Summary
Neste protocolo demonstramos como construir câmaras personalizados que permitem a aplicação de um campo elétrico de corrente contínua para permitir lapso de tempo de imagem do cérebro adulto derivado translocação de células neurais precursor durante galvanotaxis.
Abstract
A descoberta de haste neural e células progenitoras (colectivamente denominadas células precursoras neurais) (NPCs) no cérebro de mamíferos adultos tem levado a um corpo da investigação sobre a utilização das propriedades multipotentes e proliferativa destas células para o desenvolvimento de estratégias neuroregenerative. Uma etapa essencial para o sucesso de tais estratégias é a mobilização de NPCs para um local da lesão após transplante exógena ou para aumentar a resposta dos precursores endógenos, que são encontradas na região periventricular do SNC. Assim, é essencial para compreender os mecanismos que promovem, orientar e melhorar a migração NPC. O nosso trabalho centra-se na utilização de corrente contínua de campos elétricos (dcEFs) para promover e migração NPC direta - um fenômeno conhecido como galvanotaxis. Endógenos fisiológicos campos elétricos funcionam como pistas fundamentais para a migração de células durante o desenvolvimento normal e da cicatrização. Perturbação farmacológica dotrans-neural potencial tubo em embriões axolotl provoca graves malformações do desenvolvimento 1. No contexto da cicatrização de feridas, a taxa de reparação de córnea ferida está directamente correlacionada com a magnitude do potencial epitelial que surge após a lesão, como mostrado pela melhoria farmacológica ou ruptura dessa dcEF 2-3. Nós demonstramos que o adulto NPCs subependimários sofrer rápida e dirigido migração catódica in vitro quando exposto a uma dcEF aplicado externamente. Neste protocolo, descrevemos nossas técnicas de laboratório para a criação de um ensaio galvanotaxis simples e eficaz para alta resolução, longo prazo de observação de translocação dirigido célula do corpo (migração) em um nível de uma única célula. Este ensaio seria adequado para investigar os mecanismos que regulam a transdução dcEF em motilidade celular através da utilização de ratinhos transgénicos ou knockout, curtas de ARN de interferência, ou agonistas / antagonistas de receptores específicos.
Protocol
Todos os procedimentos que envolvem manipulação de animais foram aprovados pela Universidade de Toronto Comitê Animal Care, de acordo com as diretrizes institucionais (protocolo no. 20009387). Os métodos que se seguem devem ser realizados utilizando ferramentas e técnicas estéreis, numa câmara de fluxo laminar, onde aplicável.
No texto do protocolo a seguir, a frase "EFH-SFM" refere-se a meio isento de soro suplementado com factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento de fibroblastos básico e heparina. EFH-SFM é usado quando a investigar o galvanotaxis de NPCs indiferenciadas, porque esses mitógenos manter NPCs em sua 4 estado indiferenciado. Ao investigar a galvanotaxis de NPCs induzidas a diferenciar-se em tipos de células maduras, "FBS-SFM" refere-se a meio isento de soro suplementado com 1% de soro fetal bovino. FBS promove a diferenciação de maduras NPCs em fenótipos neurais 5.
1. Isolamento e Cultura de precursores neurais (Nãomostrado em video)
- Anestesiar um rato CD1 (6-8 semanas de idade) com isofluorano e sacrifício através de deslocamento cervical.
- Extinguir a cabeça em etanol a 70% e decapitar o animal com tesouras de dissecação afiadas.
- Enquanto mantém a cabeça com pinça cirúrgica, remover a pele na superfície dorsal para expor o crânio.
- Usando um bisturi e não. Lâmina 11, marcar o crânio no seio frontal ao longo do eixo mediolateral, e também ao longo da sutura sagital na direcção rostrocaudal.
- Descasque os ossos parietais de distância da cabeça com nenhum. 7 pinças curvas, tendo cuidado para não furar o tecido cerebral.
