Anvendelsen af ​​primære humane fibroblaster til overvågning Mitochondriale fænotyper i Field af Parkinsons sygdom

Summary

Fibroblaster fra patienter med mutationer i Parkinsons sygdomsfremkaldende gener udgør en lettilgængelig

Abstract

Parkinsons sygdom (PD) er den næsthyppigste bevægelse uorden og påvirker 1% af mennesker over en alder af 60 ^1. Fordi aldring er den vigtigste risikofaktor, vil tilfælde af PD stige i løbet af de næste årtier ^2. Ved siden af patologisk proteinfoldning og værdiforringede protein nedbrydningsveje blev ændringer af mitokondriefunktionen og morfologi påpeget som yderligere kendetegnende for neurodegeneration i PD ^3-11.

Efter flere års forskning i murine og humane cancerceller som in vitro-modeller at dissekere molekylære veje for Parkinsonisme, er brugen af humane fibroblaster fra patienter og passende kontroller som ex vivo modeller blive et værdifuldt forskning værktøj, hvis potentielle forbehold tages i betragtning. Andre end udødeliggjorte, snarere kunstige cellemodeller, primære fibroblaster fra patienter, der transporterer sygdom-associerede mutationer tilsyneladende afspejler vigtige patologiske træk of den menneskelige sygdom.

Her har vi afgrænse procedure for at tage hudbiopsier, dyrkning af humane fibroblaster og bruge detaljerede protokoller for væsentlige mikroskopiske teknikker til at definere mitokondriske fænotyper. Disse blev anvendt til at undersøge forskellige træk forbundet med PD som er relevante for mitokondrie-funktion og dynamik. Ex vivo, kan mitokondrier analyseres med hensyn til deres funktion, morfologi, colokalisering med lysosomer (organellerne nedbrydning dysfunktionel mitokondrier) og nedbrydning via lysosomal omsætningsvej . Disse fænotyper er særdeles relevante for identifikationen af ​​tidlige tegn på PD og kan gå forud kliniske motoriske symptomer i humane sygdom-genbærere. Derfor kan assayene præsenteret her anvendes som værdifulde værktøjer til identifikation patologiske træk ved neurodegeneration og bidrager til at definere nye terapeutiske strategier i PD.

Protocol

1. Hudbiopsi og Dyrkning af humane fibroblaster

1. Den hudbiopsi skal tages af en erfaren læge. Proceduren foregår under sterile forhold og kræver lokalbedøvelse. Typiske steder, der anvendes til biopsi er den indvendige side af den øverste arm, skulder eller nederste del af ryggen.
2. Du kan tage 4x4mm eller 6x6mm diameter prøve af punch biopsi for at få nok væv til dyrkning af humane fibroblaster.
3. Skær hudbiopsi i lige små stykker under sterile betingelser for at adskille dem i 2-4 T25 kolber. Hver kolbe bør indeholde 2-3 stykker af epidermis. Dyrkningsmedierne indeholder 15% FCS, 1,1% natriumpyruvat og 1% penicillin / streptomycin i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium.
4. Inkuberes cellerne ved 37 ° C og _5% CO2. Den forventede udbredelsestiden indtil den første fibroblaster vokse ud af den epidermale prøve er 1-2 uger. Hvis væksten opstår problemer, kan du gøre brug af fibroblastvækstfaktor factor (5-10 ng / ml FGF2) til at forøge væksten af ​​cellerne.
5. Når en cellekonfluens på 50-70% er nået, kan de primære humane fibroblaster nedfryses. Tiden til 50-70% konfluens er nået, afviger blandt cellelinjer. Frys fibroblasterne i 90% FCS plus 10% dimethylsulfoxid (DMSO).

2. Fremstilling af humane fibroblaster til Live Cell Imaging Microscopy

Generelt bør forsøg med humane fibroblaster udføres med passager under 10 som ældning-associerede ændringer kan ændre egenskaberne af celler efter multiple passager. I tvivlstilfælde kan beta-galactosidase-assays anvendes til at vurdere induktion af aldringsprocesser i de respektive celler. Generelt skal du ikke bruge gamle fibroblaster (se ovenfor). Desuden at sammenligne flere cellelinier, arbejde med den samme passage antallet af hver cellelinie. Sammenligning af forskellige genetisk homogene patienter sammenlignet med raske kontroller. Men som det sommetiderpatienter, der bærer specifikke mutationer kan være sjældne, kan det betyde, at hudbiopsier fra kun én patient med en bestemt passage nummer og forskellige styreledninger skal inkluderes - her er det vigtigt at sikre den samme passage antal af alle linjer inkluderet. Hvis en cellekonfluens på 50-70% er nået, men intet eksperiment planlægges, bør fibroblaster skal indefryses.

