APP胞内结构域(AICD)用于大规模纯化的方法,进行说明。我们也将介绍的方法来诱导<em在体外</emAICD聚合和原子力显微镜的可视化。所描述的方法是有用的生化/结构表征AICD和聚集在其分子伴侣的影响。
淀粉样前体蛋白(APP)是与阿尔茨海默氏病(AD)的发病机制相关联的I型跨膜蛋白。 APP是其特征在于由一个大的胞外结构域和一个短的胞质域称为APP胞内结构域(AICD)。在成熟过程中通过分泌途径,APP可以由蛋白酶被称为α,β,和γ-分泌1裂解。顺序的蛋白水解切割APP的β和γ-分泌导致一个小的蛋白水解肽,称为Aβ是淀粉样蛋白形成和老年斑的核心成分的生产。 AICD是从膜中解放出来后分泌处理,并通过FE65和TIP60的相互作用,可转位到细胞核内参与多个靶基因的转录调节2,3。蛋白质 – 蛋白质相互作用的AICD可能会影响贩运,加工,细胞功能的全息APP和C-termin人的片段。最近,我们已经表明,AICD可以聚集在体外 ,而这个过程被抑制的AD-牵连分子伴侣ubiquilin的,1 4。与这些结果一致,AICD暴露出疏水区,并有内在的紊乱体外 5,6,但它获得稳定的二级结构时,势必FE65 7。我们已经提出,ubiquilin-1防止AICD不适当间和分子内相互作用,防止聚集在体外和在完整细胞4。虽然大多数研究专注于APP在AD的发病机制中的作用,AICD在这个过程中的作用目前尚不清楚的。已被证明的表达AICD诱导细胞凋亡8,调制信号通路9,调节钙信号10。 AICD和FE65过度表达的转基因小鼠模型中诱导阿尔茨海默氏症样病变11日 ,并于最近AICD中发现了胸罩在裂解液免疫印迹当使用合适的抗原修复技术12。为了方便的AICD的结构,生化和生物物理研究,我们开发了一个程序,以重组产生大量的高纯度AICD蛋白。我们进一步对诱导在体外热聚集,的AICD并分析利用原子力显微镜的描述方法。描述的方法是有用的生物化学,生物物理与结构表征,AICD的影响AICD聚集的分子伴侣。
在这个协议中,我们提出的结构,生物物理和生物化学分析,获得高纯度的AICD的程序。此过程不需要复杂的色谱仪,因此大多数实验室访问。其他团体纯化的AICD 5-7,16,包括GST-AICD 17日至19日 ,生化/结构的分析。到先前的协议的缺点包括AICD 16的溶解性差,小于理想纯度17,和尺寸排阻16的要求,或反相色谱法6,20。因此,这里所描述的协议,极大地?…
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢郑晖博士(美国贝勒医学院)的APP基因。这个工作是由美国国立卫生研究院资助R21AG031948(DB,JMB),F30AG030878(ESS),R01DK073394(AFO),约翰·西利纪念基金会生物医学研究基金(AFO),并在Jean C.和威廉·D·威利斯神经研究基金(ESS)。 ,JMB是一个学者的翻译研究学者项目和大学的德克萨斯州医学科克劳德·E.辣椒年长美国人独立中心的成员(由美国国立卫生研究院资助UL1RR029876和P30-AG-024832,分别支持)。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |