라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

Summary

재조합에서 콜레스테롤 바인딩 독소 streptolysin O를 정화하기위한 방법

Abstract

세균 독소는 세포 내용과 외부 환경으로부터 물질의 유입을 누설 할 수 있도록 모공을 형성 세포막에 콜레스테롤에 바인딩. 셀은 운영 중 막 복구 프로세스가 필요합니다이 모욕, 복구, 또는 다른 독소 노출과 셀 타입 ^1의 양에 따라 죽을 수 있습니다. 또한 이러한 독소는 프로 염증성 크린 시토 킨 ² 배열을 생산 식세포 등의 면역 세포의 활성화를 통해 감염된 호스트에 강한 염증 반응을 유도. 대부분의 그람 양성 세균은 대부분 uncharacterized 메커니즘을 통해 독성에 기여하는 표시되었습니다 콜레스테롤 구속력이 독소를 생성합니다.

이러한 독소에 노출 세포의 플라즈마 막에 Morphologic 변화는 본질적인 세포 방어를 제안, 세포 공간으로 발산 할 수 있습니다 콜레스테롤 강화 표면 돌기들에 대한 자신의 격리를 포함메커니즘 ^3,4. 이 과정은 신진 대사 활동의 부재에있는 모든 세포에서 발생, 화학 고정 ⁽⁴⁾ 후 EM을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 이러한 독소 노출에 대한 응답으로 염증을 중재 대 식세포와 같은 면역 세포에서 유도 막 소포는 IL-1 가족의 크린 시토 킨를 포함하도록 제안하고 독소를 흘리는 이러한 프로 염증성 크린 시토 킨 ^5,6,7을 전파 모두에 책임이있을 수 있습니다. 모두 ⁸ caspase-1에 의존 프로세스입니다으로 IL-1β 자료 및 세포 죽음의 특정 유형 사이의 링크를 칭했다 pyroptosis이 제안되었습니다. 막 소포의 독소 바인딩, 개구, 시토 킨 릴리스, 그리고 잠재적으로 세포 사망을 포함이 대 식세포 반응의 복잡성을 해결하기 위해, 우리는 다음과 같은 독소 세포의 상호 작용 실시간으로 시각화 할 수 있도록 라벨 기술과 형광 현미경 방법을 개발 장애와 죽음의 측정 (그림 1). 사용라이브 셀 이미징의 다른 기술의 한계로 인해이 필요합니다. 유동 세포 계측법은 개별 세포의 고해상도, 실시간 시각화를 제공하지 않습니다 동안 생화학 접근 방법은 개별 셀에서 발생하는 효과를 확인할 수 없습니다. 여기에 설명 된 방법은 세포에서 복잡한 phenotypic 변화를 포함하는 다른 자극에 의​​해 유도 반응의 운동 분석에 적용 할 수 있습니다.

