ツールと化学が順次電気を必要とせずにサンプルからのタンパク質に続いて核酸を分離するために記述されています。このツールは、分離化学を固相抽出の原則に基づいている間に転送ピペット内に保持されて吸着剤から構成されています。隔離された高分子は、免疫系とPCRベースのアッセイにより分析することができます。
従来のような腸管出血性大腸菌 (EHEC)などの新興病原体、 ペスト菌、またはプリオンベースの疾患は、政府、産業、世界的な医療専門家のための重要な関心事である。たとえば、 赤痢菌と組み合わせるEHECsは、約325,000子供毎年の死に責任があると、米国で一般的な実験室ベースの識別が、1は使用できません発展途上国で特に普及している。低コストの開発と配布は、病原体や疾病マーカーの迅速な同定および/または診断のため、フィールドベースの、ポイントオブケアツールが劇的に病気の進行と患者の予後を変える可能性があります。我々は電気や関連する実験装置2せずに固相抽出(SPE)によってサンプルから核酸とタンパク質を分離するためのツールを開発しました。隔離された高分子はdiagnoに使用することができます前方にラボまたはフィールドベースのポイント·オブ·ケア·プラットフォームを使用して、いずれかのSIS。重要なのは、このメソッドは、ゲノムおよびプロテオーム解析の確証を通じて信頼を提供し、核酸および非分割試料からの蛋白質データの直接比較を提供します。
私たちのアイソレーションツールは、固相核酸の分離のための業界標準、シリカベースの粒子やフィルタ3への結合を介して、通常、カオトロピック塩溶液、グアニジンイソチオシアネートから核酸を分離するBOOM技術を利用しています。 CUBRC独自の固相抽出の化学は、核酸の分離4次の廃棄物やフロースルーから、このケースでは、カオトロピック塩溶液からタンパク質を精製するために使用されています。
包装することにより、小型で安価でシンプルなプラットフォームに化学反応を十分に特徴付けられ、我々は、varの下に行うことができ、核酸とタンパク質抽出のためのポータブルシステムを生成した条件のiety。単離された核酸は安定であり、タンパク質含有量がすぐに開かれた手や他の免疫ベースのアッセイで分析することができますが電源がPCR増幅のために使用可能な位置に移送することができます。フィールド内の疾患マーカーの迅速な同定が大幅に疾患の進行の早い段階で治療の適切なコースを向けることによって、患者の転帰を変更することができます。説明するツールと方法が実質的にすべての感染性病原体での使用に適していると同時に、それらの物流負担を軽減しながら、ユーザーに複数の高分子型解析の冗長性を提供します。
このレポートに記載され、ツール、化学およびプロトコルは、フィールドベースの、ポイントオブケアのアプリケーションで利用することができる電気フリー、マルチ高分子抽出システムの最初の知られている例を表しています。両方の高分子型は、下流の診断や分析デバイスの数に適用することができます。サンプルのタンパク質成分は、( 図4)免疫反応性でありながら、例えば、単離された核酸は、PCRの品質( 図2および3)である。世界の緊縮やリソースの限られた地域では、この抽出システムの利用率が大幅にそこに住んでいる集団に疾患の負担を減らすことができます。この抽出システムは、禁欲的な、または遠隔地でのサンプル処理のための堅牢でありながら、迅速かつ費用対効果の高い方法を提供することによって、世界中の疾病のサーベイランスプログラムに役立つ可能性があります。
上記の抽出方法の1つの重要な側面は、ということですそれはユーザによって変更することができます。たとえば、サンプルのサイズは最初の500μLs(ステップ1.2)より大きいか小さい場合には、ユーザーがそれに応じて試薬の量を調整することができます。絶対的なボリュームを変更することができますが、つまり、サンプルサイズに試薬の体積比は一定のままにしてください。また、吸着剤上の通路の数の調整は、ユーザーの裁量で行うことができます。大規模なサンプル量が使用されている場合たとえば、記載されているよりも吸着剤回以上(ステップ2.4&3.3)上のサンプルを渡すと、吸着剤に接触する高分子型(核酸またはタンパク質)の可能性を増加します。吸着飽和に達するまでの通路の増加は、捕獲効率を高める必要があります。
我々は、抽出ツールとそれに関連する化学物質は、タンパク質の抽出化学が高度にグリコシル化の回復のために非効率であることである最も重要なそのうちのいくつかの制限を持っていることを発見したタンパク質。下流の診断は、グリコシル化タンパク質を対象としているイベントでは、このシステムは、識別のための理想的ではありません。さらに、核酸またはタンパク質のいずれかの抽出効率の上限と下限はまだ決定され、最適化は回復効率を最大化するために進行中です。ツールの更なる発展は、これらの現在の知識のギャップを克服します。
The authors have nothing to disclose.
抽出ピペットの開発のための資金は、DRPに授与され、社内の研究開発の助成金によって部分的に提供されていました。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Guanidine Thiocyanate | Teknova | G4000 |
ethanol | Pharmco-Aaper | 11ACS200 |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L |
BSA | Sigma | A-4503 |