Summary
Wir beschreiben eine neue Methode zur Isolierung von genomischer DNA aus Vollblut für Plasma / Serologie gesammelt. Nach Plasma-Sammlung wird die verdichtete Blut in der Regel verworfen. Unsere neue Methode stellt eine signifikante Verbesserung gegenüber bestehenden Verfahren und macht DNA und Plasma von einem einzigen Sammlung, ohne Anforderung zusätzlicher Blut.
Abstract
Labortests können auf zellulärer oder Fluidanteile des Blutes erfolgen. Die Verwendung unterschiedlicher Blutsammelröhrchen bestimmt den Anteil des Blutes, das analysiert werden kann (Vollblut, Plasma oder Serum). Laboratories in das Studium der genetischen Grundlagen menschlicher Erkrankungen beteiligt vertrauen auf antikoaguliertes Vollblut in EDTA-haltige vacutainer als Quelle der DNA für genetische / genomische Analyse gesammelt. Da die meisten klinischen Laboratorien, biochemische und serologische viraler Tests in einem ersten Schritt in phänotypischen Ergebnis Untersuchung durchzuführen, wird auch in Antikoagulans Heparin-haltigen Rohr (Plasmarohr) gesammelt. Daher, wenn die DNA-und Plasma für simultane und parallele Analysen sowohl Genomik und Proteomik-Daten benötigt werden, ist es üblich, Blut sowohl EDTA und Heparin Röhrchen zu sammeln. Wenn Blut in einem Röhrchen gesammelt werden konnte und als Quelle für Plasma und DNA, würde das Verfahren als eine Weiterentwicklung bestehender meth werdenODS. Die Verwendung des verdichteten Blut nach Plasmaextraktion stellt eine alternative Quelle für genomische DNA und damit Minimierung der Menge von Blutproben verarbeitet und die Verringerung der Anzahl von Proben von jedem Patienten erforderlich. Dies würde letztendlich Zeit und Ressourcen sparen.
Der BD P100 Blutentnahme für Plasmaprotein Erhaltung wurden als ein verbessertes Verfahren gegenüber früheren Plasma oder Serum-Röhrchen 1 erstellt haben, um den Proteingehalt des Blutes zu stabilisieren, was eine bessere Protein Biomarkern und Proteomik Experimente aus menschlichem Blut. Die BD P100 Röhrchen enthalten 15,8 ml sprühgetrockneten K2EDTA und eine lyophilisierte proprietären breites Spektrum Cocktail von Protease-Inhibitoren zur Verhinderung der Koagulation und Stabilisierung der Plasmaproteine. Sie umfassen auch eine mechanische Trennvorrichtung, die eine physische Barriere zwischen Plasma und Zellpellets nach Zentrifugation stellt. Nur wenige Methoden wurden entwickelt, um DNA aus geronnenes Blut sa extrahierenmples in alten Plasmaröhrchen 2-4 gesammelt. Herausforderungen von diesen Methoden wurden hauptsächlich mit der Art der Separator im Inneren der Rohre (Gel-Separator) zugeordnet ist und inklusive Schwierigkeiten bei der Gewinnung des geronnenen Blut, die Unannehmlichkeiten der Fragmentierung oder Dispergieren des Gerinnsels und Behinderung des Gerinnsels durch Extraktion des Trenngels.
Wir präsentieren die erste Methode, die extrahiert und reinigt genomischer DNA aus Blut in den neuen BD P100 Rohre gezogen. Wir vergleichen die Qualität der DNA-Probe von P100 Röhren dass von EDTA. Unser Ansatz ist einfach und effizient. Es handelt sich um vier große Schritte wie folgt: 1) die Verwendung eines Plasmas BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) Rohr mit mechanischen Abscheider für die Blutentnahme, 2) die Entfernung des mechanischen Abscheider mit einer Kombination aus Saccharose und eine sterile Büroklammer Metallhakgen, 3) die Abtrennung des buffy coat Schicht, die die weißen Zellen und 4) die Isolierung der genomischen DNA aus derBuffy-Coat mit einem normalen kommerziellen DNA-Extraktions-Kits oder eine ähnliche Standard-Protokoll.
Protocol
1. Probenentnahme
- Sammeln von Blutproben von Personen mit entsprechenden Einwilligung. Für jeden einzelnen, ziehen 4 bis 5 ml Blut in ein Röhrchen P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). Zu Vergleichszwecken wurden gleichzeitig sammeln Blut in einem EDTA-Röhrchen.
