Et verktøy og kjemi er beskrevet til sekvensielt isolere nukleinsyrer etterfulgt av proteiner fra en prøve uten behov for elektrisitet. Verktøyet består av en sorbent avholdes innen en overføringspipetten mens isolasjon kjemi er basert på solid-fase uttak prinsipper. De isolerte makromolekyler kan analyseres ved immuno-baserte og PCR-baserte analyser.
Tradisjonelle og nye patogener som Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis eller prion-baserte sykdommer er av stor betydning for regjeringer, industrier og medisinske fagfolk verden over. For eksempel, EHECs, kombinert med Shigella, er ansvarlig for drapene på ca 325 000 barn hvert år, og er særlig utbredt i den tredje verden hvor laboratorie-basert identifisering, vanlig i USA, er utilgjengelig en. Utvikling og distribusjon av lave kostnader, kan felt-basert, point-of-care verktøy for å hjelpe til med rask identifisering og / eller diagnose av patogener eller sykdomsmarkører dramatisk endre sykdomsutvikling og pasient prognose. Vi har utviklet et verktøy for å isolere nukleinsyrer og proteiner fra en prøve av solid-fase ekstraksjon (SPE) uten strøm eller tilknyttet laboratorieutstyr to. De isolerte makromolekyler kan brukes til diagnosesis enten i en fremskutt lab eller bruke feltbaserte point-of-care plattformer. Viktigere, gir denne metoden for direkte sammenligning av nukleinsyre-og protein data fra en un-split prøven, og tilbyr en tillit gjennom bekreftelser av genomisk og proteomikk analyser.
Vår isolasjon verktøy benytter bransjestandard for fast-fase nukleinsyre isolasjon, bommen teknologien, som isolerer nukleinsyrer fra en chaotropic salt løsning, vanligvis Guanidine isothiocyanate, gjennom binding til silika-baserte partikler eller filtre 3. CUBRC proprietære fast-fase ekstraksjon kjemi brukes til å rense protein fra chaotropic saltløsninger, i dette tilfellet fra avfall eller flyt-thru etter nukleinsyre isolasjon 4.
Ved emballasje godt karakterisert kjemi i en liten, billig og enkel plattform, har vi generert et bærbart system for nukleinsyre og protein utvinning som kan utføres under en variety forhold. De isolerte nukleinsyrer er stabile og kan transporteres til en posisjon der strøm er tilgjengelig for PCR amplifikasjon mens proteininnholdet kan umiddelbart bli analysert av håndholdt eller andre immunologiske-baserte analyser. Den raske identifisering av sykdomsmarkører i feltet kunne signifikant påvirker pasientens utfallet ved å dirigere riktig løpet av behandling på et tidligere stadium av sykdommen progresjon. Verktøyet og metoden beskrevet er egnet for bruk med alle typer smittestoff og tilbyr brukeren redundans av multi-macromolecule typen analyser samtidig redusere sitt logistiske byrde.
Verktøyet, kjemi og protokoll beskrevet i denne rapporten representerer den første kjente eksempel på en strøm-fritt, multi-macromolecule utvinning system som kan utnyttes i felt-basert, point-of-care applikasjoner. Begge macromolecule typene kan brukes til en rekke nedstrøms diagnostiske eller analytisk enheter. For eksempel, de isolerte nukleinsyrer er av PCR kvalitet (figur 2 og 3) mens protein komponent i prøven er immunoreactive (figur 4). Utnyttelsen av dette utvinning systemet i streng eller ressurs begrensede områder av verden kunne drastisk redusere sykdomsbyrden i befolkningen som bor der. Dette utvinning system kan også hjelpe i sykdomsovervåking programmer over hele verden ved å tilby en robust, men rask og kostnadseffektiv metode for prøvebehandling i streng eller avsidesliggende steder.
Et viktig aspekt til utvinning metoden skissert ovenfor, er atden kan endres av brukeren. For eksempel i tilfeller der utvalg er større eller mindre enn de første 500 μLs (trinn 1,2), kan brukeren justere volumet på reagensene tilsvarende. Det vil si at den volumetriske forholdet mellom reagensene til størrelsen på utvalget bør forbli konstant, mens de absolutte volumene kan endres. Dessuten kan justeringer i antall passeringer over sorbent også gjøres på brukerens skjønn. For eksempel, hvis en større prøvevolum brukes, passerer prøven over sorbent flere ganger enn notert (trinn 2,4 & 3.3) vil øke sannsynligheten for at macromolecule type (nukleinsyre eller protein) kontakte sorbent. Økningen i passasjer bør øke fange effektiviteten til sorbent metning er nådd.
Vi har funnet at utvinning verktøyet og tilhørende kjemi har noen begrensninger, den mest betydningsfulle av dem er at proteinet utvinning kjemi er ineffektivt for gjenvinning av svært glykosylertproteiner. I det tilfelle at nedstrøms diagnostiske mål en glykosylert protein, kan dette systemet ikke være ideelt for identifikasjon. I tillegg er øvre og nedre grense for uttak effektivitet for enten nukleinsyrer eller proteiner fortsatt bestemmes, og optimalisering er igangsatt for å maksimere utvinningen effektivitet. Videreutvikling av verktøyet vil overvinne disse dagens kunnskapshull.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering for utvikling av utvinning pipetten ble gitt delvis av en interne forskning og utvikling stipend tildelt DRP.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Guanidine Thiocyanate | Teknova | G4000 |
ethanol | Pharmco-Aaper | 11ACS200 |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L |
BSA | Sigma | A-4503 |