- Insira uma espátula fina embaixo do cérebro a partir de debaixo do cerebelo e avançando para os bulbos olfatórios. Enquanto segurando o crânio no lugar com uma pinça, puxe o cérebro do crânio e imediatamente colocá-lo na gelada líquido cefalorraquidiano artificial (veja receitas abaixo).
- Sob um microscópio de dissecação, utilizando estériltesouras e pinças de dissecção cortar o cérebro de meia ao longo da linha média. Rodar cada hemisfério, de modo que a superfície (cut) medial virado para cima.
- Selecione um hemisfério, e com a superfície medial voltada para cima, localize o esplênio do corpo caloso (região posterior do corpo caloso).
- Fazer uma incisão da superfície do córtex do esplênio do corpo caloso ao longo do eixo dorsoventral.
- Descasque o córtex incisão em direção ao bulbo olfativo para expor as paredes medial e lateral do ventrículo lateral.
- Girar o hemisfério, de modo que a superfície dorsal virada para cima, e usar microtesoura curvadas para cortar e recolher as paredes expostas medial e lateral, que contêm a região periventricular onde residem NPCs 6.
- Repita os passos 1,8-1,11 para o outro hemisfério.
- Pipetar a tecido isolado em 7 ml de solução de tripsina (ver receita abaixo) num tubo de 15 cc, e colocar o tubo sobre um balancim de 37 ° Cincubadora durante 25 min.
- Centrifuga-se o tubo a 1500 rpm durante 5 min, o sobrenadante aspirado, e ressuspender o tecido em 2 ml de solução de inibidor de tripsina (ver receita abaixo).
- Tritura-se o tecido suavemente com um pequeno furo de pipetas de Pasteur 30-50 vezes com cuidado para evitar bolhas de ar.
- Centrifuga-se o tubo a 1500 rpm durante 5 min, o sobrenadante aspirado, e ressuspender em 1-2 ml de SFM (ver receita abaixo) por trituração do pellet 3-5 vezes.
- Centrifuga-se o tubo a 1500 rpm durante 3 minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de SFM + EFH.
- Conte viver a densidade celular com um hemocitómetro e as células da placa num frasco de cultura T25, a uma densidade de 10 células por uL de SFM + EFH.
- Permitir que a cultura a crescer durante 7 dias não perturbadas para render flutuantes neuroesferas primárias compostas por NPCs.
2. Galvanotaxis Preparação Câmara
- Coloque 3 de vidro quadrado não. 1 lamelas (22 x 22 x 0,17) ind garrafa de 6N de ácido clorídrico durante a noite.
- No dia seguinte, utilizar uma ponta de diamante, cortador de vidro para cortar seis tiras rectangulares (22 x 5 x 0,17 mm) de vidro a partir de qualquer quadrado. 1 lamínulas.
- Transfira os deslizamentos lavado com ácido quadrados e retangulares deslizamentos em uma capela de fluxo laminar. Lave as tiras rectangulares e quadradas, primeiro com etanol 70%, em seguida com água de cultura de tecidos de grau autoclavado, e deixa-se secar numa Kim Wipe (para esterilidade adicionado, o vidro pode ser permitido para o ar seco).
- Aplique graxa de vácuo para o perímetro de uma superfície das lâminas de vidro quadrados, e vedá-las à base de 60 mm pratos de Petri de plástico.
- Aplique graxa de vácuo ao longo do eixo longo de uma superfície das tiras de vidro rectangulares e selá-los às arestas opostas das lâminas de vidro quadrados (de tal forma que elas fiquem paralelas umas às outras), a fim de criar uma calha central.
- UV-esterilizar as câmaras durante pelo menos 15 min no fluxo laminar.
- Pipetar 250-300 ul de poli-L-Lysine para a calha central das câmaras e incubar à temperatura ambiente durante 2 horas.
- Aproximadamente 15 minutos antes do final do período de incubação, a preparação da solução de Matrigel (ver receita abaixo).
