Summary
Un metodo per la grande purificazione del dominio intracellulare APP (AICD) è descritto. Abbiamo anche descrivere la metodologia di indurre
Abstract
Proteina precursore dell'amiloide (APP) è un tipo di proteina transmembrana I associato alla patogenesi della malattia di Alzheimer (AD). APP è caratterizzata da un grande dominio extracellulare e un dominio breve citosolico chiamato il dominio intracellulare di APP (AICD). Durante la maturazione attraverso la via secretoria, APP può essere scissa dalla proteasi denominate α, β, e γ-secretasi 1. Sequenziale clivaggio proteolitico di APP con β e γ-secretasi porta alla produzione di un peptide piccolo proteolitico, Ap definito, che è amiloidogena e il componente principale delle placche senili. L'AICD è liberata dalla membrana dopo trasformazione secretasi, e attraverso interazioni con Fe65 e Tip60, può traslocare al nucleo di partecipare nella regolazione della trascrizione di geni bersaglio più 2,3. Proteina-proteina interazioni che coinvolgono il AICD può influenzare il traffico, l'elaborazione, e le funzioni cellulari di olo-APP e il suo C-terminaL frammenti. Abbiamo recentemente dimostrato che AICD può aggregare in vitro, e questo processo è inibito dalla AD-implicato chaperone molecolare ubiquilin-1 4. Coerentemente con questi risultati, il AICD ha esposto domini idrofobici ed è intrinsecamente disordinati in vitro 5,6, tuttavia ottiene stabile struttura secondaria quando si lega al Fe65 7. Abbiamo proposto che ubiquilin-1 impedisce appropriato interazioni inter e intramolecolari di AICD, impedendo l'aggregazione in vitro e in cellule intatte 4. Mentre la maggior parte degli studi si concentrano sul ruolo di APP nella patogenesi di AD, il ruolo di AICD in questo processo non è chiara. Espressione di AICD ha mostrato di indurre apoptosi 8, per modulare i percorsi di segnalazione 9 e di regolare il calcio segnalazione 10. Over-espressione di AICD e Fe65 in un modello di topo transgenico induce Alzheimer come patologia 11, e recentemente AICD è stato rilevato in reggisenonei lisati mediante Western blotting utilizzando appropriate tecniche di recupero di antigene 12. Per facilitare studi strutturali, biochimici e biofisici del AICD, abbiamo sviluppato una procedura per produrre quantità elevate di ricombinante altamente puro proteine AICD. Abbiamo inoltre descrivere un metodo per indurre l'aggregazione in vitro termica AICD e analisi mediante microscopia a forza atomica. I metodi descritti sono utili per la caratterizzazione biochimica, biofisica e strutturale del AICD e gli effetti di chaperone molecolare sull'aggregazione AICD.
Protocol
1. L'espressione di APP ricombinante dominio intracellulare (AICD)
- Transform E. coli ceppo BL21 con AICD umana (residui 649-695 di APP, isoforma neuronale numerazione) clonato nel vettore pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Questo vettore esprimerà AICD la porzione C-terminale di una proteina di fusione di glutatione-S-transferasi (GST). Questo vettore codifica anche una sequenza trombina clivaggio per facilitare la rimozione della porzione GST. Dettagli della clonazione AICD in pGEX-4T-1 può essere trovata nella nostra precedente pubblicazione 4.
- Da una singola colonia, inoculare 10 ml di brodo LB con ampicillina (100 ug / ml), e incubare una notte a 37 ° C con agitazione vigorosa.
- Il mattino seguente, inoculare 400 ml LB / ampicillina in una beuta da un litro con 5 ml di coltura durante la notte.
- Incubare a 37 ° C con agitazione vigorosa fino a quando la densità ottica a 600 nm ha raggiunto 0,4-0,6. Questo normalmente 2-2,5 ore.
- Indurre l'espressione di GST-AICD aggiungendo 0,4 mM di isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG). Incubare a 37 ° C con agitazione vigorosa per 5 ore.
- Centrifugare le cellule a 6.000 xg per 15 min a 4 ° C. Il pellet cellulare può essere conservato a -80 ° C per diversi mesi, a questo punto del procedimento.
2. Purificazione di GST-AICD
- Preparare 50 ml di tampone di lisi come segue: 1 mM ditiotreitolo 1 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF), Complete cocktail inibitore di proteasi (Roche Applied Science), e tampone fosfato. Freddo sul ghiaccio.
- Scongelare pellet batterico (se precedentemente congelato) sullaghiaccio.
A questo punto, è fondamentale che tutti i passi vengono eseguiti a 4 ° C per limitare proteolisi. Tutti i tubi, tamponi, e altri reagenti devono essere pre-refrigerati. Se si utilizza una pressa francese o emulsionante per lisi, questi dovrebbero essere pre-refrigerati pure.
- Accuratamente risospendere il pellet batterico in 20 ml di tampone di lisi. Una combinazione di vortex e triturazione con pipetta 10 ml di ghiaccio assicurerà completa risospensione del pellet.
- Far passare le cellule risospese batteriche attraverso un emulsionante (ad esempio, Avestin Emulsiflex-C3) o cellule pressione francese, pre-refrigerati a 4 ° C a 30.000 psi. Passare il lisato attraverso l'emulsionante una seconda volta. Raccogliere il lisato in un pre-refrigerati tubo da 50 ml.
Il vantaggio principale di questi due strumenti è che minimizzare il riscaldamento del campione. La tecnica comunemente usata di sonicazione genera calore sulla punta della sonda sonicazione epuò causare aggregazione di proteine ricombinanti.
- Centrifugare il lisato a 15.000 xg per 30 min. Separare e mantenere il supernatante in un pre-raffreddata tubo da 50 ml.
- Aggiungere 500 pl di un impasto al 50% di glutatione-agarosio (Sigma-Aldrich). Ruotare per 30 min a 4 ° C. Mentre il campione sta ruotando, fanno tampone fresco eluizione: 50 mM Tris 7,8, 0,1% Triton-X100, 0,5 mM di ditiotreitolo, 10 mM glutatione ridotto.
L'unico passo del protocollo che viene eseguita a temperatura ambiente è la fase di eluizione. Così, il tampone di eluizione viene mantenuta a temperatura ambiente. Buffer di eluizione deve essere preparato fresco.
- Versare il lisato e dei liquami in un usa e getta 5 "colonna polistirolo cromatografia con grossolani (90-130 micron) filtri (Evergreen scientifico). Lavare la colonna 5 volte con 3 ml di tampone fosfato.
- Tappare il fondo della colonna e aggiungere 500 microlitri di tampone di eluizione temperatura ambiente. Cap all'inizio dellacolonna e ruotare per 5 min a temperatura ambiente. Raccogliere l'eluato in una provetta da microcentrifuga refrigerata 1,5 ml. Ripetere l'eluizione altre due volte (1.5 ml eluato totale).
- Dializzare l'eluato in un molecolare 10000 membrana di dialisi taglio di peso (ad esempio, Thermo Scientific Slide-A-lizzatore dialisi cassette) in 4 litri di soluzione salina tamponata per una notte a 4 ° C. Dializza contro un ulteriore 4 litri di tampone fosfato a 4 ° C per 1 ora il giorno seguente.
- Rimuovere la proteina dalla cassetta dialisi ed eseguire un test per determinare la quantificazione delle proteine resa di GST-AICD. Una purificazione tipico da 400 ml di coltura comporta rendimenti di> 20 mg di proteina purificata a concentrazioni di 10-20 mg / ml. Aliquotare la proteina in 200 pl aliquote e congelati a -80 ° C.
3. Cleavage trombina di GST-AICD e Purificazione di AICD
- Scongelare 200 ml di acqua di GST-AICD e aggiungere 20 ml di 1 U / mL thrombtrovi Incubare per una notte a 37 ° C.
La qualità e la purezza della trombina varia considerevolmente tra i costruttori, e può essere una fonte di contaminazione. Usiamo trombina da GE Healthcare (vedi tabella dei reagenti). Dopo incubazione per una notte,> 95% della proteina di fusione deve essere scisso (Figura 1B).
- Dopo clivaggio notte con trombina, è probabile che una frazione del AICD liberato subito aggregazione e la soluzione può apparire torbida. Cancellare il materiale aggregato mediante centrifugazione a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante in un pre-raffreddata provetta per microcentrifuga.
