Summary
En metod för storskalig rening av APP intracellulär domän (AICD) beskrives. Vi beskriver också metoder för att inducera
Abstract
Amyloid prekursorprotein (APP) är en typ I transmembranprotein i samband med patogenesen av Alzheimers sjukdom (AD). APP kännetecknas av en stor extracellulär domän och en kort cytosolisk domän kallas APP intracellulär domän (AICD). Under mognad genom den sekretoriska vägen, kan APP klyvas av proteaser kallade α, β, och γ-secretases 1. Sekventiell proteolytisk klyvning av APP med β och γ-secretases leder till produktion av en liten proteolytisk peptid, benämnd Ap, som är amyloidogena och kärnan beståndsdelen i senila plack. Den AICD är också befriad från membranet efter sekretas bearbetning och genom interaktioner med Fe65 och Tip60 kan translokeras till kärnan för att delta i transkriptionsreglering av flera målgener 2,3. Protein-protein interaktioner som involverar AICD kan påverka handeln, bearbetning och cellulära funktioner holo-APP och dess C-terminal-fragment. Vi har nyligen visat att AICD kan aggregat in vitro, och denna process hämmas av AD-inblandad molekylär kaperon ubiquilin-1 4. I överensstämmelse med dessa resultat har AICD utsatt hydrofoba domäner och är i sig störda in vitro 5,6, men den får stabil sekundär struktur vid bindning till Fe65 7. Vi har föreslagit att ubiquilin-1 förhindrar olämpliga inter-och intramolekylära interaktioner av AICD, förhindra aggregation in vitro och i intakta celler 4. Medan de flesta studier fokuserar på betydelsen av APP i patogenesen av AD, är den roll som AICD i denna process inte klart. Expression av AICD har visats inducera apoptos 8, att modulera signalvägar 9, och för att reglera kalcium signalering 10. Överuttryck av AICD och Fe65 i en transgen musmodell inducerar Alzheimers som patologi 11, och nyligen AICD har upptäckts i behåi lysat genom Western blotting vid användning lämpliga tekniker antigenåtervinning 12. För att underlätta strukturella, biokemiska och biofysiska studier av AICD, har vi utvecklat ett förfarande för att framställa rekombinant stora mängder mycket ren AICD protein. Vi beskriver vidare ett förfarande för att inducera in vitro termiska aggregering av AICD och analys med atomkraftsmikroskopi. De beskrivna metoderna är användbara för biokemisk, biofysik, och strukturella karakterisering av AICD och effekterna av molekylära chaperoner på AICD aggregering.
Protocol
1. Uttryck av rekombinant APP intracellulär domän (AICD)
- Transformera E. coli stam BL21 med humant AICD (rester 649-695 av APP, neuronala isoformen numrering) klonad in pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Denna vektor uttrycker AICD som den C-terminala delen av ett fusionsprotein av glutation-S-transferas (GST). Denna vektor kodar också en trombin klyvningssekvens för att underlätta avlägsnande av GST-delen. Uppgifter om kloning AICD i pGEX-4T-1 finns i vår tidigare publikation 4.
- Från en enda koloni, ympa 10 ml LB-buljong med ampicillin (100 pg / ml), och inkubera över natten vid 37 ° C under kraftig skakning.
- Följande morgon, ympa 400 ml LB / ampicillin i en en-liters kolv med 5 ml av den över natten kulturen.
- Inkubera vid 37 ° C under kraftig skakning tills den optiska densiteten vid 600 nm har nått 0,4 till 0,6. Detta tar normalt 2 till 2,5 timmar.
- Inducera expression av GST-AICD genom tillsats av 0,4 mM isopropyl-beta-D-tiogalaktopyranosid (IPTG). Inkubera vid 37 ° C under kraftig skakning under 5 timmar.
- Centrifugera cellerna vid 6.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C. Cellpelleten kan lagras vid -80 ° C under flera månader i detta skede av förfarandet.
2. Rening av GST-AICD
- Bered 50 ml buffert lys enligt följande: 1 mM ditiotreitol, 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), Komplett proteasinhibitorcocktail (Roche Applied Science), och fosfatbuffrad saltlösning. Chill på is.
- Tina bakteriepelleten (om tidigare frysta) påis.
