Summary
एपीपी intracellular डोमेन (AICD) बड़े पैमाने पर की शुद्धि के लिए एक विधि का वर्णन है. हम भी पद्धति का वर्णन करने के लिए प्रेरित
Protocol
1. संयोजक एपीपी intracellular डोमेन (AICD) की अभिव्यक्ति
- बदाल ई. कोलाई मानव (649-695 एपीपी के अवशेषों, neuronal isoform नंबर) AICD वेक्टर pGEX-4T 1 (जीई हेल्थकेयर) में क्लोन के साथ BL21 तनाव. इस वेक्टर glutathione-S-transferase (GST) के एक संलयन प्रोटीन का आधा भाग सी टर्मिनल के रूप में AICD व्यक्त करेंगे. यह वेक्टर भी एक थ्रोम्बिन दरार अनुक्रम encodes जीएसटी आधा भाग को हटाने की सुविधा. क्लोनिंग के विवरण pGEX-4T-1 में AICD हमारे पिछले 4 प्रकाशन में पाया जा सकता है.
- एक ही कॉलोनी से, एम्पीसिलीन (100 ग्राम / एमएल) के साथ लेग शोरबा के 10 मिलीलीटर टीका लगाना, और 37 डिग्री सेल्सियस पर जोरदार झटकों के साथ रातोंरात सेते हैं.
- अगली सुबह, एक लीटर एक फ्लास्क में रातोंरात संस्कृति के 5 मिलीलीटर के साथ 400 मिलीलीटर लेग / एम्पीसिलीन टीका लगाना.
- 600 एनएम पर जोरदार ऑप्टिकल घनत्व तक हिल गया है 0.6-0.4 तक पहुँच के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. यह आम तौर पर 2 से 2.5 घंटा ले जाएगा.
- Isopropyl बीटा-D-thiogalactopyranoside (IPTG) के 0.4 मिमी जोड़कर GST-AICD की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करें. 5 घंटे के लिए जोरदार झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- 4 पर 15 मिनट के लिए 6000 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस सेल गोली -80 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए प्रक्रिया के इस बिंदु पर संग्रहीत किया जा सकता है.
2. GST-AICD के शुद्धीकरण
- के रूप में 50 मिलीलीटर lysis बफर तैयार: 1 मिमी, dithiothreitol 1mm ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 0.1% ट्राइटन-X100, 1 मिमी (PMSF) phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड, पूरा protease अवरोध कॉकटेल (Roche एप्लाइड साइंस), और फास्फेट buffered खारा. बर्फ पर शांत रहो.
- बैक्टीरियल गोली (यदि पहले से जमे हुए) पिघलना कोबर्फ.
इस बिंदु पर, यह महत्वपूर्ण है कि सभी कदम में 4 डिग्री सेल्सियस proteolysis को सीमित करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. सभी ट्यूबों, buffers, और अन्य अभिकर्मकों पूर्व ठंडा होना चाहिए. यदि एक फ्रांसीसी प्रेस या lysis के लिए पायसीकारकों का उपयोग, इन पूर्व ठंडा के रूप में अच्छी तरह से होना चाहिए.
- अच्छी तरह से lysis बफर के 20 मिलीलीटर में बैक्टीरिया गोली resuspend. Vortexing और बर्फ पर 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ विचूर्णन का एक संयोजन गोली का पूरा resuspension सुनिश्चित करेगा.
- दर्रा resuspended एक पायसीकारकों के माध्यम से बैक्टीरियल कोशिकाओं (जैसे, Avestin EmulsiFlex C3) या फ्रेंच दबाव सेल, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30,000 साई पूर्व ठंडा. पायसीकारकों समय के माध्यम से एक दूसरे lysate दर्रा. एक पूर्व ठंडा 50 मिलीलीटर ट्यूब में lysate ले लीजिए.
इन दो उपकरणों के मुख्य लाभ यह है कि वे नमूना के तापन कम. sonication के अधिक इस्तेमाल तकनीक sonication जांच की नोक पर महत्वपूर्ण गर्मी उत्पन्न करता है औरपुनः संयोजक प्रोटीन का एकत्रीकरण में परिणाम कर सकते हैं.
- 30 मिनट के लिए 15,000 XG पर lysate अपकेंद्रित्र. अलग और एक पूर्व ठंडा 50 मिलीलीटर ट्यूब में तैरनेवाला रखना.
- Glutathione agarose (सिग्मा Aldrich) की एक 50% घोल के 500 μl जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए बारी बारी से 50 मिमी Tris 7.8, 0.1% ट्राइटन X100, 0.5 मिमी dithiothreitol, 10 मिमी कम glutathione: जबकि नमूना घूर्णन है, ताजा क्षालन बफर.