- Die BD P100 Röhrchen enthalten 15,8 ml sprühgetrockneten K2EDTA und eine lyophilisierte proprietären breites Spektrum Cocktail von Proteaseinhibitoren zur Gerinnung zu verhindern und zur Stabilisierung der Plasmaproteine. Sie enthalten auch einen mechanischen Abscheider. Nach dem Sammeln der Vollblut, halten beide Röhrchen bei Raumtemperatur für 60 min über Nacht bis zur Verarbeitung auftritt.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen BD P100 bei 2.500 g für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Übertragen Sie das Plasma über die mechanische Abscheider in Mikrozentrifugengefäße gesammelt.
- Bewahren Sie die P100 Rohre, die das Blut unter dem Separator verdichtet, bei -80 ° C, bis Sie bereit sind, die DNA ext beginnenraction.
2.1 Von Blut P100 Rohr (P100_DNA)
- Die P100 Röhrchen werden bei -80 ° C nach dem Plasma-Extraktion. Innerhalb von 3 bis 4 Monate, Abrufen der P100 Röhrchen mit dem verdichteten Blut aus dem Gefrierfach und Auftauen bei 37 ° C in einem Wasserbad für 5 min (1A). Entfernen Sie alle Restplasma, die über dem Abscheider sitzt. 2 ml 17% Saccharose-Lösung (Gradient Lösung im Haus getestet - unveröffentlichte Daten) in den P100 Rohre über dem Separator (Abbildung 1B). Die Röhrchen bei Raumtemperatur für 20 min bei 2.500 g; dieser Vorgang drückt die mechanische Abscheider zum oberen Ende des Rohres und liefert drei Schichten aus Lösung, die das buffy coat (Abbildung 1C). Extrahieren Sie manuell den Separator mit einer steriled Haken Metall Büroklammer (1D).
- Nach dem Abrufen der mechanischen Abscheider aus jedem Röhrchen (1D), zu entfernen und discard die obere Schicht Saccharose. Übertragen Sie die mittlere Schicht, die die Buffy-Coat (BC)-Schicht, in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen. In Phosphate Buffer Saline (PBS), die Buffy-Coat-Volumen bis 3 ml zu erhöhen. Extrahieren Sie die DNA aus dem Buffy-Coat mit Reagenzien aus dem Qiagen Puregene Blood Kit nach der Empfehlung des Herstellers, ausgenommen einer Zentrifugationsgeschwindigkeit von 2.500 g (anstelle von 2.000 g).
- Um lysieren und entfernen Sie die roten Blutkörperchen (RBC), fügen 9 ml RBC Lyse bis 3 ml Buffy-Coat. Umkehren jedes Rohr mehrmals und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min mit gelegentlichen invertierenden während der Inkubation. Drehe jede Mischung unten bei 2.500 g für 5 min und den Überstand verwerfen. Behandeln Sie die verbleibende Pellet in jedem Röhrchen mit 3 ml Zell-Lyse-Lösung und Vortex für 15 Sekunden. Behandeln Sie das Lysat mit 1 ml Protein Fällungslösung und Vortex für 15 Sekunden.
- Zentrifuge bei 2500 g für 5 min und den Überstand in ein frisches 15 ml konischen Röhrchen mit3 ml 100% Isopropanol. Kehren Sie die neuen Rohre 10-mal und Zentrifuge bei 2.500 g für 3 min. Überstand verwerfen und 1 ml 70% Ethanol. Kehren Sie die konische Röhrchen ein paar Mal zu lösen und waschen das DNA-Pellet. Zentrifuge bei 2.500 g für 1 min. Die Tablette für 3 min (das Reagenzglas auf den Kopf) bei Raumtemperatur trocknen und dann setzt die DNA mit 250 ml Rehydrationslösung bei 37 ° C für 10 min und Transfer zu einem pre-markierten 1,7 ml Mikroröhre. Bewahren Sie die Röhrchen bei -80 ° C bis zur Verwendung.
2.2 aus dem Blut von EDTA Ttube (EDTA_DNA)
- Das Vollblut für die routinemäßige Prüfung Immunhämatologie in Kunststoff vaccutainer Röhrchen gesammelt mit 10,8 mg K 2 EDTA-Spray aufgetragen und bei -80 ° C. Da die Rohre nicht enthalten einen mechanischen Abscheider, wird die DNA-Extraktion nicht die Schritte, die die mechanischen Abscheider (2.1.1 und 2.1.2).
- Innerhalb von 3 bis 4 Monaten von Blut Lagerung, die DNA extrahiert mit der KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Es ist eine Automatisierung DNA Absaugsystem Magnetpartikel-Technologie und besteht aus Zelllyse / DNA-Bindung, mehreren Waschschritten und DNA-Elution.
