Summary
Üretimli kas dokusu hastalığı modeli olarak hem de eti için alternatif bir kaynak olarak, rejeneratif tıpta büyük bir potansiyele sahiptir. Burada fare miyoblast projenitör hücreleri ve elektrik sinyalleri tarafından uyarılması, bu durumda, bir kas yapısının mühendislik açıklanmaktadır.
Abstract
Engineered kas dokularının ve rejeneratif ilaç için bir alternatif et 1. basınç ülserleri çalışmak için in vitro olarak örneğin, bir hastalığın örnek olarak kullanım için dokuların üretimi, dahil çeşitli farklı amaçlar için kullanılabilir. İlk rapor 3D kas yapıları yıllar önce yapılan ve alanında öncü Vandenburgh ve arkadaşları 2,3 olan oylandı. Kas doku mühendisliği alanındaki ilerlemeler biyokimyasal faktörler, kök hücre ve progenitör hücrelerin bilgisi engin kazanç gelen sonuç değil sadece, ama fiziksel faktörlerin hücre davranış kontrolünde önemli rol oynadığı araştırmacılar tarafından kazanılan öngörüleri özellikle tabanlı olan ve doku gelişimi. State-of-the-art mühendislik kas anda hücre nüfuslu hidrojel yapıları oluşur oluşturur. Bizim laboratuvarımızda bu genellikle C2C12, mil murin arka bacak kasları izole sıçan miyoblast progenitör hücreleri, ya da bir fare miyoblast hücre hattı oluşurkollajen / Matrigel oluşan bir karışım ile Duran ve iki ankraj noktası arasındaki kaplama, kas bağları taklit. Diğer hücrelerin yanı gibi L6 sıçan miyoblastları 4, yenidoğan kas kaynaklı progenitör hücreleri 5, insan 6 hatta indüklenen pluripotent kök hücreler (iPS hücreleri) 7 gibi diğer türlerden erişkin kas dokularının türetilen hücreler olarak örneğin alternatif hücre hatları kabul edilebilir . Hücre kontraktilite yapı 8,9 ve kültür yaklaşık bir hafta sonra kas progenitör hücrelerin farklılaşma uzun ekseni boyunca hücre hizalama yapar. Dahası, elektrikli uyarım uygulama ölçüde 8 farklılaşma sürecini geliştirmek olabilir. Çünkü sınırlı boyutu (8 x 2 x 0,5 mm) tam doku örneğin canlılığı, farklılaşma ve hücre hizalama izlemek için konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edilebilir. Söz konusu uygulamaya enginee için gereksinimleri bağlı olarakkırmızı kas dokusu değişecektir; diğer türler için bir et alternatif çeviri gerekli olarak hizmet ederken rejeneratif tıp örneğin kullanımı, doku boyutu ve vaskülarizasyon yukarı ölçeklendirme gerektirir.
Protocol
1. Mürin myoblast Progenitör Hücreleri veya C2C12 Hücre Kültürü
- Başlangıçta Shefer ve arkadaşları 10 tarafından yayımlanan ve Collins et al. 11 ve Boonen ve ark. 12 göre adapte protokolüne göre hücreler izole ve sıvı azot içinde bu saklayın. Bu fareler, örneğin, C57BL / 6 gerektirir. Alternatif yöntemler örneğin Li, Y ve arkadaşları ile görselleştirilmiş Deney yayınlanan bir yöntemi, diğer laboratuarlarda kullanılmaktadır. 13. Reaktifler ve cihazlar için, sayfa 7 ve 8'de verilen tabloda verilir. Tek bir fare kas itibaren genellikle sıvı azot içinde yaklaşık 20 şişeleri cryopreserve yeterli hücre elde edecektir. Sonra, sıvı azot depolama hücrelerinin çözülme için protokol başlar.
- 25 cm 2 Matrigel (1 mg / ml) kaplanmış doku kültürü şişesi içine 1 şişeden hücrelerin yerleştirin ve oluşan büyüme ortamı (GM) (335 ml DMEM gelişmiş, 100 ml cenin bovin eklemeke serum (FBS), 50 ml HS, 5 ml penisilin / streptomisin, 5 ml L-glutamin, 5 ml tavuk embriyo özü (OA)).
