La visualización de las respuestas inducidas por toxinas bacterianas mediante microscopía de fluorescencia de células en vivo

Summary

Los métodos para purificar el colesterol unión toxina estreptolisina O de recombinante<em> E. coli</em> Y la visualización de la unión de la toxina a vivir las células eucariotas se describen. Entrega localizada de la toxina induce cambios rápidos y complejos en células específicas que revelan nuevos aspectos de la biología de la toxina.

Abstract

Las toxinas bacterianas se unen al colesterol en las membranas, la formación de poros que permiten la fuga del contenido celular y el flujo de los materiales desde el entorno externo. La célula o bien puede recuperarse de este insulto, que requiere procesos activos de reparación de la membrana, o morir en función de la cantidad de exposición a la toxina y tipo de célula ^1. Además, estas toxinas inducir fuertes respuestas inflamatorias en los huéspedes infectados a través de la activación de células inmunes, incluyendo los macrófagos, que producen una variedad de citoquinas pro-inflamatorias ^2. Muchas bacterias Gram positivas producir colesterol toxinas vinculantes que se ha demostrado que contribuyen a su virulencia a través de mecanismos en gran medida no caracterizadas.

Cambios morfológicos en la membrana plasmática de las células expuestas a estas toxinas incluyen su secuestro en salientes superficiales enriquecidos en colesterol, que puede liberarse en el espacio extracelular, lo que sugiere una defensa celular intrínsecamecanismo de ^3,4. Este proceso se produce en todas las células en ausencia de actividad metabólica, y puede ser visualizado usando EM después de ⁴ fijación química. En las células inmunes, tales como macrófagos, que median la inflamación en respuesta a la exposición a la toxina, inducidos vesículas de membrana se sugieren para contener las citoquinas de la familia IL-1 y puede ser responsable tanto por derramar la toxina y la difusión de estas citoquinas pro-inflamatorias ^5,6,7. Un enlace entre la IL-1β de liberación y un tipo específico de la muerte celular, denominado pyroptosis ha sugerido, ya que ambos son procesos que dependen de la caspasa-1 ^8. Para resolver la complejidad de esta respuesta de los macrófagos, que incluye la unión toxina, el desprendimiento de las vesículas de membrana, la liberación de citoquinas, y la muerte potencialmente celular, se han desarrollado técnicas de etiquetado y los métodos de microscopía de fluorescencia que permiten la visualización en tiempo real de las interacciones célula-toxina, incluyendo mediciones de la disfunción y la muerte (Figura 1). Utilizarde imágenes de células vivas es necesario debido a las limitaciones en otras técnicas. Enfoques bioquímicos no puede resolver los efectos que ocurren en células individuales, mientras que la citometría de flujo no ofrece alta resolución, en tiempo real la visualización de células individuales. Los métodos descritos aquí se pueden aplicar a análisis de la cinética de las respuestas inducidas por otros estímulos que implican complejos cambios fenotípicos en las células.

Protocol

1. Purificación de la estreptolisina O (SLO) Inocular 20 ml de cultivo durante la noche de células BL21 oro que contenía el plásmido pBADgIII SLOhis-9 en caldo LB 0,5 L y añadir 500 l 50 mg / ml de ampicilina. Agitar cultivo a 225 rpm a 37 ° C hasta OD 600 = 0,6, normalmente ~ 1,5 h. Centrifugar 1 ml de bacterias (considerados T 0) a 10.000 xg 5 min, se disuelve el pellet en 140 l 1x tampón de muestra de SDS / OD 1 y sonicado para ADN de cizallamiento para el análisis …

Representative Results

Típicamente 10 7 -10 8 U / ml SLO puede obtenerse con una concentración de proteína de 4 mg / ml. La cantidad de toxina requerida para la lisis celular varía según el tipo de célula, pero generalmente es 125-500 U / ml SLO (Figura 2B). Tipos de células como los macrófagos pueden ser más resistentes (4000 U / ml), aunque otros (especialmente líneas celulares T) son más sensibles. Estas sensibilidades corresponden con SLO disponible comercialmente. Actividad de la toxina d…

Discussion

Las técnicas aquí descritas permiten el examen de las respuestas de las células inmunes a las toxinas bacterianas. El paso más crítico es el manejo y la dosificación de la toxina. Actividad de la toxina puede ser muy variables, incluso entre diferentes alícuotas de la misma preparación, debido a su fragilidad. Esto requiere ya sea probando cada parte alícuota de toxina contra una línea celular de referencia o glóbulos rojos o el uso de gradientes de toxina. Gradientes de toxina, como entregado por micropipeta…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
			Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
			Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.