- Das Kit in der DNA-Extraktion verwendet wird, die KingFisher Flex 24 DNA Blood Kit (Qiagen, Deutschland).
3. DNA Menge and Quality Assessment
Die Menge, Qualität und Integrität der genomischen DNA durch eine Kombination von Verfahren, die PicoGreen, Spektroskopie und Elektrophorese umfasst beurteilt.
- Die Konzentration der genomischen DNA durch Nanodrop und PicoGreen Quantifizierung bestimmt.
- Die Reinheit wird aus dem 260/280 Verhältnis Messung am Nanodrop Spektralphotometer bestimmt.
- Die Probe (500 ng) wird ebenfalls auf 1% Agarose-Gel geladen, um die Integrität (Degradation) der DNA zu beurteilen.
4. Genotyping Assays und Qualitätskontrolle
- Fünf P100_DNA und ihre entsprechenden EDTA_DNA Proben werden nach dem Zufallsprinzip für die weitere Analyse mithilfe des benutzerdefinierten Immunochip (Immuno DNA Analysis BeadChip) ausgewählt. Immunochip ist ein Infinium Genotypisierung Chip mit 196.524 Polymorphismen und ist für 5 immungenetischen Studien konzipiert.
- Für jede Probe werden 200 ng DNA amplifiziert, fragmentiert, gefällt und in die entsprechende Hybridisierungspuffer.
- Die denaturierten Proben werden auf Immunochips bei 48 ° C für mindestens 16 Stunden hybridisiert.
- Nach der Hybridisierung werden die Immunochips für Ein-Basen-Extension Reaktionen und gefärbten verarbeitet.
- Die immunochips werden dann aufgenommen mit Illumina Bead Array HiScan Leser und die normalisierte Intensität Wulst Daten in den Illumina GenomeStudio Software geladen und in Genotypen. Genotypen werden als mit dem Algorithmus von autocalling GenomeStudio. Die Qualitätskontrolle ines spricht Ausschluss von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) mit einem Aufruf Rate <95%.
- Die SNP anrufen wird als Maß für die Effizienz immunochip Assay verwendet. Es wird als Prozentsatz der Gesamtzahl von Assays, die auf dem Chip (196.524 SNPs auf jedem Chip codiert), die eine ausreichende Signalstärke und Qualität zu erzielen, eine automatische Zuordnung Genotyp erhalten berechnet. Hochwertige DNA (260/280 von 1,8 oder höher und Abwesenheit von Abbau) wird erwartet, dass mindestens die gleiche anrufen als HapMap Kontroll-DNA in dem Test eingeschlossen immunochip erreichen. Qualitätskontrolle beinhaltet Ausschluss von SNPs mit einem Aufruf Rate <95% in jedem Datensatz.
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Representative Results
DNA Qualitätsbewertung und Konzentrationsmessung
Die Ausbeuten an P100_DNAs waren signifikant niedriger als die der EDTA_DNAs (Tabellen 1 und 2). Die DNA-Reinheit durch seine 260/280 Verhältnis Wert dargestellt ist ähnlich für beide P100_DNA und EDTA_DNA Probe-Set (Tabellen 1 und 2). Die Qualität der DNA ist ziemlich einheitlich in jedem Satz der Probe, obwohl einige Verschlechterung der EDTA_DNA Proben gesehen, wie durch Licht Abstrich angegeben (Abbildung 2). Die EDTA_DNAs die mehr Anzeichen von Degradation zeigte zeigte auch reduzierte DNA-Konzentration.
Genotypisierung
Die Genotypisierung anrufen für beide EDTA_DNAs und P100_DNAs wurden verglichen. Sie ergaben ähnliche Tarife für Gespräche und waren beide vergleichbar mit dem internen Kontroll-DNA HapMap (Tabelle 3).
Abbildung 1. Buffy coat Isolation.
Tabelle 1. DNA-Probe Ausbeute (PicoGreen) und Ratio (nanodrop).
| DNA-Ausbeute | DNA Reinheit | |||
| Proben | P100 | EDTA | P100 | EDTA |
| 1 | 135 | 340 | 1,79 | 1.9 |
| 2 | 119 | 344 | 1.85 | 1.89 |
| 3 | 57 | 129 | 1.88 | 1.88 |
| 4 | 159 | 640 | 1,86 | 1.88 |
| 5 | 140 | 430 | 1,86 | 1.88 |
| 6 | 150 | 673 | 1,86 | 1.9 |
| 7 | 139 | 425 | 1,74 | 1.88 |
| 8 | 118 | 240 | 1,87 | 1,86 |
| 9 | 51 | 86 | 1,87 | 1.83 |
| p-Wert | p = 0,00221 | p = 0,09836 | ||
Tabelle 2. Vergleich der Ausbeute und Reinheit (two-tailed, gepaarte Stichproben-t-Test).