Protocol

1. Streptolysin O의 정화 (SLO)

1. 0.5 L의 LB의 국물에 플라스미드 pBADgIII-SLOhis ⁹ 포함 BL21 GOLD 세포의 20 ML 밤 문화의 예방 500 μl 50 MG / ML 암피실린을 추가합니다. 37 ° C에서 225 rpm으로 문화를 흔들어 OD _600까지 = 0.6은, 보통 1.5 시간을 ~. 10,000 5 분 XG에서 1 ML 박테리아를 (T _0으로 간주) 원심 분리기, 140 μl 1X SDS 샘플 버퍼 / 1 OD에서 펠렛을 분해하고 단백질 순도 분석에 전단 DNA에 sonicate.
2. 문화 5 ML 20 % arabinose의 추가와 박테리아를 유도, 3 시간에 대한 온도는 실온에서 225 rpm으로 흔들. 박테리아의 1 ML를 수집 원심 분리기 등 위의 순도 분석을위한 T ₃ 번 지점에 대한 1X SDS 샘플 버퍼에 용해.
3. 500 ML의 원심 분리기 병에 남아있는 세균을 수집, 4 ° C (8,500 RPM Sorvall GS-3 회)에서 12 분에 12,000 XG를 돌리다. -80에서 표면에 뜨는, 저장 펠릿을 가만히 따르다 필요한 경우 더 이상 ° C 하룻밤 나.
4. FR을 Resuspend10 ML 얼음 속에서 ozen 펠릿은 Lyse / 버퍼를 씻어 (50 MM 아니 ₂ PO _4, 300 MM NaCl, 10 MM 이미 다졸, 산도 8.0) 400 μl 25% 튼 X-100, 100 μl 100 MG / ML 라이소자임, 50과 보충 μl 200 밀리미터 phenylmethylsulfonyl 플루오르 화 (PMSF). 50 ML 오크 릿지 관에 resuspended 펠릿을 전송합니다.
5. 30 초 간격으로 얼음에 30 초에 5 번 lysate Sonicate. 스핀은 4 ° C (18,000 RPM Sorvall SS-34 회)에서 20 분에 39,000 XG에서 오크 리지 관 lysate를 sonicated.
6. lysate가 회전하는 동안 Lyse / 4에서 5 분 동안 1,200 rpm으로 버퍼와 스핀을 씻으 ° 10 ML 1 개 ML 니켈 NTA 아가로 오스를 씻어 C. (모든 자세한 세차 / elutions이 상황에서 원심 분리를 사용하여). 세탁을 대기음.
7. 단계 1.5에서 니켈 NTA 아가로 오스에 박테리아 표면에 뜨는을 추가, 4에서 2.5 시간에 부드럽게 흔들 ° C. 표면에 뜨는 수집 봐. 10 μ 4X SDS 샘플 버퍼를 표면에 뜨는 30 μl을 결합하고 순도 분석에 저장합니다. 버퍼를 Lyse / 쉐이브와의 구슬 4 번 씻으십시오트리스 / 소금 버퍼 (50 MM 트리스, 300 MM NaCl, 산도 8.0)에 CE.
8. , 구슬에 1 ML의 용출 버퍼 (트리스 / 소금 버퍼 250 MM 이미 다졸) 5 μl 1 M dithiothreitol (DTT)을 추가 10 분 동안 얼음에 잠복기, 회전하고 표면에 뜨는를 수집하여 3 회를 Elute. SLO는 매우 산화 환원에 민감한 단백질이며, 항상 얼음에 보관해야합니다. 심지어 짧은 기간 동안, 37 ° C로 예열하면 일단 감소, 단백질이 빠른 속도로 그 활동을 잃게됩니다.
9. 4에 1 분에 10,000 XG에서 용출 버퍼, 스핀에 500 μl polymixin - 복합 아가로 오스을 씻으 500 μl의 ° C와 resuspend. 독소를 고갈하려면 각 용출에 200 μl 구슬을 추가하고 30 분에 대해 4 ° C를 흔들. 1 4의 분 ° C, 그리고 표면에 뜨는을 저장 10,000 XG에 스핀. SDS-PAGE 분석을위한 10 μl 4X SDS 샘플 버퍼 각 용출의 30 μl 조화를 이루고 있습니다.
10. SDS-PAGE에 의해 elutions의 순수성을 테스트합니다. 종기 샘플 10 % 젤에 5 분 및로드 10 μl에 95 ° C에서 젤 분석에 저장되었습니다. GE를 얼룩단백질을 시각화 할 수 Coomassie 함께하는 (그림 2A). SLO 69 kDa입니다. (일반 수율은 4 MG / 처음 두 elutions에 ML이지만, 박테리아 스트레인과 플라스미드가 사용에 따라 다를 수 있습니다) 단백질 농도를 결정하기 위해 브래드 포드 분석을 수행합니다.
11. 각 용출의 용혈성 활동 (아래)를 테스트합니다. 순도, 집중력 및 용혈성 활동이 만족 풀 elutions. 단일 사용 aliquots (일반적으로 5-10 μl)에 나누어지는의 SLO는 -80에서 드라이 아이스 및 매장 ° C.에 고정

2. 용혈성 분석

1. RBC 분석 완충액 (0.3 % 소 혈청 알부민 (BSA), 2 MM CaCl _2, 10 밀리미터 Hepes, 산도 7.4), 5 분에 1,200 rpm으로 회전에 양 적혈구 (적혈구)을 씻어, 그리고 2.5 %의 적혈구시에 resuspend 10 ML RBC 분석 버퍼.
2. / 잘 얼음에 96도 V-바닥 판에 10 μl RBC 분석 버퍼를 추가합니다. 순차적으로 중복 된 각 용출을 희석. 일반적인 희석 범위는 1:1,000으로 1:512,000 있습니다. 10을 더 독소가있는 3 개의 우물과 3 우물을 포함μl 2% 튼 각각 최소 및 최대 우물과 같은 X-100,.
3. 37 플레이트 및 배양을 맡아 ° C 30 분. 5 분에 1,200 rpm으로 원심 분리기. 평면 바닥 96 잘 판에 표면에 뜨는의 70 μl를 전송합니다. _{405 번을} 읽어 보시기 바랍니다. 한 단위는 적혈구의 50 % 용해에 필요한 독소의 희석입니다. 독소 활동은 1 단위 * 희석 factor/0.01 ML입니다.

