El-Free, Sekventiell nukleinsyra och protein isolering

Summary

Ett verktyg och kemiska beskrivs att sekventiellt isolera nukleinsyror följt av proteiner från ett prov utan behov av el. Verktyget består av en sorbent hålls inom en överföringspipett medan isolering kemiska bygger på fast fas extraktion principer. De isolerade makromolekyler kan analyseras genom immuno-baserade och PCR-baserade analyser.

Abstract

Traditionella och nya patogener som enterohemorragisk Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, eller prion-baserade sjukdomar är betydande oro för regeringar, industrier och vårdpersonal världen över. Till exempel EHECs, i kombination med Shigella, är ansvariga för dödandet av omkring 325.000 barn varje år och är särskilt vanliga i utvecklingsländer där laboratoriet-baserad identifiering, vanligt i USA, är otillgänglig ^1. Utveckling och distribution av låg kostnad, kan fält-baserade, point-of-care verktyg för att hjälpa till en snabb kartläggning och / eller diagnos av patogener eller sjukdomsmarkörer ändra dramatiskt sjukdomsutveckling och patient prognos. Vi har utvecklat ett verktyg för att isolera nukleinsyror och proteiner från ett prov genom fastfas-extraktion (SPE) utan elektricitet eller associerade laboratorieutrustning ^2. De isolerade makromolekyler kan användas för diagnossis antingen i en framåt laboratorium eller med hjälp av fält-baserade point-of-care plattformar. Viktigt är att denna metod för direkt jämförelse av nukleinsyra och data protein från en FN-split prov, som erbjuder ett förtroende genom bekräftelse av genomiska och proteomik analys.

Vår isolering verktyget utnyttjar industristandard för fast-fas-nukleinsyra isolering, BOM-teknik, som isolerar nukleinsyror från ett kaotropiskt salt-lösning, vanligtvis guanidinisotiocyanat, genom bindning till kiseldioxid-baserade partiklar eller filter ^3. CUBRC egenutvecklade fast fas extraktion kemi används för att rena protein från kaotropa saltlösningar, i detta fall, från avfall eller flödes-thru efter nukleinsyraisolering ^4.

Genom att förpackningen väl karaktäriseras kemi i en liten, billig och enkel plattform har vi genererat ett portabelt system för nukleinsyra och protein extraktion som kan utföras under en variety av betingelser. De isolerade nukleinsyrorna är stabil och kan transporteras till en position där effekt är tillgänglig för PCR-amplifiering medan den proteinhalt omedelbart kan analyseras genom handhållen eller andra immunologiska analyser. Snabb identifiering av sjukdomsmarkörer inom att kraftigt förändra patientens utfall genom att rikta rätt behandling vid ett tidigare skede av sjukdomsförloppet. Verktyget och metoden beskrivs är lämpliga för användning med i stort sett smittämnen och erbjuder användaren uppsägning av flera makromolekyl typ analyser samtidigt minska deras logistiska börda.

Protocol

1. Provet Lys

1. Proverna bör vara i flytande form. Om provet är fast, exempelvis mat eller pall, bör provet suspenderas i ett flytande medium såsom vatten eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
2. Blanda 500 | il av provet med 500 | il 6 M guanidintiocyanat (pH 6,5) i en 1,5 ml-rör.
3. Tryck glödlampan ett utdrag pipett utvisa den omgivande luften.
4. Dra hela 1 ml prov till extraktionskammaren pipett under det absorberande materialet, genom att tillåta kolven att långsamt expandera.
5. Vänd utvinning verktyget så att de absorberande kulor och prov dränering på lampan.
6. Slipa de absorberande kulorna med provet i lampan var noga med att inte utvisa provet ur extraktionen pipetten.

