Методы очистки холестерина обязательного токсина стрептолизин O из рекомбинантных<em> E. палочки</em> И визуализации связывания токсинов жить эукариотических клеток описаны. Локализованные доставки токсин вызывает быстрые и сложные изменения в целевые клетки раскрывая новые аспекты токсина биологии.
Бактериальные токсины связываются с холестерином в мембране, образуя поры, которые позволяют утечка клеточного содержимого и притоком материалов из внешней среды. Клетка может либо выйти из этой оскорбление, которое требует активных процессов ремонта мембран, либо умирают в зависимости от количества воздействия токсинов и клетки 1-го типа. Кроме того, эти токсины вызывают сильную воспалительную реакцию в зараженных хостов через активацию иммунных клеток, включая макрофаги, которые производят множество провоспалительных цитокинов 2. Многие грамположительных бактерий производить холестерин обязательным токсины, которые, как было показано, способствует их вирулентность в значительной степени через неохарактеризованных механизмов.
Морфологические изменения в плазматической мембране клетки подвергаются воздействию этих токсинов включают их поглощение холестерина в обогащенной поверхности выступов, которые могут быть пролита в межклеточное пространство, что предполагает внутреннюю клеточную защитуМеханизм 3,4. Этот процесс происходит во всех клетках в отсутствие метаболической активностью и могут быть визуализированы с помощью EM после химической 4 фиксации. В иммунных клеток, таких как макрофаги, которые опосредуют воспаление в ответ на воздействие токсинов, индуцированные мембранных везикул предложили, чтобы содержать цитокины IL-1 семья и может быть ответственность как за сброс токсинов и распространения этих провоспалительных цитокинов 5,6,7. Связь между IL-1β выпуска и определенный тип гибели клеток, называемых pyroptosis была предложена, так как являются каспазы-1 зависимых процессов 8. Чтобы разобраться в сложностях этого макрофагов ответ, который включает в себя токсины обязательным, упав на мембранных везикул, высвобождение цитокинов и, возможно, гибели клеток, мы разработали методы маркировки и флуоресцентной микроскопии, которые позволяют визуализации реального времени токсина межклеточных взаимодействий, в том числе Измерения дисфункции и смерти (рис. 1). Использоватьиз живых клеток необходимо в связи с ограничениями в других методов. Биохимические подходы не могут решить эффектов, происходящих в отдельных клетках, в то время проточной цитометрии не предлагает высокое разрешение, визуализации в реальном времени отдельных клеток. Методы, описанные здесь, могут быть применены к кинетического анализа ответов индуцированных другие стимулы включают в себя сложные фенотипические изменения в клетках.
Описанные здесь методы позволяют рассмотрении реакции иммунных клеток к бактериальным токсинам. Самым важным шагом является обработка и дозировки токсина. Токсин деятельности может быть чрезвычайно разнообразен, даже между различными аликвоты того же препарата, из-за его хрупкости. …
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Ричарда Отдых за щедрый дар anthrolysin O, Michael Caparon за щедрый дар SLO плазмиды и Джонатан франков для оказания технической помощи. Эта работа финансировалась грантами NIH T32CA82084 (ПАК), а R01AI072083 (RDS).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | ||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |||||||||||||||||||
polymixin-agarose | Sigma | P1411-5ML | |||||||||||||||||||
Zeba Desalt Spin col | Fisher | PI-89891 | |||||||||||||||||||
sheep RBCs | Fisher | 50-415-688 | |||||||||||||||||||
pBADgIII-SLO | N/A | N/A | see ref9 | ||||||||||||||||||
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | |||||||||||||||||||
Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |||||||||||||||||||
Calcein AM/ Ethidium homodimer | Life Technologies | L3224 | |||||||||||||||||||
Anti-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |||||||||||||||||||
collagen-coated glass-bottom dish | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |||||||||||||||||||
femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |||||||||||||||||||
Microloader | Fisher | E5242956003 | |||||||||||||||||||
dextran Alexa 555 | Life Technologies | D34679 | |||||||||||||||||||
Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |||||||||||||||||||
FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |||||||||||||||||||
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed. |
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed. |