ett snitt från ytan av barken till splenium av corpus callosum längs dorsoventral axeln.
- Skala den snittade cortex mot luktloben att exponera de mediala och laterala väggarna den laterala ventrikeln.
- Rotera halvklotet så att den dorsala ytan vänd uppåt, och använda krökta microscissors att skära ut och samla de exponerade mediala och laterala väggar, vilka innehåller den periventrikulär region där NPC bor 6.
- Upprepa steg 1,8-1,11 för den andra hemisfären.
- Pipettera den isolerade vävnaden i 7 ml trypsinlösning (se recept nedan) i en 15 cm slang, och placera röret på en vippa i en 37 ° Cinkubator under 25 minuter.
- Centrifugera röret vid 1.500 rpm under 5 minuter, aspirera supernatanten och återsuspendera vävnaden i 2 ml trypsin-inhibitor-lösning (se recept nedan).
- Försiktigt mal sönder vävnaden med en liten borrhål Pasteurpipett 30-50 gånger noga för att undvika luftbubblor.
- Centrifugera röret vid 1.500 rpm under 5 minuter, aspirera supernatanten och återsuspendera i 1-2 ml SFM (se recept nedan) genom triturering av pelleten 3-5 gånger.
- Centrifugera röret vid 1.500 rpm under 3 minuter, aspirera supernatanten och återsuspendera i 1 ml SFM + EFH.
- Räkna levande celltäthet med en hemocytometer och platta celler i en T25-odlingskolv vid en densitet av 10 celler per pl i SFM + EFH.
- Låt kulturen växa under 7 dagar ostörda för att ge fritt flytande primära neurosfärer består av NPCs.
2. Galvanotaxis Chamber Förberedelse
- Placera 3 kvadrat glas nr. 1 täckglas (22 x 22 x 0,17 mm) iNa flaska 6N saltsyra över natten.
- Nästa dag, använd en diamant-tip glas fräs för att skära 6 rektangulära remsor (22 x 5 x 0,17 mm) av glas från ruta nr. 1 täckglas.
- Överför syratvättade kvadratiska halk-och rektangulära slinker in ett laminärt flöde huva. Tvätta de rektangulära och kvadratiska remsor först med 70% etanol, sedan med vävnadsodling-grade autoklaverat vatten och låt torka på en Kim Wipe (för extra sterilitet, kan glaset får lufttorka).
- Applicera vakuum fett till omkretsen av en yta av de fyrkantiga glasskivor, och försegla dem till basen av 60 Petri mm plastskålar.
- Applicera vakuum fett längs den långa axeln av en yta av de rektangulära glas remsorna, och försegla dem till motsatta kanter hos de kvadratiska glasskivor (så att de är parallella med varandra) för att skapa ett centralt tråg.
- UV-sterilisera kamrarna under minst 15 minuter i dragskåp med laminärt flöde.
- Pipettera 250-300 pl av poly-L-Lysine på det centrala tråget av kamrarna och inkubera vid rumstemperatur under 2 timmar.
- Cirka 15 minuter före slutet av inkubationsperioden, bereda Matrigel lösningen (se recept nedan).
- Aspirera poly-L-lysin, tvätta de centrala trågen med 1 ml autoklaverat vatten, och pipettera 250-300 il Matrigel lösning på de centrala trågen.
- Inkubera kamrarna vid 37 ° C under 1 timme.
- Aspirera Matrigel lösningen och försiktigt tvätta de centrala trågen med 1-2 ml SFM.
- Pipettera 100 | il EFH-SFM eller FBS-SFM på de centrala tråg och överföra galvanotaxis kamrarna på scenen av en räkna mikroskop.
- Pipett 3-4 ml neurosfären-innehållande kulturen till en 60 mm petriskål och överföra petriskålen till det stadium av räkna mikroskop.
- Vid en visning mål 5x, använd en P10 pipett för att överföra 5-8 hela neurosfärer (upp till fyra åt gången) på den centrala tråg för varje galvanotaxiskammare utan att man klipper dem, och försiktigt sprida neurosfärer kring centrala tråg utan att störa Matrigel substratet.
- Lägg till ytterligare 150-200 ul EFH-SFM eller FBS-SFM på de centrala tråg.
- Överför galvanotaxis kamrarna i en 37 ° C, 5% CO 2, 100% fuktad inkubator under 17-20 timmar (om analys odifferentierade NPC) för att tillåta neurosfärema att vidhäfta till den Matrigel-substratet och dissocierar i enskilda celler, såsom visas i figur 1 . Om analysera differentierade NPC bör inkubationstiden förlängas till 69-72 timmar för att tillåta differentiering av cellerna.