2. Nukleinsyraextraktion (figur 1, panel A)

1. Invertera extraktion pipetten (öppna nedåt) och driva ut provet i den ursprungliga 1,5 ml rör.
<li> Dra hela 1 ml prov i utvinning pipetten, passerar över sorbenten vid en måttlig takt, är noga med att hålla sorbent i halsen av extraktionen pipetten.
2. Driva hela provet i 1,5 ml röret genom att trycka på glödlampan.
3. Upprepa steg 2.2 och 2,3, leda provet över de absorberande ytterligare fyra gånger under totalt 5 körningar.
4. Efter den femte passerar över sorbenten, driva hela 1 ml prov till 4 ml av proteinet extraktionsbuffert (i en 15 ml koniskt rör), förslut röret och ställ åt sidan för senare användning.
5. Tvätta de isolerade nukleinsyrorna genom att passera 1 ml 95% etanol under de sorberande tre gånger, vilket återför etanol till dess ursprungliga röret vid slutlig passage.
6. Upprepa steg 2,6 med användning av en andra 1 ml, 95% etanol-tvätten.
7. Tryck och släpp lampan i 5 minuter, förbi luften hela extraktionen pipetten för att torka nukleinsyrorna / sorbentbädden. Torka kvarvarande etanol från spetsen av extraktionen pipetten usjunger en Kimwipe.
8. Återvinna nukleinsyrorna genom att passera 250 | il av 10 mM Tris (pH 6,8) över de absorberande fem gånger. Tris-bufferten kan ersättas med någon annan lämplig vattenhaltig lösning, såsom PBS. Den resulterande lösningen innehåller de extraherade nukleinsyrorna.

3. Proteinextraktion (figur 1, fält B)

1. Blanda provet och proteinextraktion buffertröret från steg 2,5 genom att vända och gå ungefär 2-3 milliliter av denna 5 ml prov över sorbenten en ny extraktion pipett.
2. Driva hela provet i samma 15 ml koniska röret är noga med att hålla sorbent i halsen av extraktionen pipetten.
3. Upprepa steg 3.1 och 3,2, att leda provet över sorberande 15 gånger.
4. Tvätta det absorberande medlet och det bundna proteinet genom att passera 1 ml 95% etanol under sorbentbädden tre gånger och matar ut etanol i det ursprungliga röret.
5. Upprepa steg 3,4 med användning av en andra 1 ml, 95% etanol-tvätten.
6. Tryck och släpp lampan i 5 minuter, förbi luften hela extraktionen pipetten för att torka protein / sorbentbädden. Torka kvarvarande etanol från spetsen av extraktionen pipetten med en Kimwipe.
7. Återvinna proteinet genom att passera 250 | il av PBS över de absorberande fem gånger. PBS-buffert kan ersättas med någon annan lämplig vattenhaltig lösning, såsom 10 mM Tris (pH 6,8). Den resulterande lösningen innehåller proteinet i provet.

Figur 1.

Figur 2.

Figur 3.

Figur 4.

innehåll ">
Figur 5.

Representative Results

Nukleinsyraisolering: Isolerade nukleinsyror är PCR amplifierbar och fria protein föroreningar.

Exempel 1: De utvunna nukleinsyror är lämpliga för användning i PCR-baserade tillämpningar. Till exempel visar figur 2 amplifiering av Shiga-toxin-gener associerade med enterohemorragisk E. coli O157: H7-stam EDL-933 (ATCC # 35.150) från en nukleinsyra / protein-extraktionsförfarande med användning av extraktion pipett. De Shiga toxin generna STX 1 och STX 2 finns på tempererat lambda-liknande bakteriofag och defekta bakteriofag i denna och andra enterohemorragisk E. coli-stammar under kontroll av P _R promotorn ^{5 6 7 8.} Aktiveringen av SOS-responsen i E. E. coli leder till profagen induktion och / eller toxinproduktion ^9. Vi har använt en modifierad version av den multiplexerade PCR-analysen av Feng et al. ¹1 för att identifiera STX 1 och STX 2 gener i både kultur och spetsade prover avlopp. Spåren A och B i figur 2 visar resultaten av en PCR-amplifiering av en obearbetad kultur prov (spår A) och en bearbetad kultur prov (spår B). Dessa resultat är i stort sett samma betydelse finns det ingen förlust av trohet i de bearbetade eller isolerade nukleinsyror. Vi amplifieras nästa preparerade avloppsvatten (bana D) eller isolerade nukleinsyror från spetsade avlopp (banorna E & F). Dessa data indikerar att de isolerade nukleinsyrorna resulterade i större förstärkning kontra icke-isolerade nukleinsyror från spetsade prover avlopp. Vi drar därför slutsatsen att antingen PCR-inhibitorer som naturligt finns i avloppsvattnet avlägsnades vid isolering eller att nukleinsyrorna koncentrerades vid isolering. En kombination av dessa två hypoteser är också möjlig.