- Aspirar o poli-L-lisina, lave as calhas centrais com 1 ml de água esterilizada, e uL de solução da pipeta 250-300 Matrigel para as calhas centrais.
- Incubar as câmaras, a 37 ° C durante 1 h.
- Aspirar a solução Matrigel e lavar cuidadosamente as calhas centrais com 1-2 ml de SFM.
- Pipetar 100 mL de EFH-SFM ou FBS-SFM para as calhas centrais e transferir as câmaras galvanotaxis para o palco de um microscópio de contagem.
- Pipetar 3-4 ml da cultura neuroesfera contendo em uma placa de Petri de 60 mm e transferir a placa de Petri, para o estágio de microscópio de contagem.
- Se a um objectivo de visualização de 5x, utilizar uma pipeta para transferir P10 5-8 neuroesferas inteiras (até quatro de cada vez) na calha central de cada galvanotaxiscâmara sem dissociar-los, e cuidadosamente espalhado as neuroesferas redor da calha central, sem perturbar o substrato Matrigel.
- Adicionar um adicional de 150-200 ul EFH-SFM ou FBS-SFM para as calhas centrais.
- Transferir as câmaras galvanotaxis em um de 37 ° C, 5% CO 2, 100% incubadora humidificada durante 17-20 h (se analisar NPCs indiferenciadas) para permitir que as neuroesferas a aderir ao substrato de Matrigel e dissociam-se em células individuais, como mostrado na Figura 1 . Se a análise de NPCs diferenciados, o período de incubação deve ser alargado para 69-72 horas para permitir a diferenciação das células.
3. Viver imagens de células Time-Lapse
- Permitir que o sistema de imagens ao vivo de células para equilibrar a 37 ° C, 5% CO 2 durante um período mínimo de 30 min antes do início da gravação de lapso de tempo.
- Corte dois pedaços de 12 cm de 1 mm de diâmetro prata fio da bobina, eles de um lado, e colocá-los em Clorox blixiviação durante 20 minutos de modo a formar de Ag / AgCl.
- Transferir as câmaras galvanotaxis para a plataforma de um microscópio de contagem e seleccionar que câmara irá ser utilizada para a análise de células live-migração de imagem com base nos seguintes critérios: i) as neuroesferas deve ser quase completamente dissociado em células individuais e, ii) as células devem possuir morfologias redondas com pouco ou nenhum processo que se estende dos corpos celulares.
- Transferir a câmara galvanotaxis seleccionado numa câmara de fluxo laminar, em conjunto com um qualquer quadrado separado. Uma lamínula de vidro e graxa de vácuo.
- Lava-se a tampa desliza em primeiro lugar com 70% de etanol, em seguida, em água esterilizada, e aplicar uma tira de massa lubrificante de vácuo sobre dois bordos paralelos da lâmina de cobertura.
- Aspirar o meio de cultura a partir da calha central da câmara, em seguida, rapidamente colocar a lâmina de cobertura (graxa lado voltado para baixo) para a câmara de tal modo que a gordura restante nas duas tiras paralelas tiras de vidro rectangulares, criando efectivamente um telhadopara a câmara.
- Pipetar 100 mL de fresco EFH-SFM ou FBS-SFM na calha central através de ação capilar.
- Use graxa de vácuo para criar bordas de piscinas de meios de cultura em cada extremidade da calha central, como mostrado na Figura 2.
- Cortar duas peças 15 cm de tubo de PVC, e com uma seringa de 10 cc com uma agulha de calibre 18 para injectar a solução de agarose cuidadosamente no tubo, garantindo não formar bolhas no interior dos tubos, e permitir que o gel solidificar durante 5 min.
- Transferir a câmara galvanotaxis ao sistema vivo de células de imagem, juntamente com o gel de agarose a tubos, Ag / AgCl, e um par de vazios 60 pratos de Petri milímetros que serão utilizados como meios de cultura reservatórios e irá conter o Ag / AgCl. Permitir que a câmara galvanotaxis para descansar dentro do 37 ° C, 5% CO 2 ambiente durante 20-30 min.
- Durante este tempo, preparar as tampas dos dois pratos de Petri vazias e da tampa da caixa de Petri a câmara de galvanotaxis por furos de perfuraçãoneles com uma ferramenta Dremel ou semelhante, como mostrado na Figura 3.
- Pipetar 1-1,5 ml de EFH-SFM ou FBS-SFM para um ou outro lado da calha central, e 7-8 ml de SFM em cada placa de Petri vazia. Coloque uma placa de Petri em cada lado da calha central da câmara e galvanotaxis lugar um eléctrodo de Ag / AgCl em cada prato. Ponte o espaço entre a câmara de galvanotaxis e as placas de Petri para estabelecer a continuidade eléctrica com as pontes de gel de agarose, como se mostra na Figura 4.
- Conectar os eletrodos de Ag / AgCl a uma fonte de alimentação externa, com um amperímetro em série para medir a corrente elétrica e ligue a fonte de alimentação. Use um voltímetro para medir a força do campo eléctrico em frente da calha central, e ajustar a saída da fonte de alimentação até que a intensidade do campo eléctrico desejado é alcançado (os ensaios realizados neste laboratório utilizam uma força dcEF de 250 mV / mm com corrente eléctrica entre 1 e 1,5 mA).
- Iniciativate módulo do lapso de tempo no sistema de célula de imagem ao vivo, e permitir que o experimento de correr para a quantidade de tempo desejada. Após a conclusão do ensaio, as células de fixação em paraformaldeído a 4%, para análise de imunomarcação padrão.
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Representative Results
A análise cinemática revela que, na presença de um 250 dcEF mV / mm, NPCs indiferenciadas exibem galvanotaxis altamente dirigidos e rápida para o cátodo (Figura 5A, Movie 1). Na ausência de um dcEF, o movimento aleatório das células é observada (Figura 5B, Movie 2). Neste intensidade de campo,> 98% de NPCs indiferenciadas migrar para o 6-8 hr inteiro para o qual são gravadas, e uma vez que as células mortas não migram isto sugere que eles permaneçam viáveis durante este período, na ausência ou presença de um dcEF.
Fenótipos diferenciados sofrer migração insignificante tanto na presença como na ausência de um dcEF (Filmes 3, 4). Subconjuntos de células diferenciadas estender os processos que tendem a alinhar perpendicular à direcção do dcEF, mas não translocação corpo notável de células é observada.
Imunomarcação verifica que NPCs manter expressio positivon da nestina neural precursor marcador após 6 horas de exposição dcEF (Figura 6A). Nos ensaios envolvendo NPCs induzidas para se diferenciarem em fenótipos maduros, a maioria das células expressam o marcador de astrócitos maduros proteína acídica fibrilar glial (GFAP), após 6 horas de exposição dcEF (Figura 6B).
Os anticorpos primários utilizados nestas análises foram como se segue: anticorpo monoclonal de ratinho anti-nestina (1:400, Millipore, Canada), e anticorpo policlonal de coelho anti-GFAP (1:500, Sigma, Canadá). Os anticorpos secundários utilizados nestas análises são os seguintes:-cabra anti-rato conjugada com Alexafluor 568 (1:400, Invitrogen, Gibco, Canada), e de cabra anti-coelho conjugado com Alexafluor 488 (1:400, Invitrogen, Gibco , Canadá).
Figura 1. Neuroesferas aderem ao substrato Matrigel e dissocicomeu em células isoladas após 17 h de incubação a 37 ° C / 5% de CO2, 100% de humidade EFH-SFM.
Figura 2. Ilustração da câmara de galvanotaxis. Tiras de massa lubrificante de vácuo são utilizadas para criar um conjunto de meios de cultura de cada lado da calha central.