3. Levande celler Time-lapse avbildning
- Låt levande cell imaging system för att uppnå jämvikt vid 37 ° C, 5% CO 2 under minst 30 min före initiering av tidsintervaller inspelning.
- Klipp två 12 cm bitar av 1 mm diameter silvertråd, spole dem från ena änden, och placera dem i Clorox Bläcker under 20 min för att bilda Ag / AgCl-elektroder.
- Överför galvanotaxis kamrarna på scenen av en räkna mikroskop och välja vilken kammare kommer att användas för live-cell imaging migrering baserad på följande kriterier: i) neurosfärema bör vara nästan helt dissocierade i enskilda celler och ii) celler bör ha runda morfologier med små-till-inga processer som sträcker sig från cellkropparna.
- Överföra de valda galvanotaxis kammaren i en huv med laminärt flöde, tillsammans med en separat kvadrat nr. 1 glas täckglas och vakuum fett.
- Tvätta locket glida först med 70% etanol, därefter med autoklaverat vatten, och tillämpa en remsa av vakuum fett på två parallella kanter på täckglaset.
- Sug odlingsmedierna från den centrala tråg av kammaren, sedan snabbt placera täckglaset (fett-nedåt) på kammaren så att fettet remsor vilar på de två parallella rektangulära glas remsor, effektivt skapa ett taktill kammaren.
- Pipettera 100 fil färska EFH-SFM eller FBS-SFM i den centrala tråg via kapillärkraft.
- Använd vakuum fett för att skapa gränser för pooler av odlingsmedier på varje ände av den centrala tråg, som visas i figur 2.
- Skär två 15 cm bitar av PVC-rör, och använda en 10 cm ^ spruta med en 18 gauge nål till noggrant injicera agaroslösning i slangen, säkerställer inga bubblor bildas i rören, och låta gelén stelna i 5 minuter.
- Överför galvanotaxis kammaren till den levande cell imaging system tillsammans med agarosgelen rören, Ag / AgCl elektroder, och ett par av tomma 60 mm Petriskålar som kommer att användas som odlingsmedier reservoarer och kommer att innehålla Ag / AgCl elektroder. Låt galvanotaxis kammaren för att vila i 37 ° C, 5% CO 2 miljö under 20-30 min.
- Under denna tid, förbereda locken på de 2 tomma petriskålar och locket i galvanotaxis kammarens petriskål genom att borra hålin dem med en Dremel eller liknande verktyg, såsom visas i figur 3.
- Pipettera 1-1,5 ml EFH-SFM eller FBS-SFM på vardera sidan av den centrala tråget, och 7-8 ml SFM i varje tom Petriskål. Placera en Petriskål på varje sida av galvanotaxis kammarens centrala tråg och placera en Ag / AgCl-elektrod i varje skål. Överbrygga klyftan mellan galvanotaxis kammaren och Petriskålarna att etablera elektrisk kontinuitet med agarosgelen bryggorna, såsom visas i figur 4.
- Anslut Ag / AgCl elektroder till en extern strömkälla, med en amperemeter i serie för att mäta elektrisk ström och slå på strömmen. Använd en voltmeter för att mäta styrkan av det elektriska fältet tvärs den centrala tråget, och justera utmatningen från strömförsörjningen tills den önskade elektriska fältstyrkan uppnås (analyserna utförs i denna labbet utnyttjar en dcEF styrka av 250 mV / mm med elektrisk ström mellan 1 och 1,5 mA).
- Initiativete den time-lapse modul på levande cell imaging system och att försök att köra för önskad tid. Efter avslutad analys fixera cellerna i 4% paraformaldehyd för standard immunfärgning analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kinematisk analys avslöjar att i närvaro av en 250 mV / mm dcEF, odifferentierade NPC uppvisar starkt riktade och snabba galvanotaxis mot katoden (figur 5A, film 1). I avsaknad av en dcEF, är slumpmässig rörelse av cellerna observerades (figur 5B, film 2). Vid denna fältstyrka,> 98% av odifferentierade NPC migrerar för hela 6-8 h för vilka de avbildas, och eftersom döda celler inte migrerar detta tyder på att de förblir livskraftiga under denna period i frånvaro eller närvaro av en dcEF.