| Genotypisierung Cell Rate | ||
| Proben | P100 | EDTA |
| 1 | 97,9 | 97,5 |
| 2 | 97,9 | 97,8 |
| 4 | 97,4 | 97,5 |
| 7 | 97,5 | 98,2 |
| 8 | 97,9 | 98 |
| P-Wert | p = 0,67970 | |
Tabelle 3. Genotypisierung anrufen (two-tailed, gepaarte Stichproben-t-Test).
| Proben | Layers | Ausbeute (ug) | Ratio (260/280) |
| Buffy coat | 150 | 1,86 | |
| RBC | 4,13 | 1,73 | |
| P100_07 | Buffy coat | 139 | 1,74 |
| RBC | 1,00 | 1,70 | |
| P100_08 | Buffy coat | 118 | 1,87 |
| RBC | 3,72 | 1,78 | |
| P100_09 | Buffy coat | 51 | 1,87 |
| RBC | 0,23 | 0,98 |
Anhang. Auswertung der DNA-Menge der roten Blutkörperchen (RBC)-Schicht gefunden.
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Discussion
Viele menschliche Erkrankungen genetische Ursachen haben und die Erforschung der genetischen Grundlagen von Erkrankungen des Menschen verlangt eine zunehmende hochwertige DNA. Die häufigste Quelle von DNA in genetischen Studien verwendet wird Vollblut Antikoagulation. Da die meisten klinischen Labors biochemische, serologische und viraler Tests durchzuführen, wie in einem ersten Schritt phänotypische Untersuchung Ergebnis wird das Blut oft in einem Plasma-Röhrchen gesammelt. Nach der Entnahme des Plasmas wird der verdichtete Blut oft verworfen. Daher wird, wenn DNA benötigt wird, um genetische Studien oder Prüfungen durchzuführen, wird eine zusätzliche Blutprobe von dem gleichen Patienten erforderlich. Der verworfen verdichteten Blut stellt eine potenzielle Quelle von DNA, wie es weiße Blutkörperchen enthält. Daher ist die Verwendung von Blut verdichteten Plasmaröhrchen bietet die Möglichkeit, die gesammelten Blutprobe effizienter zu nutzen, ohne die Notwendigkeit, überschüssige Blut zeichnen oder erinnern an die Patienten für zusätzliche Blut.
Verschiedene Methoden zur exTrakt DNA aus den weißen Blutkörperchen von verdichteten oder geronnenes Blut wurden 6-10 gemeldet. Die meisten der Herausforderungen dieser Verfahren wurden mit dem Design des Plasmas Sammelrohr verbunden. Frühere Plasma-Röhrchen enthielt einen Separator aus einem Gel (Gel Separator), die bei zentrifugiert, bildeten eine Barriere, die Blut-Zellen (eingeschlossen unter dem Separator) aus dem Plasma (über dem Separator) getrennt werden. Um eine Kontamination der Blutzellen mit dem Gelmaterial zu verhindern, muss der Separator zuerst vorsichtig aus dem Rohr 11 entfernt werden. Dies wird durch eine Fragmentierung des Blutgerinnsels effiziente DNA-Extraktion gefolgt garantieren. Die Fragmentierung Prozess führt oft zu einem erheblichen Verlust der Blutprobe und einer Verringerung der DNA-Ausbeute. Um Probe Verlust zu minimieren und Verbesserung des Prozesses wurde eine kleine Poren Mesh verwendet, um mechanisch verteilt das Blutgerinnsel in kleine Stücke 12, aber immer noch Fragmentierung betroffen DNA-Ausbeute und Qualität und even stellte eine Gefahr für die Gesundheit der Techniker 13.
Die BD P100 Rohre von BD Bioscience sind die neueste Generation von Plasma-Röhrchen in multizentrischen Studie immunologische 14 ausgewertet. Wie in den vorherigen Plasmaröhrchen enthalten sie Antikoagulanzien zur Gerinnung und Protease-Inhibitoren verhindern die Plasmaproteine stabilisieren. Die wichtigste Neuerung der BD P100 Rohr liegt in der mechanischen Abscheider (kein Gel Separator) in jedes Röhrchen. Die mechanische Trennvorrichtung auch eine physische Barriere zwischen dem Plasma und Zellpellet nach der Zentrifugation, aber im Gegensatz zu dem Gel Separator bietet keine Gefahr der Kontamination der Probe durch ein Gel. Das Protokoll in dieser Studie angewendet beinhaltet keine Fragmentierung, daher gibt es keine Gefahr für die Gesundheit gefährdet.