Figura 3. Esquemático de furos que deverão ser perfurados nas tampas a câmara galvanotaxis e os reservatórios de meio de cultura. Os furos 7 mm de diâmetro em ambas as tampas são usadas para inserir os tubos com gel de agarose. Os quatro furos mm de diâmetro na tampa da câmara de galvanotaxis é usado para medir o potencial eléctrico em frente da calha central usando um voltímetro. A 4 mm de diâmetro no furo da tampa do re meio de culturaservoir é permitir que o eléctrodo de Ag / AgCl a projectar-se a partir da tampa do prato de ligação à fonte de alimentação.
Figura 4. Ilustração de galvanotaxis montagem de câmara de lapso de tempo de imagem. A câmara de galvanotaxis é a placa de Petri central, no qual as células são plaqueadas. Os meios de comunicação no interior da carcaça central placa de Petri da câmara galvanotaxis é ou SFM + EFH ou SFM + 1% FBS. As placas de Petri sobre um ou outro lado da câmara de galvanotaxis são preenchidos com SFM, e também contém os eléctrodos de Ag / AgCl. Estes eléctrodos são ligados a uma fonte de alimentação externa, e colmatar as três placas de Petri com agarose-gel pontes forma um circuito completo.
Figura 5. No presence de uma NPCs dcEF indiferenciadas sofrer migração galvanotactic rápida para o cátodo (A), enquanto que, na ausência de um dcEF as células sofrem migração radial aleatório (B).
Figura 6 A imunocoloração. Verifica se NPCs permanecer nestina-positivas indiferenciadas precursores após 6 horas de exposição dcEF (A), e que as NPCs induzidas a diferenciar principalmente expressar a GFAP marcador de astrócitos maduros, após 6 horas de exposição dcEF (B).
Filme 1. Time-lapse video de NPCs indiferenciadas expostos a um dcEF. NPCs plaqueadas em câmaras galvanotaxis durante 17 horas em SFM + EFH e em seguida exposto a uma exposição de 250 a migração mV / mm dcEF rápida e dirigida para o cátodo. 1 segundo de video = 15 minutos tempo real. Clique aqui para ver movie.
Filme 2. Time-lapse video de NPCs indiferenciadas, na ausência de um dcEF. NPCs plaqueadas em galvanotaxis câmaras durante 17 horas em SFM + EFH e depois trabalhada na ausência de um dcEF aplicada sofrer migração aleatória. 1 segundo de video = 15 minutos tempo real. Clique aqui para ver filme .
Filme 3. Time-lapse video de NPCs diferenciados expostos a um dcEF. NPCs plaqueadas em câmaras galvanotaxis por 69-72 h, em SFM + FBS, e em seguida exposto a uma exposição de 250 a migração mV / mm dcEF muito pouco em qualquer direcção. 1 segundo de video = 15 minutos tempo real. Clique aqui para ver filme .
Filme 4. Time-lapse video de NPCs diferenciados na ausência de um dcEF. NPCs cultivados em galvanotaxis chambers para 69-72 hr em SFM + FBS, e depois fotografados na ausência de um dcEF aplicada exibem pouca migração em qualquer direcção, semelhante ao NPCs diferenciados que são expostos a um dcEF. 1 segundo de video = 15 minutos tempo real. Clique aqui para ver filme .
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Discussion
Este protocolo foi adaptado a partir de métodos bem estabelecidos de estudos anteriores 7-9. Galvanotactic câmaras podem ser construídas utilizando uma variedade de técnicas diferentes, incluindo a construção de um poço de vidro separada para confinamento de sementeira de células, ou utilizando a ablação por laser de CO 2 para a microfabricação da calha central, 10,11. Algumas técnicas podem ser mais laboriosa ou dispendiosa do que outros. Nós descrevemos um ensaio simples e de baixo custo para a construção de uma câmara de NPC galvanotaxis utilizando materiais normalmente encontrados na maioria dos laboratórios de biologia celular. Nosso protocolo inclui uma aquecida, humidificado, CO 2 regulamentado incubadora que rodeia o sistema de imagens ao vivo de células para manter as células em condições óptimas para a imagiologia contínua a longo prazo. A ausência de um tal aparelho é uma limitação de algumas técnicas publicadas anteriormente 9,12.