1. På den første dag af forsøget, vaske de vedlagte fibroblaster gang med PBS. Så frigøre dem fra kolben bunden ved hjælp af en celle detachement opløsning af proteolytiske DNase enzymer (dvs. Accumax).
2. Tæl dine celler og frø 50.000-70.000 celler i hver brønd af en 4-kammer dækglas (1,8 ^cm2 kultur area per well). Følgelig er der for de 8-kammer coverglas, er halvdelen af celleantallet eller lidt mindre relevant (0,8 ^cm2 kultur area per well). Det er vigtigt at frø snarere et lille antal celler til at udføre real encellede analyse. Ingen specifik belægning for kamrene is behov.
3. Efter 24 til 48 timer, kan den levende celler forsøget udføres. Sørg for, at levende celler mikroskop er udstyret med en kuvøse, der styrer temperatur og CO ₂ niveauer. Under billedet erhvervelse, ° C og 5% en atmosfære af 37 CO _2, bør opretholdes.
4. Hver levende celler måling bør udføres i mindst tre uafhængige forsøg. I alt skal mindst 50 celler pr cellelinie skal afbildes. De levende celle billeddannelse eksperimenter samt off-line analyser skal udføres under blindede betingelser for at sikre upartiske dataindsamling.

3. Måling af Mitokondriel funktion i levende humane fibroblaster

Til konventionel måling af mitokondriefunktion via mitokondriemembranspændingen (MMP)-afhængige farvestoffer er fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS) den primære metode. I tilfælde af humane fibroblaster, cellulære autofluorescence ofte observeret, og kan give falske positive resultater ved interferens med den faktiske farvning signal. Autofluorescens typisk bliver mere udtalt ved højere passagetal af fibroblaster. Derfor foretrækker vi at vurdere mitokondriefunktion af humane fibroblaster af levende cell imaging mikroskopi.

1. 24-48 timer efter podning inkuberes fibroblasterne i 50 nM af MMP-afhængige farvestof tetramethylrodamine ethylester (TMRE) i RPMI-medium. Dette RPMI-medium vil mangle phenolrødt som det negativt kan påvirke billedkvaliteten. 1,6 uM af Hoechst-farvning skal tilføjes at visualisere cellekerner.
2. Cellerne inkuberes i fremstillet farvningsopløsning beskyttet mod lys i 15 minutter ved 37 ° C og _5% CO2.
3. Udskift farvningsopløsningen med RPMI-medium (uden phenolrødt). Fortsæt uden et vasketrin og straks billedet celler. Brug 63x forstørrelse og konfokal laserscanningsmikroskopi teknik (alternativt fluorescens mikroskopi under anvendelse afApotome teknik) for at definere enkeltlag af celler. Anvendes 37 ° C og _5% CO2 til celler under billeddannelsesprocessen.
4. Da imaging fibroblasterne, skal du være maksimal opmærksomhed på den anvendte eksponeringstid af fluorescerende lys som TMRE farvning kan blege ud hurtigt. Definer din passende eksponeringstid mellem 200 og 300 ms og ikke overstiger dette interval. Billedet køb under standardiserede indstillinger er meget vigtigt, da man ville være i stand til at foretage sammenligninger baseret på intensitet, hvis indstillingerne er forskellige mellem cellelinier.
5. Som defineret radius omkring de afbildede celler bleges ud efter lyseksponering, holde den næste synsfeltet tilstrækkeligt langt fra Lysbleget sektion.
6. Off-line analyser udføres ved hjælp ImageJ Software (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA).
7. Vælg din celle af interesse ved hjælp af en markering værktøj.
8. Konverter billede til 8-bit (Billede <Type <8-bit).
9. Reducer uspecifik støj by ved hjælp af "Pletfjerning"-funktionen (Proces <Støj <Pletfjerning).
10. Vælg "opslagstabeller - Fire" tilstand (Billede <opslagstabeller <Fire).
11. Skift i tærsklen funktionen til "Over / Under" funktionen og justere tærskel (Billede <Juster <Threshold).
12. Vælg "analysere partikler", hvilket vil give dig den gennemsnitlige grå værdi for hver mitochondriel partikel påviselig (analyse <Analysere partikler). Gem det givne resultat listen som et Excel-regneark.
13. Open resultat fil i Excel, og beregn gennemsnittet af den gennemsnitlige grå værdi af de mitochondriale strukturer (angivet som »gennemsnitlige« i det givne excel resultat listen).
14. Hvis du vil oprette en overflade plot, skal du vælge plugin "Interaktiv 3D overflade plot" i "3D" plugin sektion. Her kan du yderligere justere plot ved hjælp af forskellige skærmindstillinger. Ændring af "originale farver" til "Spectrum LUT" giver intensitet skala bar for en passende plot.
15. Alternativttil anvendelse TMRE til analyse af mitokondrisk funktion af humane fibroblaster via levende celler, en kombination af MMP-uafhængige farvestof Mitotracker Green FM og MMP-afhængige farvestof Mitotracker CM-H ₂ XRos kan anvendes. Igen, for humane fibroblaster levende celler mikroskopi foretrækkes, men i almindelighed dette alternativ er også blevet anvendt under anvendelse af FACS-analyse i andre slags celler ^12. Når du bruger denne alternative metode til at måle mitokondriefunktion i humane fibroblaster, trin 3-7 af protokollen sektion 5 "Måling af mitochondrio-lysosomal colokalisering i levende humane fibroblaster" bør anvendes. Dermed, er overlejringen af signaler både fra mitokondrier positiv for Mitotracker Green FM og Mitotracker CM-H ₂ XRos beregnes og indikerer mængden af funktionelle mitokondrier i forhold til alle mitokondrier stede.