- Aggiungere 50 ml di 50% di glutatione-agarosio slurry e 50 pl 50% p-aminobenzamidine-agarosio slurry per rimuovere GST e trombina, rispettivamente. Incubare con rotazione per 5 min a temperatura ambiente.
- Centrifugare brevemente per sedimentare le perline di agarosio, e rimuovere il surnatante in una nuova provetta. Estratto tGST ha quattro volte più con glutatione-agarosio. Una singola estrazione con p-aminobenzamidine-agarosio è sufficiente a rimuovere il 20 U di trombina.
- Eseguire un test di quantificazione delle proteine, il 5 microlitri della AICD purificato. Rese tipiche di una cultura 400 ml sono 50-100 mcg ad una concentrazione di 0,2 a 0,5 mg / ml. Rese più elevate sono possibili, con l'adesione più grandi volumi di GST-AICD.
Purificato AICD deve essere preparato fresco per la caratterizzazione biochimica / biofisica. Materiale non utilizzato deve essere eliminato. È anche possibile concentrare il AICD dalla liofilizzazione del campione e la risospensione in un volume più piccolo di tampone 6. Se la rilevazione AICD richiede assorbente (ad esempio dopo una trappola filtro o saggio dot blot), il recupero antigene sulla membrana deve essere eseguita come descritto da Pimplikar e Suryanarayana 12.
4. Aggregazione AICD per microscopia a forza atomica (AFM)
- Diluire appena preparata AICD in phosphate salina tamponata ad una concentrazione di 0,1 mg / ml in un volume finale di 15 microlitri. A questo punto, vari composti e / o le proteine possono essere aggiunti per determinare se essi inibiscono l'aggregazione AICD. Per esempio, abbiamo dimostrato che le concentrazioni equimolari di ubiquilin-1 prevenire l'aggregazione di AICD in questo test 4.
È anche possibile aggregare grandi volumi di reazione per esperimenti biochimici come saggi trap filtrazione e diffusione della luce 4. Abbiamo avuto successo eseguendo saggi trappola filtro su miscele di reazione più grande a 400 ml con AICD diluito a concentrazioni a partire da 1 pM.
- Inducono aggregazione termica incubando i campioni a 43 ° C con agitazione a 800 rpm in un Thermomixer Eppendorf per 48 ore. Questa temperatura è stato scelto sulla base di test di chaperone che esaminano l'aggregazione termica del modello citrato sintasi accompagnatore substrato 4,13.
- Diluire il campione di 20 volte in acqua deionizzata e posto su 2 microlitri mica appena spaccati. Essiccare il campione in essiccatore notte. Sarà necessario determinare empiricamente la diluizione ottimale per immagini, e quindi diluizioni diverse da 10 - a 100 volte sarebbe prudente.
- Visualizza la AICD aggregato AFM utilizza il sistema operativo in tapping mode 14. I cantilever utilizzati sono leve micro oro rivestite con nitruro di taglienti (MSNL, Bruker) con un raggio di punta nominale di 2 nm. Tipica toccando ampiezze duranteing imaging sono 10-20 nm alla frequenza di risonanza del cantilever (30-50 kHz).
Abbiamo trovato che la qualità dell'immagine e il contrasto di aggregati proteici differenti dipendeva dalla forza applicata e la durata dell'esperimento. Per minimizzare perturbazione campione dalla punta, abbiamo mantenuto la forza applicata relativamente basso mantenendo un set-point rapporto superiore al 95% e limitando la scansione di ogni campione per 5-10 min. L'elaborazione delle immagini è stata effettuata con il software WSxM (Nanotec). Elaborazione immagine standard consisteva piano sottrazione e appiattimento. I nostri laboratori utilizzano una "casa-costruita" AFM 15 interfacciato ad un sistema commerciale di sonda di controllo microscopio a scansione (Nanotec).