Not: Oda sıcaklığı az 2 saat süreyle ceket ve aspirasyon ile Matrigel çıkarın.
- Hücrelerin yaklaşık olarak 3 gün boyunca her 01:03 alt kültür.
Bu şu anlama gelir: 3. gün: biri 75 cm 2 balon iki 150 cm 2 matara (kaplamasız şişeler preplating 30 dk) geçişi hücreleri: günde 6, 75 cm 2 balon bir 25 cm 2, gelen Passage hücreler. Günde 9 tek transfer 150 cm 2 balon üç 150 cm 2 matara (gerekirse preplate tekrar hücrelerin fenotipi bağlı olarak) kullanılamayabilir 1 üçlü 150 cm 2 balon veya eğer. Günde 12 hücreleri kas yapı içine tohum hazır bulunmaktadır.
Notlar: - Üçlü 150 cm 2 başına hücre sayısı yaklaşık 4,5 x 10 6 hücre olacak.
- Via kullanınfarklı izolasyonların gelen ls ekimi sırasında hücre karışık bir nüfus elde etmek karıştırın.
Not: birincil piller ile çalışmak istemezseniz, C2C12 miyoblastları iyi bir alternatiftir.
2. Mühendislik İskelet Kası Dokular
- "Sertleştirici" (10:1) ile "elastomer" karıştırılarak silikon yapıştırıcı hazırlayın. Tek üçgen tarafı (; Şekil 1 şekil ev gibi) ile Velcro 5 mm kare bölümler + / - Kes. Kare arasında yaklaşık olarak 12 mm arasında bir boşluk bir 6-kuyulu kültür plakasının kuyu içine Tutkal Velcro.
Notlar: - Sadece Velcro yumuşak tarafı kullanın ve bu yan yukarıya dönük.
- Çatıları birbirine baktığından emin olun.
- Sadece silikon yapıştırıcı ile Velcro kapak, iyi boyunca tutkal yayılır yok.
- Daha sonra elektriksel stimülasyon için bu iyi bir maç dikey yönde yapıları hizalamak alakalı(uzun ekseni boyunca) yedik.
- Vakumlu fırın içinde gece boyunca kurumaya bırakın, ısıtmalı değil, öncelikle hava kabarcıklarını çıkarmak için. 15 dakika için inkübe kuyuları ve% 70 EtOH ilave edilerek sterilize edin. PBS ile 3x durulayın ve 15 dakika UV altında koymak. Kuyulardan tüm PBS ve kullanıma kadar kuvöz Velcro ve yer çıkarın.
- Buzdolabında Matrigel çözüm çözülme ve kısa süre 3D yapıları yapmadan önce istenilen konsantrasyona kollajen solüsyon hazırlanır. Steril% 0.02 asetik asit (nihai konsantrasyon 3.2 mg / ml) ile stok kollajen seyreltilir.
Not: buz üzerinde her şeyi bırakın.
- GM ve sayısında tekrar süspansiyon hücreleri, Trypsinize. Inkübatör santrifüj tüpündeki hücreler bırakın.
- Bu kollajen çözüm 0.5M NaOH ekleyin, bir tüp (Tablo 1 'e göre) yapmak istediğiniz yapıları numaraları için Kollajen stok solüsyonu istenilen miktarda Ekle açık pembe Colo kadarr 7,5 arasında bir pH değerine işaret etmektedir. Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından yavaşça karıştırın ve kabarcık oluşumunu önlemek. Sonra Matrigel ekleyin ve yavaşça ama iyice çok karıştırın. Nihayet, Kollajen / Matrigel karışımı (uygun miktarlarda için Tablo 1'e bakınız) için GM ekleyin.
Notlar: - buz üzerinde her adımı gerçekleştirin! Matrigel ve kollajen artan sıcaklıkta kolayca jel olacaktır.
- Rengi aslında pembe olduğunu dikkat! PH seviyesindeki artış da hızlı jelleşme neden olacaktır.
Kollajen - nihai konsantrasyon: 1.6 mg / ml.
- 5 dakika için 1000 rpm'de hücrelerin istenen miktarda santrifüjlenir ve süpernatant çıkarın.
Not: - yapı başına hücre sayısı ayarlanması gerektiğinde hücre faaliyeti bağlı olarak değişir. Tipik olarak, hücre sayısını yapı başına 750,000 ila 1,250,000 hücreler yer alır.