Differentierade fenotyper genomgår försumbar migration både i närvaro och frånvaro av en dcEF (filmer 3, 4). Delmängder av differentierade celler sträcker processer som tenderar att anpassa vinkelrätt mot riktningen för dcEF, men ingen märkbar cellkroppen translokation observeras.
Immunfärgning verifierar att NPC upprätthåller positiv expression av neurala föregångare markör nestin efter 6 timmar i dcEF exponering (Figur 6A). I analyser som involverar NPC induceras att differentiera till mogna fenotyper, huvuddelen av celler uttrycker den mogna astrocyt markören gliafibrillärt surt protein (GFAP) efter 6 h av dcEF exponering (Figur 6B).
De primära antikropparna som användes i dessa analyser var följande: mus monoklonal anti-nestin (1:400, Millipore, Kanada), och polyklonala kanin-anti-GFAP (1:500, Sigma, Kanada). De sekundära antikropparna som användes i dessa analyser var följande: get-anti-mus konjugerad med Alexafluor 568 (1:400, Invitrogen-Gibco, Kanada), och get-anti-kanin konjugerat med Alexafluor 488 1:400 (, Invitrogen-Gibco , Kanada).
Figur 1. Neurosfärer vidhäfta Matrigel substratet och dissociåt i enskilda celler efter 17 h inkubation vid 37 ° C / 5% CO 2, 100% fuktighet i EFH-SFM.
Figur 2. Illustration av galvanotaxis kammare. Remsor av vakuum fett används för att skapa en pool av odlingsmedier på vardera sidan av den centrala tråget.
Figur 3. Schematisk hål som ska borras i locken i galvanotaxis kammaren och kultur reservoarerna mediet. De 7 mm diameter hål i båda locken används för att infoga agarosgelen rören. De 4 mm diameter hål i locket till galvanotaxis kammaren används för att mäta den elektriska potentialen tvärs över den centrala tråg med en voltmeter. Den 4 mm hål i locket av odlingsmediet återservoir är att Ag / AgCl-elektrod att skjuta ut från locket på skålen för anslutning till strömförsörjningen.
Figur 4. Illustration av galvanotaxis kammarens sammansättning för time-lapse avbildning. Den galvanotaxis kammaren är den centrala petriskål, i vilken cellerna stryks. Medierna inuti centrala petriskål bostäder galvanotaxis kammaren är antingen SFM + EFH eller SFM + 1% FBS. Petri-skålarna på vardera sidan av galvanotaxis kammaren är fyllda med skogsbruk och även innehålla Ag / AgCl-elektroder. Dessa elektroder är anslutna till en extern strömkälla och överbrygga de tre petriskålar med agaros-gel broar bildar en komplett krets.
Figur 5. I prece av en dcEF odifferentierade NPC genomgår en snabb galvanotactic migrering mot katoden (A), medan det inte finns något dcEF cellerna genomgår slumpmässiga radiella migration (B).
Figur 6. Immunofärgning verifierar att NPC förblir nestin-positiva odifferentierade prekursorer efter 6 timmar i dcEF exponering (A), och att NPC: er som induceras att differentiera mestadels uttrycka den mogna astrocyt markör GFAP efter 6 timmar i dcEF exponering (B).
Film 1. Time-lapse video av odifferentierade NPC utsatta för en dcEF. NPC pläterades på galvanotaxis kammare under 17 h i SFM + EFH, och exponerades sedan för en 250 mV / mm dcEF uppvisar snabb och riktad migration mot katoden. 1 sekund video = 15 minuter i realtid. Klicka här för att se movie.
Film 2. Time-lapse video av odifferentierade NPC i avsaknad av en dcEF. NPCs ströks ut på galvanotaxis kammare för 17 timmar i SFM + EFH och sedan avbildas i frånvaro av ett pålagt dcEF genomgår slumpmässig migration. 1 sekund video = 15 minuter i realtid. Klicka här för att se filmen .
Film 3. Time-lapse video differentierade NPC utsatta för en dcEF. NPC pläterades på galvanotaxis kammare för 69-72 timmar i SFM + FBS, och exponerades sedan för en 250 mV / mm dcEF uppvisar mycket liten migration i någon riktning. 1 sekund video = 15 minuter i realtid. Klicka här för att se filmen .