3. 셀 Lytic 분석

1. 수확 세포, 수, 스핀. 2x10에 Resuspend 버퍼에 ⁶ / ML R / B (2 MM과 RPMI CaCl _2, 0.5 % BSA) 및 20 μg / ML의 propidium의 요오드화물. 96 - 웰 V-바닥 판에 100 μl 세포를 추가합니다.
2. 직렬 셀에 100 μl 독소 또는 100 μl 버퍼 R / B을 추가, 버퍼 R / B에 최종 농도를 2 배에 SLO를 희석. 배양 5 분 37 ° C. U / ML 2000에서 31.25 U / ML에 일반적인 최종 농도 범위.
3. 흐름 cytometer에 세포를 실행하고 phycoerythrin (PE)에 대한 필터 데이터를 수집합니다. 한 로그 근무 transiently permeabilized cel을 나타냅니다이게 3 로그 근무 시간이 죽은 세포에게 ⁴ 나타내며. 다음과 같이 실험 (% PI ^높은 _EXP)에서 컨트롤에 죽은 세포의 비율 (% PI ^높은 _CTL)을 차감하여 세포의 특정 용해를 계산 : 특정 용해 = (% PI ^높은 _EXP - % PI ^높은 _CTL) / (100 - % PI ^높은 _CTL) * 100

4. 문화 요리의 세포에 독소의 인도를 Micropipette

1. 콜라겐 - 코팅 유리 하단 35mm 요리에 대한 실험 판 2x10 ⁵ 대 식세포하기 전에 어느 날.
2. 현미경과 microinjector를 켜십시오. 온수 무대 시간이 37 ° C.에 따뜻하게 할 수 있도록 허용 현미경의 선택은 일반적으로 로컬 사용할 수 있습니다 무엇 이냐에 따라 달라집니다. 현미경은 37 요리를 가열의 단계 수, 역 단계가 필요 ° C, 선택한 염료, 그리고 물리적 microinjector을 연결하는 공간에 적합한 여기 / 방출 필터 큐브. 버트 란드 렌즈microinjection에 도움이되지만 필요하지 않습니다. 현미경을 유도하는 컴퓨터가 데이터를 수집하고 저장할 충분한 메모리가 필요합니다.
3. 37 번 염색과 30 분에 라벨 세포 ° C. 검정에 따라 라벨은 5 μl Fura2 1 ML 전체 미디어에서 오전 1 ML PBS 또는 2 μl calcein에서 오전 짓을 할 수 있습니다. Fura2를 들어, 여기 / 방출은 510분의 340 나노 미터와 510분의 380 nm의에 대한 수집 및 380분의 340 신호의 비율은 칼슘 유량을 결정합니다. ethidium homodimer는 620분의 525 nm의이며, APC는 660분의 650 nm의 상태에서 calcein를 들어, 여기 / 방출은 515분의 495 nm의 것입니다. 다른 레이블도 선택 될 수있다.
4. 한 ML RPMI에서 PBS와 장소가있는 세포를 씻어은 2 MM CaCl ₂ 보충. 현미경에 장착합니다.
5. 4 ° C.에 20,000 XG 10 분에 독소와 dextran 물에, 그리고 원심 분리기를 희석 일반적으로, 1 μl SLO과 4 μl 10 MG / ML dextran-555은 6 μl 물에 희석되어 있습니다. Dextran 또는 다른 형광 유체 상 분자는 펨토 - 끝이 막힌되어 있지 않은지 확인하는 데 사용하고, 인제합니다CTS는 원하는.
6. microloader를 사용하여 희석 독소 0.07 μl와 함께 후방에서 펨토 - 팁을로드합니다.
7. microinjector에 펨토 - 팁을로드합니다. 팁은 모든 방향으로 이동하는 방 세포의 중심을 통해 앉아 있도록 주입기의 각도를 조정합니다. Z-제한을 해제합니다. 사출 설정은 20 PSI 백 압력 120 PSI에 0.5 초에 주입해야합니다. 이 매체를 입력 할 때까지 팁을 낮 춥니 다.
8. 버트 란드 렌즈, 센터에게 팁을 사용하고이 가까운 셀 인하되기 때문에 팁을 따르십시오. 일단 초점을 잃어, 일반 광학으로 전환합니다. 바늘의 그림자가 필드에 분명해야합니다. 셀 위에 집중하고 초점이 될 때까지 바늘을 낮 춥니 다. 세포에 다시 초점을주의 깊게 셀에 인접한 바늘을 가져. 분사에 대한 Z-한도를 설정합니다. 원하는 위치로 팁을 이동 영상을 개시 원하는 시점에서 독소를 출시 할 주입. 바늘을 올려, 세포의 새로운 영역으로 이동 주입. 모든 원치 않는을 방지하기 위해 홈 위치로 바늘을 이동바늘의 독소 누출.