4. Måling af Mitokondriel morfologi i Living humane fibroblaster

1. 24-48timer efter podning, beskyttet Cellerne inkuberes i 200 nM Mitotracker Green FM i RPMI-medium (uden phenolrødt) fra lys i 15 minutter ved 37 ° C og _5% CO2. 1,6 uM Hoechst-farvning skal bruges til at fremhæve kerner. Mitotracker Green FM er en MMP-uafhængig farvestof, der farver alle mitokondrie strukturer til stede.
2. Forsigtigt vaskes cellerne én gang med PBS.
3. Tilsættes frisk RPMI-medium (uden phenolrødt) til celler og straks billede celler. Brug 63x forstørrelse og konfokal laserscanningsmikroskopi teknik (alternativt fluorescens mikroskopi under anvendelse Apotome teknik) for at definere enkeltlag af celler.
4. Off-line analyser tages ud ved anvendelse af ImageJ software.
5. Vælg din celle af interesse ved hjælp af en markering værktøj.
6. Konverter billede til 8-bit (Billede <Type <8-bit).
7. Reducer uspecifik støj ved hjælp af "Pletfjerning"-funktionen (Process <Støj <Pletfjerning).
8. Brug convolution filter for at fremhæve mitochondrial strukturer (proces <Filtre <Convolve).
9. Justere tærsklen, således at signal-støjforholdet er passende (Billede <Juster <Threshold).
10. Ved at bruge "analysere partikler" valgmulighed, er den automatiske identifikation af mitokondrielle strukturer indledt på grundlag af en udvalgt pixelstørrelse (analyse <Analysere partikler). Adskillige mitokondrielle parametre efterfølgende beregnes som areal, omkreds, mindre og større akser eller cirkularitet. Disse målinger kan indstilles individuelt (analyse <Set Målinger). Gem det givne resultat listen som et Excel-regneark.
11. Åbn resultat i Excel-program. Ved anvendelse af sådanne parametre, kan analyser af mitochondrial morfologi udføres. Dette omfatter definitionen af formfaktor angiver graden af forgrening af et mitokondrie netværk [formel: (omkreds ²⁾ / (4 * PI () * area)] samt formatforholdet definerer længden af mitochondrier (formel: større akser / mindre akser).