Um trabalho recente de outro grupo demonstrou galva semelhantenotactic comportamento de células de uma linha de células do hipocampo 13, utilizando um protocolo diferente e um mais trabalhosa desenho da câmara galvanotaxis. O nosso ensaio é particularmente elegante, uma vez que permite a análise da população de células idênticas a partir - de culturas de células primárias de NPCs neuroesfera indiferenciadas derivados - que tenham sido expostos a condições distintas desse modo permitindo uma comparação das propriedades migratórias de ambas as células diferenciadas e indiferenciadas, simplesmente modificando os fatores usados para complementar os meios de cultura dentro da câmara galvanotaxis.
O ensaio apresentado neste protocolo é uma ferramenta poderosa para rastreios de longa duração e de análise de galvanotaxis NPC, e possivelmente de outros tipos de células que sofrem migração galvanotactic 14,15. Como acontece com qualquer protocolo, nuances na preparação e execução de determinadas etapas neste protocolo pode levar a resultados sem sucesso. As seguintes diretrizes e sugestões, como deveriaSist na execução bem sucedida deste protocolo:
- Para evitar que as células de sofrer morte térmica a corrente eléctrica associada, as dimensões da câmara de galvanotaxis foram calculados para minimizar os efeitos do aquecimento por efeito Joule 16. O calor gerado na câmara é proporcional ao quadrado da corrente que flui através dele, a qual por sua vez é proporcional à área da secção transversal da câmara de galvanotaxis. Aconselhamos a manutenção da área de secção transversal da câmara de 2,04 milímetros 2 (12 mm x 0,17 mm).
- Após 7 dias de cultura neuroesferas podem ser recolhidos, dissociado em células individuais e novamente plaqueadas em factor de crescimento-condições (um processo designado por "passaging ') para produzir neuroesferas secundárias. Obtemos nossas melhores resultados usando neuroesferas que tenham sido submetidos a menos de três passagens (máximo de 21 dias em cultura), com uma diminuição visível na capacidade migratória quando se utiliza neuroesferas que foram passadas uma maior number vezes. Isto é consistente com o nosso trabalho anterior demonstrando que as culturas de longo prazo alterar a cinética de células 17.
- Quando se selecciona uma câmara contendo galvanotaxis NPCs para observação, é importante seleccionar uma câmara em que as células derivadas neuroesfera ter dissociado bem, a fim de permitir análises exactas cinemáticas. Se não têm as neuroesferas dissociadas bem (NPCs são aderidas umas às outras e não podem ser delineados), a análise do comportamento migratório das células individuais será quase impossível. As culturas devem ser permitidas mais tempo para se dissociar antes da observação. Além disso, as células que estão em estreita proximidade uns com os outros pode obstruir fisicamente a migração de células vizinhas. As nossas análises demonstraram que as células posicionadas pelo menos um corpo celular fora da sua célula vizinha mais próxima migrar a velocidades significativamente maiores do que as células que são agrupados juntos, perto do centro da neuroesfera dissociado, embora com extrema iguaisctedness.
- Se houver uma grande quantidade de processos que se estendem a partir dos NPCs, este é um indicador de que as células tenham começado a diferenciar-se e, portanto, eles não são uma representação verdadeira de uma população indiferenciada. A vantagem de preparar as câmaras galvanotaxis em triplicado é que as restantes duas câmaras que não são seleccionados para lapso de tempo de imagem pode ser corrigido imediatamente após o período de chapeamento incubadas (Passo 2,16), e imunocoradas para verificar o perfil da diferenciação das células.
- Para melhores resultados os meios de cultura devem ser preparados na hora e complementada, em cada dia que for necessário.