Vid denna punkt, är det viktigt att alla steg utförs vid 4 ° C för att begränsa proteolys. Alla rör, buffertar och andra reagens bör vara för-kyld. Om du använder en fransk press eller emulgeringsmedel för lys, bör dessa vara i förväg kyld också.
- Grundligt resuspendera den bakteriella pelleten i 20 ml lysbuffert. En kombination av vortexa och triturering med 10 ml pipett på is kommer att garantera fullständig återsuspension av pelleten.
- Passera de återsuspenderade bakterieceller genom en emulgator (t.ex. Avestin Emulsiflex-C3) eller fransk tryckcell, pre-kylda till 4 ° C vid 30.000 psi. Passera lysatet genom emulgeringsmedlet en andra gång. Samla lysatet till en pre-kyld 50 ml rör.
Den huvudsakliga fördelen med dessa två instrument är att de minimerar uppvärmningen av provet. Den vanligen använda tekniken med sonikering alstrar betydande värme vid spetsen av sonication sonden ochkan resultera i aggregation av rekombinanta proteiner.
- Centrifugera lysatet vid 15.000 x g under 30 minuter. Separera och hålla supernatanten i en pre-kyld 50 ml rör.
- Lägg 500 pl av en 50% uppslamning av glutation-agaros (Sigma-Aldrich). Rotera under 30 minuter vid 4 ° C. Medan provet roterar, göra färskt elueringsbuffert: 50 mM Tris 7,8, 0,1% Triton-X100, 0,5 mM ditiotreitol, 10 mM reducerat glutation.
Det enda steget av protokollet som utförs vid rumstemperatur är elueringssteget. Sålunda elueringsbufferten hölls vid rumstemperatur. Elueringsbuffert ska beredas på nytt.
- Häll lysatet och uppslamningen till en engångs 5 "polystyren kromatografikolonn med grova (90-130 | im) filter (Evergreen Scientific). Tvätta kolonnen 5 gånger med 3 ml fosfatbuffrad saltlösning.
- Kapsyl kolonnbotten och tillsätt 500 pl rumstemperatur elueringsbuffert. Kapsyl toppen avkolonn och rotera under 5 min vid rumstemperatur. Samla upp eluatet i en kyld 1,5 ml mikrofugrör. Upprepa eluering två gånger (1,5 ml total eluat).
- Dialysera eluatet i en 10.000 molekylviktsgräns dialysmembran (t.ex., Thermo Scientific Slide-A-Lyzer kassetter dialys) i 4 liter fosfatbuffrad saltlösning över natten vid 4 ° C. Dialysera mot ytterligare 4 liter fosfatbuffrad saltlösning vid 4 ° C under 1 timme följande dag.
- Ta proteinet från dialys kassetten och utföra en analys-protein kvantifiering för att bestämma utbytet av GST-AICD. En typisk rening från 400 ml kultur kommer att resultera i utbyten av> 20 mg renat protein vid koncentrationer av 10-20 mg / ml. Alikvotera proteinet i 200 | il alikvoter och frysa vid -80 ° C.
3. Trombinklyvning av GST-AICD och rening av AICD
- Thaw 200 pl renad GST-AICD och tillsätt 20 pl av 1 U / pl Thrombi. Inkubera över natten vid 37 ° C.
Den kvalitet och renhet av trombin varierar avsevärt mellan tillverkare och kan vara en betydande källa till förorening. Vi använder trombin från GE Healthcare (se tabell av reagens). Efter inkubation över natten, bör> 95% av fusionsproteinet klyvas (Figur 1B).
- Efter natten klyvning med trombin, är det troligt att en del av den frigjorda AICD genomgick aggregering och lösningen kan synas grumlig. Rensa aggregerade materialet genom centrifugering vid 20.000 x g under 30 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten till en pre-kyld mikrofugrör.
- Lägg 50 il 50% glutation-agaros uppslamningen och 50 pl 50% p-aminobensamidin-agaros uppslamningen att avlägsna GST och trombin, resp. Inkubera med rotation under 5 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera kort för att sedimentera agarospärlor, och avlägsna supernatanten till ett nytt rör. Utdrag than GST fyra gånger med glutation-agaros. En enda extraktion med p-aminobensamidin-agaros är tillräcklig för att avlägsna 20 U trombin.