Die DNA wurde aus dem buffy coat gewonnen, unter Verwendung eines kommerziellen Kits Protokoll (siehe DNA-Extraktion). Das verdichtete Blut in den BD P100 Rohre waren cryopreserviert für einen Zeitraum von 3 bis 4 Monate vor der DNA-Extraktion. DNA aus EDTA (EDTA_DNA) extrahiert wurden als Kontrolle für die Beurteilung der Ausbeute und Qualität der entsprechenden P100_DNA verwendet. Aus früheren Studien 12,13,15, waren die Ausbeuten an EDTA_DNA Proben deutlich höher als die von DNA aus Blut von früheren Plasmaröhrchen. In dieser Studie für die gleiche Menge Vollblut von jedem Patienten gesammelt ergab die buffy coat des verdichteten Blut weniger DNA (Tabelle 2, p = 0,00221). Bei der DNA-Extraktion aus dem Blut in den neuen P100 Plasmaröhrchen sind einige weiße Blutkörperchen aus dem buffy Küste der Schicht roter Blutkörperchen verloren (darunter) jedoch stellt unbedeutende Menge an DNA im Vergleich zu denen aus dem Buffy-Coat (siehe Anhang Tabelle). Die Variation der Ausbeute mit EDTA_DNAs gesehen ist auch mit der darauf hindeutet, dass es P100_DNA Probe hängt nachgeahmt. Proben mit höheren Volumen normalerweise Ertrag mehr und DNA-Probenmit niedrigeren Volumen und / oder leicht degradierte DNA ergeben würde weniger DNA.
Analysen auf Agarosegel (Abbildung 2) ergab, dass EDTA_DNAs Anzeichen von Degradation (Abstrich) nicht in ihre entsprechenden P100_DNAs gesehen zeigen. Insbesondere zeigen zwei EDTA_DNA Proben (EDTA_01053 und EDTA_06030) mit dem niedrigsten Ertrag mehr Abstrich als andere. In ihrer Studie, berichtete Wong et al. 11 verringert DNA-Ausbeute mit erhöhter Lagerzeit. Da alle Blutproben in unser Repository auf den gleichen Lagerbedingungen unterworfen wurden und die Probe Teilmenge in dieser Studie verwendet wurde zufällig ausgewählt, Lagerung Länge und Zustand kaum zur Berücksichtigung der Unterschiede auf dem Agarosegel zwischen P100_DNAs und EDTA_DNAs gesehen. Die Tatsache, dass nur EDTA_DNAs anzeigen Abbau des Fehlens von Proteaseinhibitoren in EDTA-Röhrchen in Verbindung stehen könnte.
Die Reinheit der P100_DNAs und EDTA_DNAs waren nicht signifikant unterschiedlich ( Die verwendeten Proben wurden für genetische Studien der entzündlichen Darmkrankheit rekrutiert. Deshalb, um die Leistung der extrahierten DNA-Proben vergleichen zu können, wurde die immunochip 5 als Genotypisierung Testplattform ausgewählt. Die immunochip wurde als Feinkartierung Genotypisierung Plattform für Immunogenetik 16,17 verwendet worden. Die Genom-weiten Natur der SNP-Genotypisierung Assays wurde als strengere Maßnahme der DNA Leistung verwendet. Die durchschnittlichen Genotypisierung Call Tarife für alle DNA-Test und HapMap Kontrollproben auf allen Chips, waren 97,76% und 97,4% bzw. eine vergleichbare hervorragende Leistung der DNA von beiden Blutabnahmegefäße ( Fazit DNA aus dem Blut der verdichteten BD P100 Rohre, die Erleichterung genomische Tests aus derselben Blutprobe für Plasma Proteomstudien gezeichnet isoliert werden. Unsere Ergebnisse erweitern den Nutzen der Forschung P100 Rohr. Die Tatsache, dass DNA in das zelluläre Gehalt des Blutes in P100 gesammelt verwendbar für genomische Analysen können helfen, vereinfachen Probe Erwerb für Studien, in denen sowohl Proteom-und Genom-Analysen durchgeführt werden. Daher wird weniger Blut aus jedem menschlichen Individuum benötigt und einen damit verbundenen Kosten-und Arbeitsaufwand für die Studie Sponsoren und Mitarbeiter wird verbessert. Es gibt mehrere Vorteile zeigen:
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Paper clip | Office product | ||
| 15 ml tube | Corning | 430052 | |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Bead array reader | Illumina | NA | |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
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