- As imagens de lapso de tempo e subsequentes análises cinemáticos são altamente sensíveis a perturbação da amostra. O microscópio de imagem ao vivo das células deve ser colocado sobre uma mesa de ar para reduzir as vibrações, e o sistema não deve ser perturbado durante a experimentação.
Nosso laboratório rotineiramente imagens NPC galvanoteixo para 6-8 h, embora até 15 h análises foram realizadas. Ao longo dos períodos de 15 h, o outro lado da câmara dcEF diminuiu de 250 mV / mm a 227 mV / mm (9,2% de redução). Períodos mais longos de imagem inevitavelmente modificar o pH dos meios de comunicação na câmara, ainda modificar o campo elétrico. Assim, recomenda-se a substituição dos meios de comunicação, aproximadamente a cada 6 h. No entanto, temos realizado 8 horas de ensaios NPC galvanotaxis sem substituição de mídia e não observaram qualquer morte celular perceptível (células mortas não migram) ou declínio na motilidade celular, as células mantêm sua velocidade de migração ao longo da experiência. O investigador pode também reduzir a profundidade da câmara para aumentar a estabilidade do dcEF 10.
Após imagens, de uma única célula de análise cinemática de rastreamento é realizada em um subconjunto de células fotografada usando módulo de rastreamento Zeiss Axiovision software. As células são seleccionadas para análise, se eles são localizados mais perto da borda deo neuroesfera dissociado e pelo menos um corpo celular para além da sua mais próxima célula. A lógica por trás disso é a minimizar a probabilidade de células se sobrepõem durante o rastreamento, o que faria de rastreamento de células individuais quase impossível. Analisamos os seguintes quatro parâmetros de migração:
- X-eixo de deslocamento - a distância de uma célula migra na direcção do eixo, que é paralelo à direcção do dcEF.
- Velocidade - a distância em linha reta entre as posições inicial e final de células dividido pelo tempo decorrido.
- Direcionamento - eixo x deslocamento dividido pela distância em linha recta entre as suas posições inicial e final de células.
- Tortuosidade - a distância total do caminho percorrido pelo celular dividido pela distância em linha reta entre as posições de células iniciais e finais.
Os dois últimos parâmetros são indicadores de como o caminho direto a migração é, em uma determinada direção.
18. Um meio adequado de substrato e da cultura teria de ser seleccionado para outros tipos de células, bem como a duração de propagação de células antes da imagem deve ser ajustado conforme necessário. Notavelmente, as dimensões da câmara pode necessitar de ser modificada dependendo da espessura do tecido a ser examinado (por exemplo, se uma fatia de tecido é colocado na câmara). O investigador deve ter em mente that para um campo eléctrico conjunto, o fluxo de corrente através da câmara é directamente proporcional à área de secção transversal da câmara e, portanto, ampliações significativas para as dimensões da câmara, podem resultar num aumento da morte celular Joule-aquecimento correspondente.
As técnicas descritas neste relatório fornecem uma ferramenta poderosa para investigar o importante, mas não muito estudada, fenômeno de galvanotaxis. A capacidade das células para responder à dcEFs tem implicações terapêuticas directas. A estimulação eléctrica (estimulação cerebral profunda) já provaram ser úteis no tratamento da doença de Parkinson, e tem sido mostrado para promover neurogênese em um modelo de rato 19,20. Uma compreensão completa dos mecanismos celulares responsáveis pela transdução em dcEF motilidade celular pode eventualmente conduzir à utilização de estimulação eléctrica como meio para aumentar a clínica e dirigir a migração precursor endógeno para os locais de lesão ou doense a facilitar o processo de reparação. Os métodos acima descritos fornecem uma maneira simples e robusta de investigar estes processos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é financiado pelas Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (Grant # 249669 e # 482986) e Coração and Stroke Foundation of Canada (Grant # 485508). Os autores agradecem Youssef El-Hayek e Dr. Qi Wan por sua assistência no desenvolvimento dos protocolos experimentais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
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References
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