प्रोटोकॉल है जो कमरे के तापमान पर किया जाता है की केवल कदम प्रोद्धावन कदम है. क्षालन बफर कमरे के तापमान पर रखा जाता है. क्षालन बफर नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए.
- एक डिस्पोजेबल 5 "polystyrene क्रोमैटोग्राफी स्तंभ में मोटे (90-130 सुक्ष्ममापी) फिल्टर (सदाबहार वैज्ञानिक) कॉलम फॉस्फेट के 3 मिलीलीटर के साथ 5 बार धोने के साथ lysate और गारा डालो खारा buffered.
- स्तंभ के नीचे कैप और कमरे के तापमान क्षालन बफर के 500 μl जोड़ें. के शीर्ष टोपीस्तंभ और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए बारी बारी से. एक ठंडा 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक ले लीजिए. क्षालन दो बार (1.5 मिलीलीटर कुल प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक) दोहराएँ.
- फॉस्फेट की 4 लीटर में एक 10,000 आणविक वजन cutoff डायलिसिस झिल्ली (जैसे, थर्मो वैज्ञानिक स्लाइड-A-Lyzer डायलिसिस कैसेट) में प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक Dialyze 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर खारा buffered फॉस्फेट की एक अतिरिक्त 4 लीटर के खिलाफ Dialyze 4 में खारा buffered सी ° 1 घंटा अगले दिन के लिए.
- डायलिसिस कैसेट से प्रोटीन निकालें और एक प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के GST-AICD की उपज निर्धारित परख करते हैं. संस्कृति की 400 मिलीग्राम से एक ठेठ शुद्धि> 10-20 मिलीग्राम / एमएल की सांद्रता में प्रोटीन शुद्ध 20 मिलीग्राम की पैदावार में परिणाम देगा. अशेष भाजक -80 में 200 μl aliquots और फ्रीज में प्रोटीन ° सी.
3. थ्रोम्बिन GST-AICD के विखंडन और AICD के शुद्धीकरण
- Thaw GST-AICD शुद्ध के 200 μl और 1 thromb यू / μl के 20 μl जोड़ेंअंदर 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
थ्रोम्बिन की गुणवत्ता और शुद्धता निर्माताओं के बीच काफी भिन्न होता है, और संदूषण का एक महत्वपूर्ण स्रोत हो सकता है. हम जीई हेल्थकेयर (अभिकर्मकों की तालिका देखें) से थ्रोम्बिन का उपयोग करें. रातोंरात ऊष्मायन के बाद,> संलयन प्रोटीन की 95% (चित्रा 1B) cleaved किया जाना चाहिए.
- थ्रोम्बिन के साथ रात में दरार के बाद, यह संभावना है कि मुक्त AICD के एक अंश के एकत्रीकरण लिया और समाधान बादल छाए रहेंगे दिखाई दे सकते हैं. Centrifugation द्वारा 4 पर 20,000 XG पर एकत्रित सामग्री साफ़ 30 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस Microfuge और पूर्व ठंडा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- GST और थ्रोम्बिन निकालने के लिए, क्रमशः 50% glutathione agarose गारा और 50 μl 50% p aminobenzamidine agarose घोल के 50 μl जोड़ें. रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
- Agarose मोती तलछट के लिए संक्षेप में, अपकेंद्रित्र, और एक ताजा ट्यूब में तैरनेवाला हटा. टी निकालेंवह जीएसटी glutathione-agarose साथ चार गुना अधिक. P-aminobenzamidine agarose साथ एक एकल निष्कर्षण थ्रोम्बिन की 20 यू को दूर करने के लिए पर्याप्त है.
- शुद्ध AICD के 5 μl पर एक प्रोटीन quantitation परख प्रदर्शन. एक 400 मिलीलीटर संस्कृति से आम की पैदावार में 0.2 से 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एकाग्रता में 50-100 ग्राम हैं. उच्च पैदावार GST-AICD की बड़ी मात्रा में cleaving द्वारा संभव हो रहे हैं.
शुद्ध AICD जैव रासायनिक / biophysical लक्षण वर्णन के लिए नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए. अप्रयुक्त सामग्री को खारिज किया जाना चाहिए. यह भी संभव है नमूना lyophilizing और 6 बफर की एक छोटी मात्रा में resuspending AICD केंद्रित. यदि AICD पता लगाने (जैसे एक फिल्टर जाल या डॉट धब्बा परख के बाद), झिल्ली पर प्रतिजन पुनर्प्राप्ति सोख्ता प्रदर्शन किया जा सकता है रूप में Pimplikar और सूर्यनारायण 12 द्वारा वर्णित किया जाना चाहिए की आवश्यकता है.
4. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) के लिए AICD एकत्रीकरण
- पतला हौसले पी में AICD तैयारhosphate 15 μl की एक अंतिम मात्रा में 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक एकाग्रता खारा buffered. इस बिंदु पर, विभिन्न यौगिकों और / या प्रोटीन के लिए तय अगर वे AICD एकत्रीकरण को बाधित करने के लिए जोड़ा जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम पता चला है कि ubiquilin-1 के equimolar सांद्रता इस 4 परख में AICD का एकत्रीकरण को रोकने के.
यह भी कुल बड़ा फिल्टर जाल assays और प्रकाश 4 बिखरने के रूप में जैव रासायनिक प्रयोगों के लिए संस्करणों प्रतिक्रिया के लिए संभव है. हम सफलता था AICD 1 सुक्ष्ममापी के रूप में कम के रूप में सांद्रता को पतला साथ 400 μl के रूप में प्रतिक्रिया मिश्रण पर फिल्टर जाल assays के रूप में बड़े प्रदर्शन.
- 43 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए 800 rpm पर एक Eppendorf Thermomixer में झटकों के साथ नमूने incubating द्वारा थर्मल एकत्रीकरण प्रेरित. इस तापमान निगरानी assays है जो मॉडल निगरानी सब्सट्रेट साइट्रेट 4,13 synthase के थर्मल एकत्रीकरण की जांच पर आधारित करने के लिए चुना गया था.
- 20-गुना नमूना हौसले cleaved अभ्रक पर विआयनीकृत पानी और जगह 2 μl में पतला. एक dessicator में नमूना रातोंरात सूखी. यह empirically इमेजिंग के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए आवश्यक हो जाएगा, और इस प्रकार 10 से लेकर कई dilutions - 100 गुना विवेकपूर्ण होगा.
- एकत्रित 14 मोड दोहन में AFM ऑपरेटिंग का उपयोग AICD कल्पना. इस्तेमाल cantilevers सोने में लिपटे सूक्ष्म 2 एनएम नाममात्र टिप त्रिज्या के साथ तेज नाइट्राइड levers (MSNL, Bruker) हैं. विशिष्ट दोहन amplitudes durआईएनजी इमेजिंग cantilevers (30-50 kHz) के अनुनाद आवृत्ति पर 10-20 एनएम हैं.
हमने पाया है कि छवि गुणवत्ता और विभिन्न प्रोटीन समुच्चय के विपरीत लागू बल और प्रयोग की अवधि पर निर्भर करता है. टिप से नमूना गड़बड़ी को कम करने के लिए, हम एक सेट सूत्री अनुपात 95% से ऊपर रखने और 5-10 मिनट के लिए प्रत्येक नमूने की स्कैनिंग सीमित द्वारा लागू अपेक्षाकृत कम शक्ति को बनाए रखा. छवि प्रसंस्करण WSxM सॉफ्टवेयर (Nanotec) के साथ किया गया था. मानक छवि प्रसंस्करण विमान घटाव और सपाट थे. हमारी प्रयोगशालाओं एक "घर बनाया" 15 AFM एक वाणिज्यिक जांच स्कैनिंग खुर्दबीन नियंत्रण प्रणाली (Nanotec) interfaced.
5. प्रतिनिधि परिणाम
अभिव्यक्ति और GST-AICD के रिश्तेदार संवर्धन चित्र 1 ए में दिखाया गया है. Lysis के बाद, संलयन प्रोटीन के बहुमत घुलनशील अंश में मौजूद है, और इसलिए inclusi से निकासीशरीर पर आवश्यक नहीं है. glutathione agarose स्तंभ से eluted सामग्री> 95% शुद्ध है. चित्र 1 में दिखाया तैयारी में प्रोटीन की एकाग्रता स्तंभ से eluted 14.5 मिलीग्राम / एमएल था, और उपज 22 मिलीग्राम (400 मिलीलीटर की एक प्रारंभिक संस्कृति से) था. इस थ्रोम्बिन की 20 यू के साथ रात भर की तैयारी के 200 μl के विखंडन संलयन प्रोटीन (चित्रा 1 बी) के लगभग 100% दरार में हुई. थ्रोम्बिन की राशि का इस्तेमाल काफी कम है रूप में Coomassie नीले धुंधला detectable नहीं हो (cleaved "लेन, चित्रा 1B देखें). थ्रोम्बिन और जीएसटी निकालना सामग्री के कुछ नुकसान में हुई, लेकिन यह> 90% की 70 ग्राम AICD इस तैयार करने में एक उपज के साथ 0.35 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में शुद्ध था चित्रा 1C AICD के एकत्रीकरण के लिए प्रवाह चार्ट से पता चलता है. और बाद में विश्लेषण. AICD AFM द्वारा imaged समुच्चय आम तौर पर कर रहे हैं उपगोल / अनाकार और आकार में सीमा 50 से 100 एनएम (चित्रा 1D, एफ) से. पुंजितसामग्री detectable जब निगरानी ubiquilin-1 के एक equimolar राशि एकत्रीकरण रिएक्शन (चित्रा 1E) 4 से जोड़ा जाता है नहीं है.