5. Risultati rappresentativi
L'espressione e arricchimento relativo di GST-AICD è mostrato nella Figura 1A. Dopo lisi, la maggior parte della proteina di fusione è presente nella frazione solubile e quindi estrazione da Inclusiil corpo non è necessaria. Il materiale eluito dalla colonna di glutatione agarosio è> 95% puro. Nella preparazione mostrato nella figura 1, la concentrazione di proteina eluita dalla colonna era 14,5 mg / ml, e la resa era 22 mg (da una coltura iniziale di 400 ml). Clivaggio di 200 pl di questa preparazione overnight con 20 U di trombina comportato quasi il 100% clivaggio della proteina di fusione (Figura 1B). La quantità di trombina utilizzata è sufficientemente basso da non essere rilevabile mediante colorazione con Coomassie blue (vedi corsia "Cleaved", Figura 1B). Rimozione della trombina e GST provocato una perdita di materiale, tuttavia era> 90% puro con una resa in questa preparazione di 70 pg di AICD ad una concentrazione di 0,35 mg / ml. Figura 1C mostra il diagramma di flusso per l'aggregazione di AICD e successiva analisi. Aggregati AICD ripreso da AFM sono tipicamente sferoide / amorfo, e la gamma nel formato da 50 a 100 nM (Figura 1D, F). Aggregatomateriale non è rilevabile quando una quantità equimolare di chaperone ubiquilin-1 viene aggiunto alla reazione di aggregazione (Figura 1E) 4.
Figura 1. Purificazione e aggregazione di AICD. A) Coomassie colorazione blu di campioni raccolti in ogni fase del processo di purificazione. Per i campioni uninduced e indotta, 20 pl di batteri totali sono stati eseguiti sul gel. Per la frazione supernatante, 5 microlitri di lisato (da un volume totale di 20 ml) sono stati analizzati su gel. Per la frazione di pellet, il pellet è stato risospeso in 20 ml di tampone di lisi, e 5 microlitri di questo materiale sono stati sonicati in un sonicatore bagno di acqua per 30 minuti a 4 ° C prima di caricare il gel. Per l'eluato, 5 microlitri sono stati eseguiti sul gel. Le quantità di eluato caricati sul gel sono indicati. B) Coomassie blu gel colorato di uncleaved e spaccati GST-AICD (2 ml) e 1 e 5 & mu, l purificato AICD. C) Diagramma di flusso di purificazione AICD, aggregazione e analisi. D, E) Rappresentante AFM immagine termicamente aggregate AICD in assenza (D) e presenza (E) del chaperone molecolare ubiquilin-1. F) Istogramma della distribuzione delle dimensioni degli aggregati AICD.
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Discussion
In questo protocollo abbiamo delineato una procedura per ottenere AICD elevata purezza per analisi strutturali, biofisica e biochimica. Questa procedura non richiede attrezzature sofisticate cromatografia ed è quindi accessibile alla maggior parte dei laboratori. Altri gruppi hanno purificato AICD 5-7,16, compreso GST-AICD 17-19, per le analisi biochimiche / strutturale. Svantaggi ai protocolli precedenti includono scarsa solubilità di AICD 16, a meno di ideale purezza 17, e la necessità di esclusione di taglia 16 o la cromatografia in fase inversa 6,20. Pertanto, il protocollo qui descritto dovrebbe agevolare notevolmente gli studi in vitro di AICD. Abbiamo anche descritto un metodo per aggregazione termica AICD e rilevamento mediante AFM. Sebbene sempre più utilizzati in campo amiloide 21, AFM è una tecnica altamente specializzata. Saggi più accessibile come diffusione della luce, sedimentazione, e saggi trappola filtro può ancheessere usato per esaminare l'aggregazione termica di AICD 4. Infine, la possibilità di esaminare direttamente in vitro la capacità di purificato chaperoni molecolari, come ubiquilin-1 4, per impedire l'aggregazione termica AICD apre la porta per chiarire il ruolo funzionale di altri chaperoni citosolici in biologia APP modulante.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) per la APP cDNA. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), il John Sealy Memorial Fondo di dotazione per la ricerca biomedica (AFO), e il C. Jean e William D. Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB è uno studioso nel Programma Translational Research Scholar e membro della University of Texas Medical Branch Claude E. Independence Pepper Centro anziani americani (supportato da sovvenzioni NIH UL1RR029876 e P30-AG-024832, rispettivamente).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
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