Ultraviolett spektroskopi användes sedan för att visa att de isolerade nukleinsyrorna var relativt fri of kontaminerande protein. Figur 3 visar UV-spektra av två E. coli O157: H7 nukleinsyra extraktioner märkt isolering en och isolering b, i jämförelse med den normaliserade spektrumet av den bakteriella kulturen, märkt före isolering. Den UV-spektra av de isolerade nukleinsyrorna liknar spektra av rena nukleinsyror, som har en beräknad förhållande av absorbans mellan 260 nm och 280 nm som närmar 1,8 ^10. Dessa data visar att det finns mycket lite kontaminerande protein i nukleinsyran fraktionen utvanns med användning av tekniken beskriven.

Protein Isolering: utvunna proteinet från den nukleinsyra / protein isolerat experiment är immunreaktiv och elektroforetiskt identisk med rent protein.

Exempel 2: Var isolerade proteinfraktionen appliceras på RapidChek E. coli O157 lateral flödesanalys remsor (SDIX, Inc.). Kontroller visar en positiv identifiering i alla prov hyser E. coli O157, med eller utan STX induktion (Fig. 4, spår B och C, respektive). Data i Figur 4 visar också positiva resultat för dessa prover inhysande E. E. coli O157 som behandlats för nukleinsyror och sedan protein med hjälp av utvinning pipetten. Dessa data visar att den isolerade proteinet från varje prov är immunoreaktiv därmed utlösa ett positivt svar.

PCR-amplifiering (såsom beskrivits i exempel 1) utfördes på de proteinprover att visa att det isolerade proteinet fraktionen var fri från kontaminerande nukleinsyror. Resultaten för dessa experiment var alla negativa genom gelelektrofores. Sålunda drar vi slutsatsen att proteinet i provet separerades från kontaminerande nukleinsyror. Dessa resultat, tagna i sin helhet med de som beskrivits för isolering av nukleinsyra steg visar att de nukleinsyror och proteiner innehåll isoleras i separata fraktioneringssteg.

t "> Exempel 3:. Det isolerade proteinet är lämplig för elektrofores ¹⁰ Figur 5 visar en Coomassie-färgad 8% akrylamidgel laddad med BSA (Figur 5, spår A och C) och BSA som isolerats från 6M guanidin-isotiocyanat med användning av extraktion pipett och tillhörande protokoll. Den elektroforetiska mobiliteten hos det isolerade proteinet är identisk med den för kontrollproven. Vi drar därför slutsatsen att extraktionsprocessen inte ändrar den kovalenta strukturen hos det isolerade proteinet.

Figur 1, Panel A: Visning av en typisk nukleinsyra extraktionsförfarande Provet blandas med 6M guanidin tiocyanat i provröret och fick passera över de absorberande fem gånger.. Efter den sista passagen är provet sattes till proteinlösningen extraktionsbuffert. De sorberande och bunden nukleinsyror tvättas två gånger med etanol. Provet är då luften dRied och eluerades från sorbenten.

Figur 1, Panel B: Visning av en typisk protein extraktionsförfarande Provet blandas med proteinisolering buffert från steg 1, fig 1, panel A bringas att passera över den absorberande av en andra extraktion pipett 15 gånger.. Återstoden av förfarandet är identiskt med det av nukleinsyran extraktion protokoll.

Figur 2:. Negativ bild av en etidiumbromidfärgad agarosgel En multiplexerad shigatoxin 1 och 2 genamplifiering experiment utfördes med användning av odlingsprover (spåren A och B) eller råa prover avlopp spetsade med E. coli O157: H7 (spår D, E och F). Proverna antingen direkt till en PCR-reaktionsrör (banorna A och D) eller de prover bearbetades med användning av de isolerade behandar och de extraherade nukleinsyrorna sattes till PCR-reaktionsrör (prov B, E och F). PCR-protokollet är en modifiering av den som beskrivs av Feng et al ^11. Vår modifiering riktade endast de förstärks av STX 1 (undre bandet) och STX 2 (övre bandet) primerpar, släppa ut alla andra primerpar. Lane C är 1Kb stegen från BioRad.