Film 4. Time-lapse video av differentierade NPC i avsaknad av en dcEF. NPCs ströks ut på galvanotaxis chambers för 69-72 timmar i SFM + FBS, och sedan avbildas i avsaknad av en tillämpad dcEF uppvisar mycket liten invandring i någon riktning, liknande differentierade NPC som utsätts för en dcEF. 1 sekund video = 15 minuter i realtid. Klicka här för att se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll har anpassats från väletablerade metoder för tidigare studier 7-9. Galvanotactic kammare kan konstrueras med användning av en mängd olika tekniker, inklusive byggandet av en separat glas väl för inneslutning av cellsådd, eller använda CO 2 laserablation för mikrotillverkning av den centrala tråget 10,11. Vissa tekniker kan vara mer arbetskrävande eller kostsam än andra. Vi har beskrivit en enkel och kostnadseffektiv analys för att bygga en NPC galvanotaxis kammare med material som vanligtvis finns i de flesta laboratorier Cell Biology. Vår Protokollet innehåller en uppvärmd, befuktad CO 2 reglerad inkubator som omger levande systemet cell imaging att hålla cellerna under optimala förhållanden för kontinuerlig långsiktig avbildning. Bristen på en sådan apparat är en begränsning av vissa tidigare publicerade tekniker 9,12.
Senaste arbete av en annan grupp visade liknande Galvanotactic beteende celler från en hippocampus cellinje 13, med ett annat protokoll och en mer arbetsintensiv galvanotaxis kammare design. Vår analys är särskilt elegant i att den medger en analys av den identiska start populationen av celler - primära cellkulturer av odifferentierade härledda neurosfärceller NPC - som har utsatts för olika betingelser varigenom en jämförelse av den flyttande egenskaperna hos både odifferentierade och differentierade celler, helt enkelt genom att ändra de faktorer som används för att komplettera odlingsmedia inom galvanotaxis kammaren.
Analysen som presenteras i detta protokoll är ett kraftfullt verktyg för långsiktig uppföljning och analys av NPC galvanotaxis, och eventuellt andra celltyper som genomgår galvanotactic migration 14,15. Som med alla protokoll, kan nyanser i utarbetandet och genomförandet av vissa steg i detta protokoll leda till misslyckade resultat. Följande riktlinjer och förslag bör sombiträda i ett framgångsrikt genomförande av detta protokoll:
- För att förhindra att cellerna från att genomgå elektrisk ström-associerad värmedöden, har dimensionerna hos galvanotaxis kammarens beräknats för att minimera effekterna av Jouleuppvärmning 16. Den värme som alstras i kammaren är proportionell mot kvadraten av strömmen som flyter genom den, vilket i sin tur är proportionell mot tvärsnittsarean för galvanotaxis kammaren. Vi rekommenderar upprätthålla tvärsnittsarea av kammaren som 2,04 mm 2 (12 mm x 0,17 mm).
- Efter 7 dagars kultur neurosfärer kan samlas, dissocieras till enskilda celler och återutströks i tillväxt-faktor förhållanden (en process kallad passage ") för att ge sekundära neurosfärer. Vi får våra bästa resultat med neurosfärer som har genomgått mindre än tre passager (max 21 dagar i odling), med en synlig minskning av flyttande funktioner när du använder neurosfärer som har passerats större number gånger. Detta överensstämmer med vårt tidigare arbete visar att långsiktiga kulturer förändrar cellernas kinetik 17.
- När du väljer en galvanotaxis kammare som innehåller NPC för observation, är det viktigt att välja en kammare i vilken neurosfärceller härledda cellerna har dissocierade väl för att tillåta korrekta kinematiska analyser. Om neurosfärer inte skiljas väl (NPC följs varandra och inte kan avgränsas), kommer analys av enskilda celler flyttningsbeteendet bli nästan omöjligt. Kulturerna bör få mer tid att dissociera före observation. Dessutom, kan celler som är i nära närhet till varandra hindrar fysiskt migrationen av angränsande celler. Våra analyser har visat att celler placerade åtminstone en cell kropp bort från deras närmaste granncell migrera vid signifikant högre hastigheter än celler som är grupperade tillsammans i närheten av centrum av den dissocierade neurosfären, om än med lika ödesdigractedness.
- Om det finns ett överflöd av processer som sträcker sig från NPC, är detta en indikator på att cellerna har börjat differentiera och därför är de inte en sann bild av en odifferentierad befolkning. En fördel med att förbereda galvanotaxis kamrarna i tre exemplar är att de återstående två kamrarna som inte väljs ut för time-lapse avbildning kan fastställas omedelbart efter deras inkuberas plätering period (steg 2,16) och immunofärgades att kontrollera differentiering profilen av cellerna.
- För bästa resultat odlingsmedierna vara nyberedd och kompletteras varje dag som det behövs.