5. Måling af Mitochondrio-lysosomal colokalisering i Living humane fibroblaster

1. 24-48 timer efter podning inkuberes celler i 200 nM Mitotracker Green FM og 100 nM Lyostracker Red DND-99 i RPMI-medium (uden phenolrødt) beskyttet mod lys i 15 minutter ved 37 ° C og _5% CO2. 1,6 uM Hoechst-farvning bruges til at fremhæve kerner.
2. Udskifte mediet med frisk RMPI-medium (uden phenolrødt) indeholdende 100 nM Lyostracker Red DND-99. Dette farvestof er nødt til at være til stede under hele imaging session. Vask ikke celler efter inkubationstid. Umiddelbart billede cellerne. Brug 63x forstørrelse og konfokal teknik (alternativt Apotome teknik) for at definere enkeltlag af celler.
3. Off-line analyser tages ud ved anvendelse af ImageJ software.
4. Åbn de to respektive billeder, du gerne vil analysere, hvad angår colokalisering status.
5. Konverter billede til 8-bit (Billede <Type <8-bit). Reducer uspecifik støj ved hjælp af "Pletfjerning"-funktionen i begge billeder (Process <Støj <Pletfjerning).
6. Vælg plugin'et "JACoP" som colokalisering analyseværktøj, der giver dig værdier for de respektive kanaler og beregner Pearsons koefficient, overlapper koefficient og Manders 'koefficient (Plugins <JACoP).

6. Repræsentative resultater

Mitokondriefunktion i levende humane fibroblaster kan evalueres via live cell imaging teknik. For funktionelle assays, korrelerer TMRE fluorescenssignal med mitokondriemembranspændingen (MMP). Under normale MMP betingelser er TMRE fluorescens signifikant højere (figur 1A, øverste række) end under patologiske tilstande karakteriseret ved en reduceret MMP (figur 1A, nederste række). Denne fluorescensintensitet måles ved at beregne gennemsnittet af den gennemsnitlige gråtone værdi af hver mitokondriestruktur ( (figur 1A, højre side).

Ved siden af ​​vurderingen af ​​mitokondrie funktion i humane fibroblaster, kan levende celler mikroskopi anvendes til at definere forskellige parametre om mitokondriel morfologi. Ved hjælp af Mitotracker Green FM farvning af mitokondrier strukturer visualiseres uafhængigt af deres respektive MMP (figur 2). Det er vigtigt at sikre inddragelsen af ​​alle mitochondriale strukturer er til stede i analyserne. Brug ImageJ Software, er morfologien analyseres på grundlag af binære tal, som kun her mitokondriske morfologi parametre kan vurderes (figur 2, "binary"). Eksempler på mitokondrie morfologi analyser i form af formfaktor samt formatforhold blev for nylig offentliggjort ^{6, 1}3. Et andet vigtigt træk, der kan måles i levende humane fibroblaster er nedbrydningen af ​​mitokondrielle strukturer. Det første skridt i denne udvikling kan vurderes ved mitochondrio-lysosomal colokalisering i live cell imaging mikroskopi. Visse patologiske tilstande resultere i en forøget colokalisering af mitokondrier med lysosomer (fig. 3A). Igen er Mitotracker Green FM anvendes til at farve mitochondriale strukturer uafhængigt af deres respektive MMP. Desuden, med Lysotracker Red DND-99 farvning tillader visualisering af lysosomale strukturer. Det er kritisk, at Lysotracker rødt farvestof er til stede under billeddannelsesprocessen, som vasketrin reducerer signal, der bliver for lav til visualisering. Colokalisering er repræsenteret af klare gule fluorescenssignaler på grund af overlapningen af det grønne (Mitotracker Green FM) og rød (Lysotracker Red DND-99) farvning (hvide pile, figur 3A) og bestemmes ved beregning af Pearson CoEfficient (figur 3B).

I almindelighed, for off-line analyser med ImageJ software er det nyttigt at visualisere én celle pr billede, således at definitionen af ​​et specifikt område af interesse (ROI) kan undgås.

Fig. 1. Måling af TMRE fluorescenssignal angiver mitokondriemembranspændingen (MMP) i levende humane fibroblaster af levende celler teknik. (A) TMRE er et fluorescerende MMP-afhængig farvestof, hvis fluorescensintensitet korrelerer med MMP. Hoechst farvestof blev anvendt til at farve kerner (blå). Under normale MMP betingelser (øverste række), den TMRE fluorescens er væsentlig højere end under patologiske tilstande karakteriseret ved en nedsat MMP (nederste række). Fluorescensintensitet er yderligere vistsom intensitet overflade plot. Scale bjælke angiver 10 um. (B) Statistiske analyser af de eksempelvise fibroblaster vist i (A). Under patologiske tilstande, er en formindsket TMRE fluorescens af mitokondrier målt i forhold til den normale MMP tilstand. se større tal .