Representative Results

일반적으로 10 ⁷ -10 ⁸ U / ML SLO은 4 MG / ML의 단백질 농도를 구할 수 있습니다. 세포 용해에 필요한 독소의 양이 세포 유형에 따라 다르며, 보통 125-500 U / ML SLO (그림 2B)입니다. 다른 사람들이 (특히 T 세포 라인) 더 민감하지만 식세포와 같은 세포 유형 (4,000 U / ML) 더 내성이 될 수 있습니다. 이러한 민감한 상업적으로 사용할 수 SLO와 일치합니다. 독소 활동은 독소의 각 배치 또는 해동을 잘 용혈성 assays는 독소의 활동을 확인하기 위해 필요하며, 약 2 배 각 냉동 해동으로 줄어 듭니다. 단백질과 함께 작업 할 때 독소는 또한 콜레스테롤 함유 멤브레인의 부재에서의 열 및 산화 ¹⁰ 매우 민감하므로주의가되어야합니다.

독소 Microdelivery 같은 음식에서 독소 처리 된 셀과 치료 세포의 비교를 할 수 있습니다. 확산 기울기가 estab 수 있기 때문에 또한, 독소 활동에 내부 제어를 제공합니다micropipette 팁에서 lished. 멀리 끝에서 지역이 더 손상 (그림 3) 표시되지 않습니다 반면, 가까운 micropipette으로 지역 셀 죽음을 보여줍니다, calcein 손실 및 ethidium의 homodimer의 이해에 의해 typified. 끝이 분야 (그림 3)을 따라 이동로 사용 독소의 효력을 감안할 때, 심지어 다시 압력의 존재에 micropipette에서 누출 작은 금액은 세포를 파괴 할 수 있습니다. microinjector에 안전 옵션을 사용하면이 손실을 방지 할 수 있습니다.

독소 Microdelivery 또한 ​​칼슘 유량 등의 실시간 이벤트 (그림 4)의 시험을 할 수 있습니다. 이 플럭스는 고정 된 세포에서 관찰하고, 독소의 언어 전달이 유도 칼슘 유량은 세포 배양을 통해 전파하는 방법을 연구를 허용 할 수 없습니다. 이 또한 칼슘 자속 ^11을 일으킬 수로 케어는, micropipette 자체로 세포를 손상하지 않도록해야합니다.

게다가표준 폭 넓은 분야 현미경으로, microdelivery는 고속 3D 공 촛점 현미경과 결합 할 수 있습니다. 폭 넓은 분야에 걸쳐 공 촛점 현미경의 장점은 Z-차원의 이벤트를 해결하고 개인 비행기를 분석 할 수있는 능력입니다. 현재 기술로 회전하는 디스크 공 촛점의 사용은 필요한 높은 속도를 달성 할 필요가 있습니다. 이러한 장점은 독소 주입 (그림 5)에 따라 수지상 세포로부터 발산되는 미세 입자의 시각화 할 수 있습니다. 이러한 미세 입자는 세포 복구 과정 ^(4)의 일환으로 창고되어 있습니다. 독소 분자는 독소 ⁴ 제거하기 위해 창고 blebs에 집중되어있다. 공 촛점 이미징없이 미세 입자를 감지하는 것은 어려울 수 있으며, 잠재적으로 독소는 이러한 방식으로 제거되지 않는다는 결론으로​​ 이어질 것입니다.

그림 1. 전체라이브 셀 이미징에 독소를 생성하고 활용을위한 워크 플로우. 독소는 엄격한 품질 관리를 받게, 정화 후 이전에 표면 단백질에 생존 염료, 칼슘 표시기 또는 항체로 분류되었습니다 셀에 micropipette를 통해 전달됩니다. 데이터는 현미경을 취득하고 그런 다음 Metamorph 나 요소와 같은 소프트웨어를 사용하여 분석하고 있습니다.