चित्रा 1. शोधन और के एकत्रीकरण के AICD. नमूनों की) Coomassie नीले धुंधला शुद्धिकरण की प्रक्रिया का हर कदम पर एकत्र की. Uninduced और प्रेरित नमूने के लिए, कुल जीवाणुओं की 20 μl जेल पर चलाए जा रहे थे. तैरनेवाला अंश के लिए, lysate (20 मिलीलीटर की कुल मात्रा से) के 5 μl जेल पर चलाए जा रहे थे. अंश के लिए गोली, गोली lysis बफर के 20 मिलीलीटर में resuspended किया गया था, और इस सामग्री के 5 μl 30 मिनट के लिए एक पानी स्नान sonicator में 4 पर sonicated थे ° C पूर्व जेल पर लोड करने के लिए. Flowthrough के लिए, 5 μl जेल पर चलाए जा रहे थे. प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक जेल पर लोड की मात्रा का संकेत कर रहे हैं. बी) uncleaved और cleaved (2 μl) GST-AICD और 1 और 5 एंड एम के Coomassie नीले दाग जेलयू, एल शुद्ध AICD. सी) AICD शुद्धि, एकत्रीकरण, और विश्लेषण के फ़्लोचार्ट. डी, ई) प्रतिनिधि AFM की छवि thermally (डी) और उपस्थिति (ई) आणविक निगरानी ubiquilin 1 की अनुपस्थिति में AICD एकत्रित. AICD समुच्चय के आकार के वितरण का हिस्टोग्राम) एफ.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में हम संरचनात्मक, biophysical और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए अत्यधिक शुद्ध AICD प्राप्त करने के लिए एक प्रक्रिया को रेखांकित किया है. इस प्रक्रिया परिष्कृत क्रोमैटोग्राफी उपकरण की आवश्यकता नहीं है और इसलिए ज्यादातर प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है. अन्य समूहों AICD 5-7,16 शुद्ध GST-AICD जैव रासायनिक / संरचनात्मक विश्लेषण के लिए 17-19, सहित,. पिछले प्रोटोकॉल के लिए नुकसान के गरीब विलेयता AICD 16, आदर्श शुद्धता 17 की तुलना में कम है, और अपवर्जन आकार 16 के लिए आवश्यकता शामिल हैं या चरण क्रोमैटोग्राफी 6,20 उलट. इस प्रकार, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल बहुत इन विट्रो अध्ययन में AICD की सुविधा चाहिए. हम भी AFM द्वारा AICD और पता लगाने की थर्मल एकत्रीकरण के लिए एक विधि का वर्णन है. हालांकि तेजी से amyloid 21 क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है, AFM एक अत्यधिक विशेष तकनीक है. प्रकाश बिखरने, अवसादन, और फिल्टर जाल assays के रूप में अधिक approachable assays भी कर सकते हैं4 AICD के थर्मल एकत्रीकरण की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अंत में, इन विट्रो में सीधे शुद्ध आणविक संरक्षिकाओं ubiquilin-1 के रूप में 4, थर्मल एकत्रीकरण की AICD को रोकने की क्षमता की जांच करने की क्षमता modulating एपीपी जीव विज्ञान में अन्य साइटोसोलिक संरक्षिकाओं की कार्यात्मक भूमिका के लिए elucidating दरवाजे खोलता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए सीडीएनए एपीपी के लिए डॉ. हुई Zheng (मेडिसिन के Baylor कॉलेज) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम NIH R21AG031948 अनुदान (DB, JMB), F30AG030878 (ईएसएस), R01DK073394 (AFO), जॉन बायोमेडिकल रिसर्च के लिए Sealy मेमोरियल बंदोबस्ती कोष (AFO), और जीन सी. और विलियम डी. विलिस तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान बंदोबस्ती द्वारा वित्त पोषित किया गया था (ईएसएस). JMB translational अनुसंधान स्कॉलर प्रोग्राम में एक विद्वान और टेक्सास चिकित्सा शाखा क्लाउड ई. काली मिर्च पुराने अमेरिकियों स्वतंत्रता केंद्र विश्वविद्यालय (NIH UL1RR029876 और P30 एजी-०,२४,८३२, क्रमशः अनुदान द्वारा समर्थित) के एक सदस्य है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
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