組換え体からコレステロール結合毒素ストレプトリジンOの精製方法<em> E大腸菌の</em真核細胞を生きるためにバインド毒素の>と可視化が記載されている。毒素の局所送達は、毒素の生物学の新たな側面を明らかに標的細胞における迅速かつ複雑な変化を誘導する。
細菌毒素は、細胞内容物と外部環境からの物質の流入の漏洩を可能に孔を形成し、膜中のコレステロールと結合する。セルは、アクティブ膜修復プロセスを必要とするこの侮辱から回復、または他の毒素曝露や細胞タイプ1の量に応じて、死ぬことができます。さらに、これらの毒素は、炎症性サイトカインの配列2を産生するマクロファージなどの免疫細胞の活性化を介して感染したホスト内の強い炎症反応を誘導する。多くのグラム陽性菌は、主に特徴づけられていないメカニズムを介してそれらの病原性に寄与することが示されているコレステロール結合毒素を産生する。
これらの毒素に曝露した細胞の形質膜における形態学的変化は本質的な細胞防御を示唆し、細胞外空間に流すことができ、コレステロールに富んだ表面突起、に彼らの隔離を含む機構3,4。このプロセスは、代謝活性の不在下で、すべてのセルで発生し、化学的固定4の後にEMを使用して可視化することができる。そのような毒素曝露に応答して炎症を媒介マクロファージなどの免疫細胞は、誘導される膜小胞はIL-1ファミリーのサイトカインを含むことが示唆されており、毒素を流し、これらの炎症性サイトカイン5,6,7を広めるための両方の責任があるかもしれません。両方とも8カスパーゼ1依存プロセスであるとして、IL-1β放出および細胞死の特定の種類の間にリンクと呼ばれるpyroptosisが、示唆されている。膜小胞の毒素結合、脱粒、サイトカイン放出、および潜在的に細胞死を含むこのマクロファージ応答の複雑さを整理するために、我々には、毒素 – 細胞間の相互作用のリアルタイム可視化を可能にラベリング手法や蛍光顕微鏡法を開発した機能不全と死の測定( 図1)。使用ライブセルイメージングの他の技術の制限のために必要です。フローサイトメトリーは、個々の細胞の高分解能、リアルタイム可視化を提供していないながら、生化学的アプローチは、個々の細胞で発生する効果を解決することはできません。ここで説明する方法は、細胞内の複雑な表現型の変化を伴うその他の刺激によって誘導される応答の動態解析に適用することができます。
技術は細菌毒素に対する免疫細胞の反応の検査を可能にする、ここで説明。最も重要なステップは、毒素の取り扱いと投薬です。毒素活性はさらにそのもろさのために、同じ製剤の異なるアリコートの間、非常に可変にすることができます。これは、いずれかの基準セルラインや赤血球に対する毒素の各アリコートをテストする、または毒素のグラデーションを使用する必要が生じて。毒素?…
The authors have nothing to disclose.
著者は、技術支援のSLOプラスミドとジョナサンフランクスの寛大な贈り物のためにanthrolysin O、マイケルCaparonの寛大な贈り物をリチャードレストに感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成T32CA82084(PAK)とR01AI072083(RDS)によって賄われていた。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | ||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |||||||||||||||||||
polymixin-agarose | Sigma | P1411-5ML | |||||||||||||||||||
Zeba Desalt Spin col | Fisher | PI-89891 | |||||||||||||||||||
sheep RBCs | Fisher | 50-415-688 | |||||||||||||||||||
pBADgIII-SLO | N/A | N/A | see ref9 | ||||||||||||||||||
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | |||||||||||||||||||
Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |||||||||||||||||||
Calcein AM/ Ethidium homodimer | Life Technologies | L3224 | |||||||||||||||||||
Anti-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |||||||||||||||||||
collagen-coated glass-bottom dish | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |||||||||||||||||||
femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |||||||||||||||||||
Microloader | Fisher | E5242956003 | |||||||||||||||||||
dextran Alexa 555 | Life Technologies | D34679 | |||||||||||||||||||
Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |||||||||||||||||||
FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |||||||||||||||||||
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed. |
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Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed. |