- Gör en analys protein kvantifiering den 5 ul av det renade AICD. Typiska utbyten från en 400 ml kultur är 50-100 pg vid en koncentration av 0,2 till 0,5 mg / ml. Högre utbyten är möjliga genom att klyva stora volymer av GST-AICD.
Renat AICD bör beredas på nytt för biokemisk / biofysiska karakterisering. Oanvänt material ska kasseras. Det är också möjligt att koncentrera AICD genom lyofilisering av provet och återsuspendering i en mindre volym av buffert 6. Om detektering av AICD kräver blotting (exempel efter ett spärrfilter eller dot blot-analys), antigenåtervinning på membranet bör utföras såsom beskrivits av Pimplikar och Suryanarayana 12.
4. AICD aggregering för atomkraftsmikroskopi (AFM)
- Späd färskt beredd AICD i phosphate buffrad saltlösning till en koncentration av 0,1 mg / ml i en slutlig volym av 15 | il. Vid denna punkt, kan olika föreningar och / eller proteiner läggas att bestämma om de hämmar AICD aggregering. Till exempel, har vi visat att ekvimolära koncentrationer av ubiquilin-1 förhindra aggregation av AICD i denna analys 4.
Det är också möjligt att aggregera större reaktionsvolymer för biokemiska experiment som filter fälla analyser och ljusspridning 4. Vi har haft framgång utför spärrfilter analyser på reaktionsblandningar så stora som 400 | il med AICD utspäddes till koncentrationer så låga som 1 fiM.
- Inducera termisk aggregering genom att inkubera proverna vid 43 ° C med skakning vid 800 rpm i en Eppendorf Thermomixer under 48 timmar. Denna temperatur valdes baserat på eskortering analyser som undersöker den termiska aggregering av modellen förkläde underlaget citratsyntas 4,13.
- Späd provet 20-faldigt i avjoniserat vatten och fläck 2 pl till färskt klyvd glimmer. Torka provet i en exsickator över natten. Det kommer att bli nödvändigt att empiriskt bestämma den optimala spädningen för avbildning och därmed flera utspädningar från 10 - till 100-faldigt skulle vara klokt.
- Visualisera den aggregerade AICD med AFM verkar i knacka läge 14. De använda utliggare är guld-belagda mikro skarpa nitrid spakarna (MSNL, Bruker) med en nominell spets radie av 2 nm. Typisk knacka amplituder underning avbildning är 10-20 nm vid resonansfrekvensen av konsolerna (30-50 kHz).
Vi fann att bildkvalitet och kontrast olika proteinaggregat beroende på den applicerade kraften och varaktigheten av experimentet. För att minimera provets störning av spetsen, bibehöll vi den applicerade kraften relativt låg genom att hålla en börvärde förhållande över 95% och begränsa avsökningen av varje prov till 5-10 minuter. Bildbehandling utfördes med WSxM programvara (Nanotec). Standard bildbehandling bestod av planet subtraktion och tillplattning. Våra laboratorier använder en "hembyggda" AFM 15 gränssnitt till en kommersiell scanning probe mikroskop styrsystem (Nanotec).
5. Representativa resultat
Uttrycket och relativa anrikning av GST-AICD visas i figur 1A. Efter lys, är majoriteten av fusionsproteinet är närvarande i den lösliga fraktionen, och därför extraktion från inclusipå organ är inte nödvändig. Det material som eluerades från glutation-agaroskolonn är> 95% ren. Vid framställningen som visas i figur 1, var koncentrationen av protein elueras från kolonnen 14,5 mg / ml, och utbytet var 22 mg (från en startkultur av 400 ml). Klyvning av 200 pl av denna framställning natten med 20 U av trombin resulterade i nästan 100% klyvning av fusionsproteinet (Figur 1B). Mängden trombin som används är tillräckligt låg för att inte kunna detekteras genom Coomassie blåfärgning (se "kluvna" körfält, Figur 1B). Avlägsnande av trombin och GST resulterade i viss förlust av material, men det var> 90% ren med ett utbyte på denna prep av 70 pg av AICD vid en koncentration av 0,35 mg / ml. Figur 1C visar flödesschemat för aggregering av AICD och efterföljande analys. AICD aggregat avbildas av AFM är typiskt sfäroid / amorfa, och varierar i storlek från 50 till 100 nm (figur 1D, F). AggregeradMaterialet är inte detekterbar när en ekvimolär mängd av kaperonet ubiquilin-1 sätts till aggregering reaktionen (figur 1E) 4.
Figur 1. Rening och aggregering av AICD. A) Coomassie färgning av prover som samlats vid varje steg i reningsprocessen. För de oinducerade och inducerade prover var 20 | il av den totala bakterier köras på gelén. För den överstående fraktionen var 5 | il av lysat (från en total volym av 20 ml) kördes på gelén. För pelletfraktionen, pelleten återsuspenderades i 20 ml lysbuffert, och 5 pl av detta material sonikerades i ett vattenbad sonikator under 30 minuter vid 4 ° C före laddning på gelén. För genomflöde var 5 | il kördes på gelén. Mängderna av eluat laddades på gelén indikeras. B) Coomassieblått färgad gel av oklyvt och kluvna GST-AICD (2 pl) och 1 och 5 och mU, L renat AICD. C) Flödesschema för AICD rening, sammanställning och analys. D, E) representant AFM bild av termiskt aggregerat AICD i frånvaro (D) och närvaro (E) i den molekylära kaperon ubiquilin-1. F) Histogram av storleksfördelningen av AICD aggregat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll vi har beskrivit ett förfarande för att erhålla högren AICD för strukturella, biofysiska och biokemiska analyser. Detta förfarande kräver inte sofistikerade kromatografi utrustning och är därför tillgänglig för de flesta laboratorier. Andra grupper har renat AICD 5-7,16, inklusive GST-AICD 17-19, för biokemiska / strukturella analyser. Nackdelar med föregående protokollen är dålig löslighet AICD 16, mindre än idealisk renhet 17, och kravet på storleken uteslutning 16 eller omvänd fas-kromatografi 6,20. Således bör det protokoll som beskrivs här i hög grad underlätta in vitro studier av AICD. Vi har också beskrivit en metod för termisk aggregation av AICD och detektion genom AFM. Även alltmer i amyloid fält 21, är AFM en högt specialiserad teknik. Mer tillgänglig analyser såsom ljusspridning, sedimentation och filter analyser fälla kan ocksåanvändas för att undersöka den termiska aggregationen av AICD 4. Slutligen öppnas möjligheten att undersöka direkt in vitro förmågan hos renade molekylära chaperoner, såsom ubiquilin-1 4, för att förhindra den termiska aggregationen av AICD dörren för att belysa den funktionella rollen av andra cytosoliska chaperoner vid modulering APP biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Hui Zheng (Baylor College of Medicine) för APP cDNA. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), John Sealy Memorial Kapitalförsäkringar fonden för biomedicinsk forskning (AFO) samt Jean C. och William D. Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB är en lärd i translationell forskning Scholar Program och medlem av University of Texas Medical Branch Claude E. Pepper äldre amerikaner Independence Center (med stöd av NIH bidrag UL1RR029876 och P30-AG-024.832, respektive).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
- De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
- Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein. BMB reports. 43, 656-663 (2010).
- McLoughlin, D. M., Miller, C. C. The FE65 proteins and Alzheimer's disease. J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).
- Stieren, E. S. Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).
- Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR. J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).
- Ramelot, T. A., Gentile, L. N. Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors. Biochem. 39, 2714-2725 (2000).
- Radzimanowski, J. Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2. EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).
- Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis. Gene. 475, 1-9 (2011).
- von Rotz, R. C. The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor. J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).
- Hamid, R. Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content. J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).
- Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation. PLoS ONE. 5, e11866 (2010).
- Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. Detection of APP intracellular domain in brain tissue. Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).
- Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).
- Hansma, H. G. Recent advances in atomic force microscopy of DNA. Scanning. 15, 296-299 (1993).
- Valbuena, A. Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).
- Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).
- Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).
- Kim, M. Y. Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk. J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).
- Lazarov, O. Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited. J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).
- Kakuda, N. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).
- Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. Amyloid under the atomic force microscope. Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).