그림 2. 정화 SLO의 품질 관리. (A) 박테리아의 샘플 전에 (T _0)과 이후 (T ₃₎ 독소 유도, 표면에 뜨는 다음 정화 (S), 3 elutions (E _{1-E 3)} 각 Coomassie 파란색으로 SDS-PAGE와 스테인드에 의해 해결되었다 . (B) 어느 수지상 세포 라인 D2 또는 백혈병 세포 라인 T27A는 propidium 요오드화물의 면전에서 37 ° C에서 5 분에 대한 SLO의 다양한 농도로 도전하고 있었다유동 세포 계측법에 의해 살펴 보았다. - / (100 - % PI ^높은 _CTL) * 100 특정 용해 = (% PI ^높은 _CTL % PI ^높은 _EXP) : 특정 용해는 다음과 같은 공식에 의해 결정되었다

그림 3. calcein 신호와 세균 독소 anthrolysin O.의 섬유 아세포에 지역화 된 노출에 따라 인간의 피부 섬유 아세포의 EtBr의 이해의 손실에 의해 표시된 셀 죽음이 생명 기술에서 라이브 죽은 키트를 사용 calcein AM과 ethidium homodimer와 incubated되었습니다. 콜레스테롤 바인딩 독소 anthrolysin O ¹³ (박사 리처드 휴식, Drexel 대학에서 선물)의 100 PG는 배양 접시의 중심에 micropipette으로 전달하고, widefield 형광 이미지는 30 분 후에 40x 목표를 사용하여 수집되었습니다. 여러 분야의 이미지는 메트로폴리스를 사용하여 표시된 큰 이미지를 생성하기 위해 결합했다amorph.

그림 4. 세균 독소의 SLO에 노출 인간의 수지상 세포의 세포 기질에 칼슘 유입. 셀은 오전 fura2을 탑재 한 80 U / μl 1 NL / 분의 유량의 농도에서 SLO의 솔루션을 제공하기 전에. 전송에 사용되는 micropipette의 끝은 노란색 별표하여 시간 0 표시됩니다. 이미지는 340과 380 나노 미터 여기 파장에서 widefield 모드에서 지속적으로 수집하고, cytosolic 칼슘 수준을 결정하는 데 사용 배출량의 비율되었다. 녹색에서 청색 pseudocolor에 변화가 cytosolic 칼슘 수준의 증가를 나타냅니다. 각 패널의 시간 표시는 독소의 추가를 시작 한 후 초를 나타냅니다. 스케일 바는 20 μm이다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 5. SLO에 노출 수지상 세포의 표면에서 microvesicles의 해제. 세포는 SLO의 3x10 ^-3 U의 bolus의 전달에 이어 플라즈마 막을 라벨을 APC에 방지 CD11c 복합으로 미리 incubated되었습니다. 3 차원 reconstructions은 분에 표시된 각각의 시점에서 수집 된 공 촛점 Z-스택에서 생성되었습니다. microinjector의 끝은 DIC 이미지를 사용하여 확인을하고 노란색 화살표로 표시됩니다. 스케일 바는 20 μm이다.

Discussion

기술은 박테리아 독소에 대한 면역 세포의 반응을 시험 할 수 여기에 설명했다. 가장 중요한 단계는 독소의 처리와 주입합니다. 독소 활동도의 취약성으로 인해 같은 준비의 다른 aliquots 사이에 매우 변수가 될 수 있습니다. 이 중 참조 셀 라인 또는 적혈구에 대한 독소의 각 나누어지는을 테스트하거나 독소의 그라디언트를 사용하여 필요로. 독소 그라디언트는 등 micropipette에 의해 전달, 실시간으로 관찰 할 독소 유발 활동의 전체 스펙트럼을 수 있지만, 생화학 분석 자체를 빌려하지 않습니다.

독소 Micropipette 배달 도전 할 수 있습니다. 표준 microinjection는 달리, 그러나, 세포의 침투는이 분석을 위해 필요하지 않습니다. 사실,주의가이 비슷한 막 수리 응답 ¹² 유도하므로, 바늘 자체로 세포를 손상하지 않도록해야합니다. 면역 세포에서 특히 칼슘 fluxes는에 의해 생성 된바늘 접촉 문화 ¹¹ 내의 다른 세포에 나노 튜브를 통해 전달됩니다. 주사하지 않았 세포는 또한 바늘의 수명을 연장합니다. 마찬가지로, 셀에 바늘의 하강을 따라 버트 란드 렌즈의 사용은 micropipette의 위치에서 일부 불확실성을 제거합니다. 손상된 바늘은 그대로 바늘보다 더 빠르게 독소를 누출 않지만, 그들은 여전히​​ 예비 결과를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. microinjector 시스템은 여러 주사에 대해 높은 독소 기울기가 원하는해야 할 수 있습니다. 또한, 분사 지속 시간도 전달 복용량을 변경 수정할 수 있습니다. microinjector는 또한 여러 실험을 한 접시 내에서 수행 할 수 있습니다. 또한, rechallenge의 효과를 연구 할 수 있습니다. 우리가 면역 세포를 검사 실험을 설명하지만,이 방법은뿐만 아니라 다른 세포 라인에 적용 할 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.