- Hücre pelet tekrar süspansiyon jel karışımı bazı kullanınve kalan karışımı içine hücreleri aktarmak ve iyice karıştırın, ama hava kabarcıkları tanıtan olmadan.
- Kuvöz ve pipet Velcro ilk içine hücre jel karışımı 0.35 -0.4 ml ısıtılmış kuyucuğu çıkarın. Ardından, ek siteler arasında merkezine karışımı Pipeti ve Velcro uzatmak başlar. Son olarak, Velcro parçaları etrafında iki Velcro çapa ve pipet arasındaki boşluğu doldurmak için jel kalanını da kullanabilirsiniz.
- Jeller aktarılacak yeterince sağlam olup olmadığını dikkatlice 5-10 dakika sonra kontrol edin, yani hafifçe yemekleri dokunun ve jel katı ise görsel inceleyin. Eğer öyleyse, bir inkübatörde yemekleri dikkatle yerleştirin. Genellikle, onlar on dakika sonra alınabilir. Daha sonra, 1-2 saat sonra, yavaşça sıcak GM 4 ml her biri jel üzerinde görüntülenir.
Not:-Do tabak tutarken güçlü hareketleri yapamaz.
- (Büyüme ortamında farklılaşma, orta GM değiştirincivciv embriyo özü olmadan) 24 saat sonra, ve taze orta 2-3 günde bir ile değiştirin. Gün 7 sitesinde sigortalı kas liflerinin çapraz çizgili gelişimi için boyama ile değerlendirilebilir gibi, olgun odaklı kas liflerinin elde olmalıdır.
3. Elektriksel Stimülasyon
- Bir güvenlik kabininde UV altında% 70 etanol ve sonra kuru kullanmadan önce ionoptix plaka elektrotlar (reaktifler ve ekipman tabloya bakınız) sterilize edin. Yapıları ile kültür plaka üzerine elektrotlar ile plaka yerleştirin ve kültür plaka ve bir inkübatöre transfer kapağı ile kapatın. Kablolar ile uygun Ionoptix C-pacer bağlayın.
Not: Elektrotlar kas yapı (Şekil 2) ile birlikte paralel olarak yerleştirilir.
- Beklendiği gibi stimülasyon protokolü uygulayın.
Not: Biz genellikle, 4 V / CM kullanın2Hz bir frekansta 6ms bakliyat. Kültür ortamı uyarılma sırasında her 24 saat değiştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Son ürün olarak Şekil 3 'de gösterilen kas yapı olacaktır. Doku büyüklüğü yaklaşık 8 mm uzunluğunda, 2 mm genişliğinde ve 0,5 mm kalınlığında olacaktır. Farklılaşması sırasında elektrik stimülasyonu miyozin ağır zincir izoform ifadesi değişecektir, ancak farklılaşma orta 8 ile uyarılan olarak büyük ölçüde farklılık sürecini geliştirmek değil, aynı zamanda elektrik stimülasyonu kas işlevselliğinin kontrol etmek için işlem sonunda uygulanabilmektedir çünkü, tam gelişmiş sarkomer ile kas elektriksel darbe üzerine sözleşme mümkün olacak.
Farklılaşma ve olgunlaşması da dokular ya da tüm montaj lekeli doku örneklerinden yapılan ya kesitlerde kas olgunlaşma belirteçlerinin veya çapraz çizgili geliştirme (alfa aktinin örneğin boyama) için gen ekspresyonu değerlendirme ve boyama için kantitatif PCR kullanılarak analiz edilebilir. Kas olgunlaşması ve farklılaşması ilişkited genler ve miyozin ağır zincir ifade örneğin myod, myogenin, MFR4 ve MLP, ve MYH 1, 2, 4 ve 8 8 bulunmaktadır. Gerçekten oluşan kas dokusunun gen ekspresyonu immünohistokimyasal boyamalar ve elektriksel stimülasyon ile kontraksiyon indüksiyon dayalı kas dokusu, yani Proof önce 8 yayınlanmış ve miyoblast progenitör hücreler ve C2C12 hücrelerden yapılmış kas dokularının boyanan kesitler bir figür olmuştur Bu kağıt, Şekil 4'te gösterilir.
| Çözüm | Ul Hacim (10 kas yapma durumunda) |
| Kollajen (3.2 mg / ml,% 0.02 asetik asit ile seyreltilmiştir) | 2570 (% 51.3) |
| NaOH (0.5 M) | 10 (% 0.2) |
| Matrigel | 430 (% 8.6) |
| Büyüme ortamı | 2,000 (% 39,9) |
| toplam | 5.010 (zararı dökülmesini ve pipetleme için yeterli ile yeterli olacaktır) |
Tablo 1. Bir doku mühendisliği kas üretimi için hücreleri ve jel karışımı oluşturmak.