- De time-lapse bilder och efterföljande kinematiska analyser är mycket känsliga för störning av provet. Live-cell imaging mikroskop ska placeras på en luft bord för att minimera vibrationer och systemet bör inte oroade under experiment.
Vårt labb rutinmässigt bilder NPC galvanotaxel för 6-8 timmar, men upp till 15-tim analyser har utförts. Under de 15-hr perioder minskade dcEF över kammaren från 250 mV / mm till 227 mV / mm (9,2% minskning). Längre imaging perioder ändra oundvikligen pH media i kammaren, vilket ytterligare modifiera det elektriska fältet. Det rekommenderas att ersätta mediet ungefär var 6 timmar. Vi har dock utfört 8-tim NPC galvanotaxis analyser utan media ersättning och har inte observerats någon märkbar celldöd (döda celler inte migrerar) eller minskning cellmotilitet, cellerna bibehåller sin hastighet av migration under hela experimentet. Utredaren kan också minska djupet av kammaren för att öka stabiliteten hos dcEF 10.
Efter avbildning är encelliga kinematisk spårning analys på en delmängd av de avbildade cellerna med Zeiss AxioVision programvaran spårning modul. Celler selekteras för analys om de är lokaliserade närmare kanten avden dissocierade neurosfären och åtminstone en cellkropp bortsett från dess närmaste cellen. Skälet till detta är att minimera sannolikheten av celler överlappar varandra under spårning, vilket skulle göra att spåra enskilda celler nära omöjligt. Vi analyserar de följande fyra parametrar av migration:
- X-axeln förskjutning - avståndet en cell migrerar i riktning mot axeln, vilken är parallell med riktningen för dcEF.
- Velocity - den linjära avståndet mellan första och sista cell positioner dividerat med förfluten tid.
- Directedness - x-axeln förskjutning dividerat med linjärt avstånd mellan de första och sista cell positioner.
- Slingrighet - den totala vägen sträcka som cellen delat med linjärt avstånd mellan första och sista cell positioner.
De senare två parametrarna är indikatorer på hur rak migrationen vägen är i en viss riktning.
18. Ett lämpligt substrat och kultur media skulle behöva väljas för andra celltyper, och varaktigheten av cellsådd före avbildning bör justeras vid behov. Anmärkningsvärt kan dimensionerna hos kammaren behöva ändras beroende på tjockleken hos vävnaden som undersöks (t ex om en vävnad skiva placeras i kammaren). Utredaren bör tänka på THAt för en uppsättning elektriskt fält, är strömflödet genom kammaren direkt proportionell mot tvärsnittsarean hos kammaren, och därför betydande utvidgningar till kammaren dimensioner kan resultera i ökad Joule-uppvärmning-relaterad celldöd.
De tekniker som beskrivs i denna rapport ger ett kraftfullt verktyg för att undersöka viktiga, men inte studerats, fenomenet galvanotaxis. Förmågan hos celler att svara på dcEFs har direkta terapeutiska implikationer. Elektrisk stimulering (djup hjärnstimulering) har redan visat sig användbar vid behandling av Parkinsons sjukdom, och har visat sig främja hippocampus neurogenes i en musmodell 19,20. En fullständig förståelse av de cellulära mekanismer som ansvarar för dcEF transduktion i cellulär motilitet kan så småningom leda till att användningen av elektrisk stimulering som en klinisk medel för att förbättra och styra migrationen endogen föregångare till ställen för skada eller diseaSE för att underlätta reparationen. De ovan beskrivna metoderna tillhandahåller en enkel och robust sätt att undersöka dessa processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (bidrag # 249669 och # 482.986) och hjärtat och Stroke Foundation of Canada (bidrag # 485.508). Författarna tackar Youssef El-Hayek och Dr Qi Wan för deras hjälp att utveckla de experimentella protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Borgens, R. B., Shi, R. Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential. Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo. Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
- Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).
- Erickson, C. A., Nuccitelli, R. Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields. J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).
- Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent. J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).
- Li, L. Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration. Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).
- Song, B. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Huang, C. -W., Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Young, T. -H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- SATO, M. Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells. Biosystems. 88, 261-272 (2007).
- Meng, X. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).
- Zhao, M. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. The FASEB Journal. , (2002).
- Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).
- McCaig, C. D. Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential. Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).
- Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations. Nat. Med. 8, 268-273 (2002).
- Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields. PLoS ONE. 6, e23808 (2011).
- Deuschl, G. A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease. N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).
- Stone, S. S. D. Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory. J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).