Figur 2. Måling af mitokondrie morfologi i levende humane fibroblaster af levende cell imaging teknik. Mitotracker Green FM (grøn) bruges til at visualisere mitochondriale strukturer, for at den er uafhængig af MMP. Hoechst farvestof blev anvendt til at farve kerner (blå). Brug ImageJ Software, kan morfologien analyseres på binære tal. Scale bjælke angiver 10 um. Klik her for at se et større tal.

Figur 3. Måling af colokalisering af mitokondrier med lysosomer i levende humane fibroblaster af levende cell imaging teknik. (A) Mitotracker Green FM (grøn) anvendes til at farve mitochondriale strukturer, Lyostracker Red DND-99 (rød) visualiserer lysosomale strukturer. Hoechst farvestof blev anvendt til at farve kerner (blå). Vellykket colokalisering under patologiske tilstande er angivet ved en gul signal på grund af overlapning af Lysotracker Red og Mitotracker Green farvning (hvide pile). Scale bjælke angiver 10 um. (B) Statistiske analyser af de eksempelvise fibroblaster vist i (A). En højere grad af mitochondrio-lysosomale colokalisering resulterer i en forhøjet Pearson koefficientværdi./ 4228/4228fig3large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.

Discussion

Patient hudfibroblaster som ex vivo modeller repræsenterer et vigtigt redskab til at karakterisere sygdoms-associerede genetiske defekter. Desuden er hud-afledte fibroblaster let tilgængelig og kan udvides efter dyrkning. Derfor primære celler opnået fra patienter, der bærer PD-forbundne genetiske mutationer foretrækkes i forhold til anvendelsen af ​​tumorcellelinier, som de indeholder ikke kun det endogene sygdomsfremkaldende gen, men hele den genetiske baggrund af det angrebne individ. Desuden er de fibroblaster har vist sig at afspejle væsentlige patologiske træk ved mitokondriel dysfunktion under neurodegeneration. Eksperimenterne beskrevet i denne protokol er især anvendelige til at studere mitokondrie fænotyper, herunder funktion, morfologi samt at vurdere colokalisering af mitokondrier med lysosomer via live cell imaging teknik. Dermed, vigtigste kendetegn for sygdommen, nemlig mitokondriel dysfunktion og efterfølgende nedbrydelighedtion af disse ikke-funktionelle organeller, kan visualiseres og analyseres korrekt ^{6, 13.} Ændringer i mitokondrie-funktionen og morfologi er ofte det første skridt af sygdom patologi. For eksempel større opsplitning af mitokondrie netværk kan være en forudsætning for forbedrede autophagic og mitophagic processer ^6,12. Derfor kan colokalisering af mitokondrier med lysosomer bidrage til at vurdere mitochondrial nedbrydning (mitophagy) ^6. En mangel på dette colokalisering og en ophobning af mitokondrier med lysosomer kan afspejle defekter i lysosomal nedbrydning pathway'en og skal valideres ved at modulere autophagic flux ^6. I denne sammenhæng repræsenterer ImageJ Software et vigtigt værktøj til at generere validerede datasæt ved halv-automatiske non-biased analysere funktioner.

En yderligere mulighed, der udvider brugen af ​​humane fibroblaster til mere sygdomsrelaterede modeller er den potentielle generereion af inducerede pluripotente stamceller (iPS-celler), der kan opdeles i forskellige celletyper, der er hovedmålgruppen af sygdommen proces ^14. I forbindelse med Parkinsons sygdom, gør differentieringen af fibroblaster i dopaminerge neuroner denne cellulære model et lovende redskab til fremtidig forskning i denne neurodegenerative lidelse ^15,16. Vigtigt er det, kan alle de beskrevne analyser i protokollen her let oversættes til forsøgsopstillinger til at undersøge mitokondrielle forandringer inden for dopaminerge neuroner. Selvfølgelig kan endnu flere neuron-specifikke levende celler forsøg anvendes også.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Invitrogen	52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red	Invitrogen	11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Invitrogen	14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	100-18B
AccuMax (detachment solution)	PAA	L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses	Nalge Nunc International	115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE)	Invitrogen	T-669
Mitotracker Green FM	Invitrogen	M-7514
Mitotracker CM-H2XRos	Invitrogen	M-7513
Lyostracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
H–chst 33342	Invitrogen	H-3570
Table 1. Specific reagents and equipment.