Metoder för rening av kolesterol bindande toxinet streptolysin O från rekombinant<em> E. E. coli</em> Och visualisering av toxin bindning till levande eukaryota celler beskrivs. Lokaliserad leverans av toxin inducerar snabba och komplexa förändringar i målceller avslöjar nya aspekter av toxin biologi.
Bakteriella toxiner binder till kolesterol i membran, bildar porer som tillåter läckage av cellulära innehåll och inflöde av material från den yttre miljön. Cellen kan antingen återhämta sig från denna förolämpning, som kräver aktiva processer membran reparation, annars dör beroende på mängden av toxin exponering och celltyp 1. Dessutom är dessa toxiner inducera starka inflammatoriska svar i infekterade värdar genom aktivering av immunceller, inkluderande makrofager, som producerar en rad av proinflammatoriska cytokiner 2. Många grampositiva bakterier producerar kolesterol bindande toxiner som har visat sig bidra till deras virulens genom i stort sett okarakteriserade mekanismer.
Morfologiska förändringar i plasmamembranet hos celler som exponeras för dessa toxiner inkluderar sin sekvestrering i kolesterolrika yta utsprång, som kan utsöndras i det extracellulära utrymmet, vilket tyder på en inneboende cellulär försvarmekanismen 3,4. Denna process sker på alla celler i frånvaro av metabolisk aktivitet, och kan visualiseras med användning av EM efter kemisk fixering 4. I immunceller såsom makrofager som medierar inflammation som svar på toxin exponering induceras membranvesiklar föreslås innehålla cytokiner av IL-1-familjen och kan vara ansvarig både för att kasta toxin och sprida dessa proinflammatoriska cytokiner 5,6,7. En koppling mellan IL-1β utsläpp och en viss typ av celldöd, har kallas pyroptosis föreslagits, eftersom båda är kaspas-1 beroende processer 8. Att reda ut komplexiteten i denna makrofag svar, som inkluderar toxin bindande, utsöndring av membranvesiklar, cytokinfrisättning, och potentiellt celldöd, har vi utvecklat märkning tekniker och fluorescens metoder mikroskopi som möjliggör realtid visualisering av toxin-cell-interaktioner, inklusive mätningar av dysfunktion och död (figur 1). Användav levande cell imaging är nödvändigt på grund av begränsningar i andra tekniker. Biokemiska metoder kan inte lösa effekter som uppträder i enskilda celler, medan flödescytometri inte erbjuda hög upplösning, realtid visualisering av individuella celler. De metoder som beskrivs här kan tillämpas på kinetisk analys av svar som induceras av andra stimuli involverar komplexa fenotypiska förändringar i celler.
De tekniker som beskrivs här tillåta undersökning av svaren från immunceller till bakteriella toxiner. Det mest kritiska steget är hantering och dosering av toxinet. Toxinaktivitet kan vara extremt varierande, även mellan olika alikvoter av samma beredning, på grund av dess bräcklighet. Detta kräver antingen testa varje alikvot av toxin mot en referens cellinje eller RBC eller använda toxin gradienter. Toxin gradienter, som levereras av mikropipett, låt hela spektrumet av toxin-inducerade aktiviteter som skal…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Richard Rest for the generösa gåva anthrolysin O, Michael Caparon för generös gåva av SLO plasmid och Jonathon frankerna för tekniskt bistånd. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag T32CA82084 (PAK) och R01AI072083 (RDS).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | ||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |||||||||||||||||||
polymixin-agarose | Sigma | P1411-5ML | |||||||||||||||||||
Zeba Desalt Spin col | Fisher | PI-89891 | |||||||||||||||||||
sheep RBCs | Fisher | 50-415-688 | |||||||||||||||||||
pBADgIII-SLO | N/A | N/A | see ref9 | ||||||||||||||||||
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | |||||||||||||||||||
Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |||||||||||||||||||
Calcein AM/ Ethidium homodimer | Life Technologies | L3224 | |||||||||||||||||||
Anti-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |||||||||||||||||||
collagen-coated glass-bottom dish | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |||||||||||||||||||
femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |||||||||||||||||||
Microloader | Fisher | E5242956003 | |||||||||||||||||||
dextran Alexa 555 | Life Technologies | D34679 | |||||||||||||||||||
Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |||||||||||||||||||
FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |||||||||||||||||||
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed. |
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed. |