Ett verktyg och kemiska beskrivs att sekventiellt isolera nukleinsyror följt av proteiner från ett prov utan behov av el. Verktyget består av en sorbent hålls inom en överföringspipett medan isolering kemiska bygger på fast fas extraktion principer. De isolerade makromolekyler kan analyseras genom immuno-baserade och PCR-baserade analyser.
Traditionella och nya patogener som enterohemorragisk Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, eller prion-baserade sjukdomar är betydande oro för regeringar, industrier och vårdpersonal världen över. Till exempel EHECs, i kombination med Shigella, är ansvariga för dödandet av omkring 325.000 barn varje år och är särskilt vanliga i utvecklingsländer där laboratoriet-baserad identifiering, vanligt i USA, är otillgänglig 1. Utveckling och distribution av låg kostnad, kan fält-baserade, point-of-care verktyg för att hjälpa till en snabb kartläggning och / eller diagnos av patogener eller sjukdomsmarkörer ändra dramatiskt sjukdomsutveckling och patient prognos. Vi har utvecklat ett verktyg för att isolera nukleinsyror och proteiner från ett prov genom fastfas-extraktion (SPE) utan elektricitet eller associerade laboratorieutrustning 2. De isolerade makromolekyler kan användas för diagnossis antingen i en framåt laboratorium eller med hjälp av fält-baserade point-of-care plattformar. Viktigt är att denna metod för direkt jämförelse av nukleinsyra och data protein från en FN-split prov, som erbjuder ett förtroende genom bekräftelse av genomiska och proteomik analys.
Vår isolering verktyget utnyttjar industristandard för fast-fas-nukleinsyra isolering, BOM-teknik, som isolerar nukleinsyror från ett kaotropiskt salt-lösning, vanligtvis guanidinisotiocyanat, genom bindning till kiseldioxid-baserade partiklar eller filter 3. CUBRC egenutvecklade fast fas extraktion kemi används för att rena protein från kaotropa saltlösningar, i detta fall, från avfall eller flödes-thru efter nukleinsyraisolering 4.
Genom att förpackningen väl karaktäriseras kemi i en liten, billig och enkel plattform har vi genererat ett portabelt system för nukleinsyra och protein extraktion som kan utföras under en variety av betingelser. De isolerade nukleinsyrorna är stabil och kan transporteras till en position där effekt är tillgänglig för PCR-amplifiering medan den proteinhalt omedelbart kan analyseras genom handhållen eller andra immunologiska analyser. Snabb identifiering av sjukdomsmarkörer inom att kraftigt förändra patientens utfall genom att rikta rätt behandling vid ett tidigare skede av sjukdomsförloppet. Verktyget och metoden beskrivs är lämpliga för användning med i stort sett smittämnen och erbjuder användaren uppsägning av flera makromolekyl typ analyser samtidigt minska deras logistiska börda.
Verktyget, kemiska och protokoll beskrivs i denna rapport representerar den första kända exemplet på ett el-fri, multi-makromolekyl utvinning system som kan användas i fält-baserade, point-of-care applikationer. Båda typerna makromolekyl kan appliceras på en rad nedströms diagnostiska eller analytiska anordningar. Till exempel, de isolerade nukleinsyrorna i PCR-kvalitet (figur 2 och 3) under det att proteinkomponenten i provet är immunreaktiva (figur 4). Användningen av denna extraktion system i strama eller resurs begränsade områden av världen kan drastiskt minska sjukdomsbördan för befolkningen som bor där. Denna extraktion system kan också bidra i program för övervakning av sjukdomar i hela världen genom att tillhandahålla en robust men ändå snabbt och kostnadseffektivt sätt för prov bearbetning i strama eller avlägsna platser.
En viktig aspekt på den extraktionsmetod som beskrivs ovan är attden kan modifieras av användaren. Till exempel i fall där urvalsstorlek är större eller mindre än de ursprungliga 500 xl (steg 1,2), kan användaren justera volymen av reagensen därefter. Det vill säga, det volumetriska förhållandet hos reagensen för att provstorleken bör förbli konstant medan de absoluta volymer kan ändras. Dessutom kan justeringar i antalet passager över sorbenten också göras på användarens diskretion. Till exempel, om en större provvolym används, att leda provet över de absorberande fler gånger än anges (steg 2.4 & 3,3) kommer att öka sannolikheten av makromolekylen typ (nukleinsyra eller protein) i kontakt med absorptionsmedlet. Ökningen passager bör öka Infångningseffektivitet tills sorbent mättnad uppnås.
Vi har funnit att utvinningen verktyget och tillhörande kemiska har några begränsningar, den viktigaste av dessa är att proteinextraktion kemin är ineffektivt för återvinning av mycket glykosyleratproteiner. I händelse av att den nedströms belägna diagnostiska mål ett glykosylerat protein, kan detta system inte vara idealisk för identifiering. Dessutom är de övre och undre gräns för utvinning effektivitetsvinster för antingen nukleinsyror eller proteiner fortfarande bestäms och optimering pågår för att maximera återhämtning effektivitetsvinster. Vidareutveckling av verktyget kommer att övervinna de nuvarande kunskapsluckor.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering för utveckling av utvinningen pipetten gavs delvis genom en intern forskning och utveckling bidrag som beviljas för att DRP.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Guanidine Thiocyanate | Teknova | G4000 |
ethanol | Pharmco-Aaper | 11ACS200 |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L |
BSA | Sigma | A-4503 |