Anvendelsen af primære humane fibroblaster til overvågning Mitochondriale fænotyper i Field af Parkinsons sygdom
Summary
Fibroblaster fra patienter med mutationer i Parkinsons sygdomsfremkaldende gener udgør en lettilgængelig<em> Ex vivo</em> Model til at studere sygdom-associerede fænotyper. Live-cell imaging giver mulighed for at studere morfologiske og funktionelle parametre i levende celler. Her beskrives fremstillingen af humane fibroblaster og efterfølgende overvågning af mitokondrielle fænotyper.
Abstract
Parkinsons sygdom (PD) er den næsthyppigste bevægelse uorden og påvirker 1% af mennesker over en alder af 60 1. Fordi aldring er den vigtigste risikofaktor, vil tilfælde af PD stige i løbet af de næste årtier 2. Ved siden af patologisk proteinfoldning og værdiforringede protein nedbrydningsveje blev ændringer af mitokondriefunktionen og morfologi påpeget som yderligere kendetegnende for neurodegeneration i PD 3-11.
Efter flere års forskning i murine og humane cancerceller som in vitro-modeller at dissekere molekylære veje for Parkinsonisme, er brugen af humane fibroblaster fra patienter og passende kontroller som ex vivo modeller blive et værdifuldt forskning værktøj, hvis potentielle forbehold tages i betragtning. Andre end udødeliggjorte, snarere kunstige cellemodeller, primære fibroblaster fra patienter, der transporterer sygdom-associerede mutationer tilsyneladende afspejler vigtige patologiske træk of den menneskelige sygdom.
Her har vi afgrænse procedure for at tage hudbiopsier, dyrkning af humane fibroblaster og bruge detaljerede protokoller for væsentlige mikroskopiske teknikker til at definere mitokondriske fænotyper. Disse blev anvendt til at undersøge forskellige træk forbundet med PD som er relevante for mitokondrie-funktion og dynamik. Ex vivo, kan mitokondrier analyseres med hensyn til deres funktion, morfologi, colokalisering med lysosomer (organellerne nedbrydning dysfunktionel mitokondrier) og nedbrydning via lysosomal omsætningsvej . Disse fænotyper er særdeles relevante for identifikationen af tidlige tegn på PD og kan gå forud kliniske motoriske symptomer i humane sygdom-genbærere. Derfor kan assayene præsenteret her anvendes som værdifulde værktøjer til identifikation patologiske træk ved neurodegeneration og bidrager til at definere nye terapeutiske strategier i PD.
Protocol
Discussion
Patient hudfibroblaster som ex vivo modeller repræsenterer et vigtigt redskab til at karakterisere sygdoms-associerede genetiske defekter. Desuden er hud-afledte fibroblaster let tilgængelig og kan udvides efter dyrkning. Derfor primære celler opnået fra patienter, der bærer PD-forbundne genetiske mutationer foretrækkes i forhold til anvendelsen af tumorcellelinier, som de indeholder ikke kun det endogene sygdomsfremkaldende gen, men hele den genetiske baggrund af det angrebne individ. Desuden er de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Fritz Thyssen Foundation (10.11.2.153 til RK), den tyske forskningsråd (DFG, KR2119/3-2 og KR2119/8-1 til RK), Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 til RK) og en ph.d.-stipendium fra den velgørende Hertie Foundation [til LFB]. Vi takker Carolin Obermaier og Julia Westermeier for deres støtte under videooptagelse.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue no. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
| RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
| AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
| Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
| Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
| Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
| Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
| Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
References
- de Rijk, M. C., Launer, L. J., Berger, K., Breteler, M. M., Dartigues, J. F., Baldereschi, M., Fratiglioni, L., Lobo, A., Martinez-Lage, J., Trenkwalder, C. Prevalence of Parkinson’s disease in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 21-23 (2000).
- Dorsey, E. R., Constantinescu, R., Thompson, J. P., Biglan, K. M., Holloway, R. G., Kieburtz, K., Marshall, F. J., Ravina, B. M., Schifitto, G., Siderowf, A. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations. Neurology. 68, 384-386 (2005).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
- Chung, K. K., Zhang, Y., Lim, K. L., Tanaka, Y., Huang, H., Gao, J., Ross, C. A., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Parkin ubiquitinates the alpha-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease. Nature. 7, 1144-1150 (2001).
- Kruger, R., Eberhardt, O., Riess, O., Schulz, J. B. Parkinson’s disease: one biochemical pathway to fit all genes. Trends Mol. Med. 8, 236-240 (2002).
- Krebiehl, G., Ruckerbauer, S., Burbulla, L. F., Kieper, N., Maurer, B., Waak, J., Wolburg, H., Gizatullina, Z., Gellerich, F. N., Woitalla, D. Reduced basal autophagy and impaired mitochondrial dynamics due to loss of Parkinson’s disease-associated protein DJ-1. PLoS One. 5, e9367 (2010).
- Exner, N., Treske, B., Paquet, D., Holmstrom, K., Schiesling, C., Gispert, S., Carballo-Carbajal, I., Berg, D., Hoepken, H. H., Gasser, T. Loss-of-function of human PINK1 results in mitochondrial pathology and can be rescued by parkin. J. Neurosci. 27, 12413-12418 (2007).
- Burbulla, L. F., Krebiehl, G., Kruger, R. Balance is the challenge–the impact of mitochondrial dynamics in Parkinson’s disease. European journal of clinical investigation. 40, 1048-1060 (2010).
- Strauss, K. M., Martins, L. M., Plun-Favreau, H., Marx, F. P., Kautzmann, S., Berg, D., Gasser, T., Wszolek, Z., Muller, T., Bornemann, A. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson’s disease. Human molecular genetics. 14, 2099-2111 (2005).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of cell biology. 183, 795-803 (2008).
- Dagda, R. K., Cherra, S. J., Kulich, S. M., Tandon, A., Park, D., Chu, C. T. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. The Journal of biological chemistry. , 284-13843 (2009).
- Kieper, N., Holmstrom, K. M., Ciceri, D., Fiesel, F. C., Wolburg, H., Ziviani, E., Whitworth, A. J., Martins, L. M., Kahle, P. J., Kruger, R. Modulation of mitochondrial function and morphology by interaction of Omi/HtrA2 with the mitochondrial fusion factor OPA1. Experimental cell research. 316, 1213-1224 (2010).
- Burbulla, L. F., Schelling, C., Kato, H., Rapaport, D., Woitalla, D., Schiesling, C., Schulte, C., Sharma, M., Illig, T., Bauer, P. Dissecting the role of the mitochondrial chaperone mortalin in Parkinson’s disease: functional impact of disease-related variants on mitochondrial homeostasis. Human molecular genetics. 19, 4437-4452 (2010).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nguyen, H. N., Byers, B., Cord, B., Shcheglovitov, A., Byrne, J., Gujar, P., Kee, K., Schule, B., Dolmetsch, R. E., Langston, W. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Seibler, P., Graziotto, J., Jeong, H., Simunovic, F., Klein, C., Krainc, D. Mitochondrial Parkin recruitment is impaired in neurons derived from mutant PINK1 induced pluripotent stem cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5970-5976 (2011).