Figur 3: UV-spektroskopi resultat av E. coli O157: H7 nukleinsyror isoleras med det redovisade utvinning pipetten De isolerade nukleinsyror är märkta isoleringen en och isolering miljarder.. UV-spektrumet för provet testades också före nukleinsyra extraktion och är märkt för-isolering. Spektra erhölls med användning av en Hitachi U3010 spektrofotometer och tillhörande mjukvara.

Figur 4:. Färg foto av RapidChek testremsor Proteinhalten i de prover som användes i figur 2, isolerades med användning av extraktion pipett och testades med avseende på immunoreaktivitet med lateral flödesanalys. Banorna AC är obearbetade kontroller, som var cellodling lagts på testremsan utan att nukleinsyra eller protein extraktion. Bana A är E. coli BL21 DE3-pLysS som en negativ kontroll, fälten B och C visar E. coli O157: H7 som var obehandlade (B), eller behandlades med mitomycin C i 4 timmar (C). Spår d-H visar resultaten av tillsats av extraherat protein till sidoremsoma flöde test. Spår D och E analyserades genom användning av protein-extrakt från E. coli BL21 DE3 pLysS antingen utan (D) eller med mitomycin C-behandling (E) som negativa kontroller. Fälten FH visar resultaten när extraherat protein från E. coli O157: H7 har använts. Protein extraherades från obehandlade (F), eller från 2 timmar (G) eller 4 timmar (H) mitomycin C-behandlade kulturer.Positiva resultat ger en dubbel röd linje.

Figur 5:. Fotografi av en Coomassie-färgad SDS-PAGE BSA isolerades från lösningen med användning av extraktion pipett och beskrivna protokollen. Spåren A och C är kontroll banor av 250 | ig / ml och 500 pg / ml respektive. Spår B och D avbildar utvanns BSA från lösningar innehållande samma koncentrationer som deras respektive kontroller.

Discussion

Verktyget, kemiska och protokoll beskrivs i denna rapport representerar den första kända exemplet på ett el-fri, multi-makromolekyl utvinning system som kan användas i fält-baserade, point-of-care applikationer. Båda typerna makromolekyl kan appliceras på en rad nedströms diagnostiska eller analytiska anordningar. Till exempel, de isolerade nukleinsyrorna i PCR-kvalitet (figur 2 och 3) under det att proteinkomponenten i provet är immunreaktiva (figur 4). Användningen av denna extraktion system i strama eller resurs begränsade områden av världen kan drastiskt minska sjukdomsbördan för befolkningen som bor där. Denna extraktion system kan också bidra i program för övervakning av sjukdomar i hela världen genom att tillhandahålla en robust men ändå snabbt och kostnadseffektivt sätt för prov bearbetning i strama eller avlägsna platser.

En viktig aspekt på den extraktionsmetod som beskrivs ovan är attden kan modifieras av användaren. Till exempel i fall där urvalsstorlek är större eller mindre än de ursprungliga 500 xl (steg 1,2), kan användaren justera volymen av reagensen därefter. Det vill säga, det volumetriska förhållandet hos reagensen för att provstorleken bör förbli konstant medan de absoluta volymer kan ändras. Dessutom kan justeringar i antalet passager över sorbenten också göras på användarens diskretion. Till exempel, om en större provvolym används, att leda provet över de absorberande fler gånger än anges (steg 2.4 & 3,3) kommer att öka sannolikheten av makromolekylen typ (nukleinsyra eller protein) i kontakt med absorptionsmedlet. Ökningen passager bör öka Infångningseffektivitet tills sorbent mättnad uppnås.

Vi har funnit att utvinningen verktyget och tillhörande kemiska har några begränsningar, den viktigaste av dessa är att proteinextraktion kemin är ineffektivt för återvinning av mycket glykosyleratproteiner. I händelse av att den nedströms belägna diagnostiska mål ett glykosylerat protein, kan detta system inte vara idealisk för identifiering. Dessutom är de övre och undre gräns för utvinning effektivitetsvinster för antingen nukleinsyror eller proteiner fortfarande bestäms och optimering pågår för att maximera återhämtning effektivitetsvinster. Vidareutveckling av verktyget kommer att övervinna de nuvarande kunskapsluckor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guanidine Thiocyanate	TEKnova, Inc.	G4000
ethanol	Pharmco-AAPER	11ACS200
2-propanol	Sigma-Aldrich	109827-1L
BSA	Sigma-Aldrich	A-4503