Şekil 1. Velcro parçaları Kesme.
Şekil 2. Bir resim kas alttan elektrotların yerleşim gösteren bir 6-plaka bir kuyuya inşa alınmıştır. Elektrotlar (beyaz oklar ile gösterilen) kas yapıları paralel yerleştirilir.
Şekil 3,. Bir doku6-kuyu kültür plaka velcro iki adet arasında kas tasarlanmıştır.
Şekil 4. C2C12 (A) ve MPC-arası yarıkları tipik örnekleri, (B), lamine iskelet kas dokusunda. Uyarılmamış mBAMs (farklılaşma gün 8) 'in Dondurulmuş kesitler sarkomerik α-aktinin (kırmızı), sarkomerik miyozin (yeşil için boyandı ) ve çekirdekleri (mavi). Kutulu alanların (Aa-Ab ve Ba-Bb) Büyütme (A, B) α-aktinin (kırmızı) ve sarkomer miyozin (yeşil). 8 izni ile yayımlanmaktadır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kas dokularının mühendislik rejeneratif tıpta ilaç tarama için bir hastalık modeli olarak ve et üretimi için kullanılmak üzere büyük bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, bu tür uygulamalar için gereksinimleri değişir. Kollajen hücre hizalama sağlar çünkü önceki 2B çalışmaları 12 yılında belirlenen miyoblast progenitör hücreler bazal membran kaynaklı proteinlerin varlığını gerektirir çünkü, kollajen ve Matrigel kombinasyonu ile çalışmayı seçti. Ayrıca, fibrin jel bizim laboratuvarda test ve kollajen ve Matrigel ™ karışımı yapar ve özellikle doku kompaksiyon 14 yol yok gibi C2C12 ve miyoblast progenitör hücreleri desteklemek için değil gibi görünüyor edilmiştir. Bir hücre hattı 15 kullanırken, burada açıklandığı gibi modeli basınç ülseri hasar çalışmalarda zaten kullanılmış. Rejeneratif tıp uygulamalarında, insan uydu hücrelere çeviri son 6,16 yapılmıştır. Buna ek olarak,et tüketimi için alternatif bir kaynak olarak tekniğin büyük bir potansiyele 1'dir. Bize göre Bununla birlikte, mevcut teknoloji tüketim için hem de klinik olarak kullanımı daha da bir sonraki aşamaya ilerlemek için gerekmektedir. Örneğin, farklılaşma yenidoğan sahne etrafında durur ve aynı zamanda güç üretimi bir kas vivo üreten çok daha azdır. Fare, sıçan ve insan kök hücreleri 3D yapıları, izolasyon uygulanan ve olmasına rağmen Ayrıca, özellikle kas kök hücreleri elde çiftlik hayvan farklılaşma ve olgunlaşma henüz 1 o kadar gelişmiş değil. Ayrıca, Matrigel ve hayvansal kaynaklı serum ihtiyacı olan kullanım 1 çıkarılmasına. Rejeneratif ilaç olarak uygulama daha fazla için, doku boyutunun arttırılması gerekir, ve (neo) damarlanma ve oksijen ve besin difüzyon sınırlamaların üstesinden gelmek için perfüzyon biyoreaktör sistemlerinin kullanımını gerektirir. Küçük yapıları h Bazı başlangıç vaskülarizasyon çalışmalarındakiave geçmiş yıllarda 9,17,18 yapılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Yazarlar kültürleme Şekil 2'de sunulmuştur dokular için Yabin Wu teşekkür etmek istiyorum, resmi Bart van Overbeeke tarafından çekildi. Iş mali SenterNovem, hibe ISO 42022 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipets | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm | |
| Pasteur pipet | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
|||
References
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , In revision (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
